Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates (subvention 53 085), la Fondation JR Oishei, et l&#39;American Lung Association (Grant RG-123721-N) à APH, et les NIH (NIDCD) bourse F31DC011218 à CAE.

Une. Préparation cultures bactériennes <ol><li> Stimuler la culture pour une utilisation dans des expériences <ol><li> Dans un bloc de chauffage à 37 ° C, décongeler un stock-flacon congelé de S. pneumoniae et ajouter son contenu à 9 ml de frais, préchauffé bouillon de Todd-Hewitt avec de l&#39;extrait de levure à 0,5% (THY) pour un volume total de 10 ml dans un tube de culture en verre. </li><li> Incuber statiquement à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la culture atteigne la phase semi-log (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6). </li></ol></li></ol> 2. Détection de dépolarisation de la membrane et de rupture <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer un bilan de 50 uM DiBAC 4 (3) dans 100% de DMSO, et à 2 mg / ml actions de PI dans le trou DDH 2 O. Le DiBAC 4 (3) stock est stable à -20 ° C pendant au moins 6 mois. Le PI actions est stable à 4 ° C pendant au moins 6 mois. </li><li> Enveloppez les stocks de papier à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li><li> Chargementbactéries <ol><li> Pellet les cellules bactériennes de l&#39;étape 1.2.2 par centrifugation à 2400 xg pendant 10 min à température ambiante et laver deux fois en éliminant le surnageant, remettre en suspension le culot dans 10 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS), et centrifuger à nouveau à 2400 xg pendant 10 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans du PBS au volume d&#39;origine. Cela fournira environ 10 8 unités par ml de bactéries formant des colonies. Retirer 1 ml (suffisant pour 5 échantillons) des cellules lavées et placer dans un tube à centrifuger. </li><li> Pour ces cellules, ajouter 25 ul d&#39;une solution mère 1 M, stérilisée par filtration de glucose (préparé dans le trou DDH 2 O et filtré à travers un filtre de 0,45 um) pour une concentration finale de 25 mM de glucose, et incuber dans un bloc chauffant à 37 ° C pour quinze minutes. NOTE: Ceci permet d&#39;obtenir l&#39;énergie pour tous les canaux de la membrane dépendant de l&#39;ATP et des composants cellulaires. La nécessité de cette étape peut varier en fonction de l&#39;expérience. </li><li> Ajouter 5 ul de 50 uM DiBAC 4 (3) stock et 10 pi de 2 mg / ml PI actions. Ceci permet d&#39;obtenir pour les concentrations finales de 250 nM et de 20 pg / ml, respectivement. Mélanger soigneusement par aspiration et à plusieurs reprises. Ajouter 200 pi de cette suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;échantillon d&#39;une plaque de 96 puits clair. </li></ol></li><li> Détecter la fluorescence <ol><li> Placer la plaque dans un préchauffé (37 ° C) lecteur de plaques de détection de fluorescence. </li><li> Assurez-vous que les filtres appropriés sont en place pour DiBAC 4 (3) (490 nm excitation, 516 nm émission) et PI (535 nm excitation, 617 nm émission) de détection. </li><li> Pour permettre (et en même temps surveiller) équilibrage des DiBAC 4 (3) sur la membrane, mettre le lecteur à prendre des mesures de fluorescence chaque min environ 30-40 min, ou jusqu&#39;à ce que la lecture se stabilise, ce qui sert de &quot;pré-traitement&quot; lecture. </li><li> Éjecter la plaque et ajouter l&#39;agent expérimental de choix et immediately placer la plaque arrière dans le lecteur de continuer à surveiller DiBAC 4 (3) et PI fluorescence pour la durée souhaitée. Si le traitement de plusieurs échantillons à la fois, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux peut être utile d&#39;ajouter l&#39;agent simultanément à tous les puits. </li><li> Exporter les lectures d&#39;un programme d&#39;analyse de données telles que Microsoft Excel. Terrain fluorescence au cours du temps pour évaluer dépolarisation de la membrane et de la rupture. L&#39;augmentation de la fluorescence de DiBAC et PI indique que la dépolarisation et la rupture se produisent. </li></ol></li></ol> 3. Détection des changements dans intracellulaire de Ca 2 + ou K + concentrations <ol><li> Préparation des réactifs et du tampon de charge <ol><li> Préparer les réactifs suivants: 5 mM du colorant fluorescent sensible aux ions (Fura-2/AM ou PBFI / AM, ajouter la quantité appropriée de DMSO dans un tube contenant 50 pg de colorant), &quot;100x&quot; probénécide (ajouter 1 ml de PBS à un flacon de 77 mg). Le solubiliséles colorants peuvent être congelées à -20 ° C une fois et sont stables en solution pendant 3 mois, alors que la probénécide est stable en solution à -20 ° C pendant 6 mois. </li><li> Préparer 1 ml de 2 x tampon de charge comme suit: Dans le fond d&#39;un tube conique en matière plastique de 15 ml, verser 20 pl de 100x PowerLoad concentré (stable à 2-8 ° C pendant 6 mois), suivie de 2 ul de l&#39;ion de 5 mM sensible colorant directement dans le PowerLoad. Vortex brièvement pour mélanger. Ajouter 960 pi de PBS suivis par 20 pi de 100x probénécide. Vortex le mélange une dernière fois. Envelopper dans du papier d&#39;aluminium pour protéger de la lumière. </li></ol></li><li> Chargement des bactéries avec de la teinture <ol><li> Pellet et laver la culture bactérienne milieu de la phase de journal comme décrit au point 2.2.1. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de PBS pour faire un &quot;2x&quot; suspension cellulaire. </li><li> Ajouter 1 ml de la suspension cellulaire 2x au 2x Loading Buffer. Cela permettra d&#39;avoir un volume final de 2 ml, et concentr finaletions de 1x PowerLoad, 5 uM colorant fluorescent, et 1x probénécide. NOTE: Cette suspension offre un volume suffisant pour 10 échantillons depuis chaque puits d&#39;échantillon pour la mesure contiendra 200 pi. </li><li> Incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 75 min, à l&#39;abri de la lumière. NOTE: Le colorant est chargé dans les cellules bactériennes en l&#39;absence de n&#39;importe quels substrats glycolytiques et en présence de probénécide pour minimiser l&#39;efflux du colorant. </li><li> WASH 1: Pellet les cellules par centrifugation à 2400 g pendant 10 min, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS contenant probénécide 1x. WASH 2, 3: Répétez l&#39;étape 3.2.4 2x. Incuber à 37 ° C pendant encore 30 min. Cela donnera le temps pour les estérases bactériennes pour hydrolyser le groupe ester d&#39;AM à l&#39;écart des colorants fluorescents internalisées. </li><li> WASH 4: sédimenter les cellules par centrifugation à 2400 xg pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS contenant du probénécide 1x. NOTE: Selon le experiment, le glucose peut être rajouté ici pour redynamiser les bactéries. </li></ol></li><li> Détecter la fluorescence <ol><li> Préchauffer la détection de fluorescence lecteur de plaque plaque de lecture à 37 ° C. </li><li> Pour chaque échantillon on le souhaite, ajouter 200 ul de cellules chargées de l&#39;étape (3.2.8) dans les puits d&#39;une plaque à 96 puits. (Effectuez les étapes suivantes pour la fin pour un bien / échantillon à la fois). </li><li> Pour établir une base de lecture pour un bien, place plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence (340 nm d&#39;excitation / 510 nm émission pour &quot;Valeur 1&quot; et 380 nm d&#39;excitation / 510 nm émission pour &quot;Valeur 2&quot;) à toutes les secondes pendant une minute. </li><li> Éjecter la plaque, ajouter le traitement de choix pour que le bien (dans un petit volume d&#39;environ 5 pi), la pipette rapidement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et placer immédiatement de retour dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques à lire toutes les secondes pendant souhaitée longueur de temps. (Si l&#39;eninjecteurs associés au lecteur de plaques sont disponibles, ceux-ci pourraient également être utilisés pour ajouter de façon transparente le traitement désiré, ce qui élimine la nécessité d&#39;arrêter la lecture et éjecter la plaque). </li><li> Exporter les lectures d&#39;un programme d&#39;analyse de données telles que Microsoft Excel. Calculer le rapport des valeurs de fluorescence pour chaque point de temps en divisant la valeur 1 par la valeur 2, et tracer les valeurs de rapport sur un graphique. </li></ol></li></ol> 4. Détecter des changements dans pH intracellulaire <ol><li> Préparation des réactifs et des tampons d&#39;étalonnage <ol><li> Préparer les réactifs suivants: 5 mM de BCECF / AM (. Ajouter la quantité appropriée de DMSO dans un tube contenant 50 pg de colorant Ce stock est stable à -20 ° C pendant 3 mois); 100x probénécide (ajouter 1 ml de PBS à un flacon 77 mg);. 1 mM préparation de nigéricine dans l&#39;éthanol (requis pour équilibrer le pH intracellulaire (pH i) des cellules au pH du tampon entourant Ce stock est stable à -20 ° C pendant 6 mois);. mM de cyanure de carbonyle 3 chlorophénylhydrazone (CCCP) dans le DMSO (protonophore de découpler la force proton motrice 0,5 Ce stock est stable à -20 ° C pendant 6 mois) </li><li> Préparer 10 ml de tampons de potassium élevés suivants: NaOH 135 mM KH 2 PO 4/20 mM (de monobasique), et 110 mM de NaOH K 2 HPO 4/20 mM (de dibasique). Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,45 um. (Ces tampons peuvent être stockés à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation). </li><li> Mélanger les tampons riches en potassium dans les proportions nécessaires pour créer des tampons riches en potassium, avec au moins des valeurs de pH de 5 à 6 allant de 6,5 à 8,0. </li><li> Préparer 1 ml de tampon de charge 2x comme suit: Dans le fond d&#39;un tube conique en matière plastique de 15 ml, verser 40 pl de 100x PowerLoad, suivis par 20 ul de la 5 mM sensible aux ions colorant directement dans le PowerLoad. Vortex brièvement pour mélanger. Ajouter 900 pi de PBS suivis par 40 pi de 100x probénécide. Vortex mélange une dernière fois. Envelopper dans du papier d&#39;aluminium pour protéger de la lumière. </li></ol></li><li> Chargement des bactéries avec de la teinture <ol><li> Pellet et laver les 8 ml de la culture bactérienne milieu de la phase de journal comme décrit au point 2.2.1. Retirer le surnageant, remettre le culot dans 2 ml de PBS pour faire un &quot;4x&quot; suspension cellulaire. </li><li> Ajouter 1 ml de la suspension cellulaire 4x 2x à l&#39;Loading Buffer. Cela permettra d&#39;avoir un volume final de 2 ml, et des concentrations finales de cellules 2x, 2x PowerLoad, 50 uM de colorant fluorescent, et 2x probénécide. </li><li> Incuber dans un bain d&#39;eau à 30 ° pendant 40 minutes, à l&#39;abri de la lumière. NOTE: Le colorant est chargé dans les cellules bactériennes à la température inférieure de 30 ° C et en l&#39;absence de n&#39;importe quels substrats glycolytiques pour réduire au minimum l&#39;efflux du colorant. </li><li> WASH 1: Pellet les cellules par centrifugation à 2400 g pendant 10 min, retirer le surnageant de se débarrasser de l&#39;excès de colorant, et remettre en suspension dans 4 ml de PBS contenant 2x probénécide unemM de glucose e 1 (à redynamiser les bactéries). LAVAGE 2, 3: Répétez l&#39;étape 4.2.7 deux fois, avec remise en suspension finale dans 4 ml de PBS (pour une concentration finale de cellules 1x) 2x contenant du probénécide et 10 mM de glucose. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Cela permettra aux cellules pour exciter complètement et laisser le temps pour les estérases bactériennes pour cliver le groupe ester AM de l&#39;BCECF intériorisé. </li></ol></li><li> Établissant la fluorescence de fond et dans la courbe d&#39;étalonnage vivo <ol><li> Préchauffer la détection de fluorescence lecteur de plaque plaque de lecture à 37 ° C. </li><li> Pour déterminer la fluorescence de fond, stériliser par filtration à environ 500 pi de la suspension bactérienne et chargé sous tension (de l&#39;étape 4.2.7) pour éliminer les bactéries, et ajouter 200 ul de filtrat pour le puits de la plaque à 96 puits. </li><li> Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence (excitation 490 nm / 530 nm pour l&#39;émission&quot;Valeur 1&quot; et 440 nm d&#39;excitation / émission 530 nm pour &quot;Valeur 2&quot;) pendant 1 min. Cette fluorescence d&#39;arrière-plan doit être soustrait avant le calcul des rapports à la fois pour la courbe d&#39;étalonnage et les échantillons expérimentaux. </li><li> Pour obtenir une courbe d&#39;étalonnage in vivo, laver aliquotes de 500 ul des cellules chargées et alimentés à partir de l&#39;étape 4.2.7 fois et remettre en suspension dans les tampons riches en potassium à des pH différents (allant de 6,5 à 8,0). </li><li> Ajouter 20 uM nigéricine pour les échantillons s&#39;équilibrer le pH intracellulaire des cellules au pH du tampon environnant et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 200 ul de tampon combinaisons de bactéries / de pH dans les puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence pendant quelques minutes pour établir une valeur stable pour chaque puits. Exporter les lectures d&#39;un programme d&#39;analyse de données telles que Microsoft Excel. </li><li> Après soustraction de la baLes valeurs de fluorescence de ckground, calculer le rapport des valeurs de fluorescence en divisant la valeur 1 par la valeur 2. Tracer les valeurs de rapport pour chaque tampon de pH pour créer la courbe d&#39;étalonnage. (Une courbe d&#39;étalonnage doit être généré pour chaque nouveau lot de cellules chargées, comme la quantité de colorant fluorescent qui est chargé dans les bactéries peut varier à chaque fois). </li></ol></li><li> Mesurer les changements de pH intracellulaire <ol><li> Pour chaque échantillon désiré, ajouter 200 ul de cellules chargées et sous tension (de l&#39;étape 4.2.7) pour les puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Placer la plaque dans la détection de la fluorescence lecteur de plaques et mesurer la fluorescence des échantillons toutes les 5 sec pendant 5 min. </li><li> Éjecter la plaque et ajouter 10 uM CCCP pour un bien (sert de contrôle positif pour la diminution du pH intracellulaire) et l&#39;agent expérimental (s) d&#39;intérêt pour les autres puits. Pour comparer avec précision leurs effets au fil du temps, ajouter le CCCP et agents de choix dans le même temps en utilisant hpipette ultichannel. </li><li> Remettre immédiatement la plaque à la plaque-lecteur et continuer à mesurer la fluorescence toutes les 5 sec pendant 10 minutes. En tant que contrôle supplémentaire, éjecter la plaque et ajouter 20 uM nigéricine à tous les échantillons s&#39;équilibrer à la i pH de la bactérie pour le pH du tampon environnant, et de lire pendant 5 min. </li><li> Après soustraction des valeurs de fluorescence d&#39;arrière-plan, calculer les rapports de fluorescence pour chaque échantillon. Interpoler le pH i pour chaque lecture à partir de la courbe d&#39;étalonnage. </li></ol></li></ol>

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M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents à déclarer.

Malgré la limitation de cette taille présente de en utilisant des procédés classiques d&#39;électrophysiologie pour détecter les changements de polarité et de l&#39;intégrité de la membrane et des changements dans les concentrations d&#39;ions à l&#39;intérieur des bactéries, nous avons décrit une manière de mesurer ces événements dans S. pneumoniae en utilisant des colorants fluorescents. Nos protocoles sont les premiers de leur genre décrit pour le pneumocoque et l&#39;un des rares décrits p...

Notre laboratoire a identifié un complexe protéine-lipide à partir de lait humain nommé Hamlet (pour Human Alpha-lactalbumine Fait létale pour les cellules tumorales) qui induit l&#39;apoptose dans les cellules tumorales, mais est également capable de tuer une variété d&#39;espèces bactériennes 1,2. Les espèces qui ont été jugées particulièrement sensibles sont ceux qui ciblent les voies respiratoires, avec Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) affichant la plus grande sensibilité et un phénotype de l&#39;apoptose comme la mort de 2,3. Événements de transport dépolarisation de la membrane et d&#39;ions spécifique sont bien décrits et événements cruciaux lors de l&#39;apoptose dans des cellules eucaryotes, en particulier dans les mitochondries, où TPP + ions et des colorants fluorescents, dont le JC-1 et TMRE radioactives ont été utilisées pour démontrer la dépolarisation de la membrane mitochondriale 3 -5. Ainsi, nous avons cherché à en savoir plus sur l&#39;effet de HAMLET sur ces fonctionnalités liées à la membrane dans le pneumocoque que nous avons concentré nos efforts pourdévelopper une meilleure compréhension des composants mécaniques du phénotype de l&#39;apoptose comme les bactéries, avec un grand potentiel pour l&#39;identification de nouveaux traitements antibactériens ou candidats vaccins dans le processus. En cherchant à établir des protocoles pour nos études mécanistes, nous avons découvert que, contrairement à la méthodologie bien décrite dans les systèmes eucaryotes, il existe très peu d&#39;études publiées en détail les mécanismes de la membrane bactérienne de 6,7 électrophysiologie et de transport d&#39;ions. Ceci est principalement attribuable à la petite taille des micro-organismes et leur architecture de surface, en particulier la présence de la paroi cellulaire, qui limite l&#39;accessibilité de la membrane pour l&#39;utilisation de méthodes eucaryotes classiques comme patch clamp, bien que certaines études utilisant des protoplastes géants ont été effectués avec un succès mitigé 8,9. Comme le travail avec ces protoplastes géants n&#39;est pas une méthode idéale ou même pratique pour la plupart des espèces bactériennes car il exige de l&#39;hommebactéries ipulated dans un état ​​anormal et abiotique, les études limitées de polarité de la membrane bactérienne qui ont été réalisées ont principalement utilisé la cytométrie en flux et l&#39;utilisation de cyanine et oxonol fluorescentes 10-16. Au lieu de la cytométrie en flux, qui rassemble les lectures de fluorescence individuels d&#39;une bactérie à un point de temps unique, nous avons choisi d&#39;utiliser un lecteur de plaques de détection de fluorescence pour détecter l&#39;intensité de fluorescence des suspensions de bactéries dans un format de plaque de 96 puits au cours du temps. Cela nous a permis de traiter une population de bactéries à différents points dans le temps avec beaucoup plus de simplicité et de facilité, de contrôler la cinétique de fluorescence de l&#39;ensemble de la population pour de longues périodes de temps, ce qui est difficile à réaliser en utilisant la cytométrie de flux. Après avoir testé une grande variété de colorants fluorescents sensibles au potentiel (y compris ceux mentionnés ci-dessus pour une utilisation avec les mitochondries), nous avons obtenu les meilleurs succès technique et pratique à l&#39;aide de l&#39;colorant bis-oxonol appelé DiBAC 4 (3) (bis-(acide 1,3-dibutylbarbituric) triméthine oxonol) de surveiller les changements de polarité. Nous avons aussi trouvé utile de surveiller simultanément les perturbations dans l&#39;intégrité de la membrane en utilisant l&#39;iodure de propidium (PI). Ce colorant fluorescent lors de la liaison à l&#39;acide nucléique, mais n&#39;est en mesure de le faire lorsque l&#39;intégrité de la membrane bactérienne est compromise, ce qui en fait la composante populaire utilisé pour détecter les cellules mortes dans des essais vivants morts coloration. En plus de PI, SYTOX vert et TO-PRO-1 sont des colorants fluorescents qui sont similaires dans l&#39;action et ont déjà été utilisés pour les bactéries dans quelques études utilisant la cytométrie de flux des méthodes de détection 17. Nous avons choisi d&#39;utiliser PI en raison de sa longueur d&#39;onde d&#39;excitation qui nous a permis de suivre sa fluorescence en même temps que DiBAC dans un échantillon donné. Dans nos études, nous avons observé que HAMLET, ainsi qu&#39;un autre complexe de protéines-lipides est associée avec une activité bactéricideconnue sous le nom ELOA, induite par la dépolarisation et la rupture de la membrane bactérienne comme indiqué par l&#39;augmentation de la fluorescence des deux colorants lors d&#39;un traitement de la pneumocoques 3,18,26. Pour les deux complexes, nous avons observé que l&#39;intensité de fluorescence de DiBAC 4 (3) a augmenté avant l&#39;augmentation de l&#39;intensité de PI, ce qui indique que la dépolarisation est survenu avant la rupture et est, par conséquent, un événement spécifique induite par les complexes bactéricides protéine-lipide d&#39; intérêt. Cette distinction est importante à faire, comme la rupture de la membrane peut se faire dépolarisation non spécifique. Cinétique mesurer et d&#39;analyser à la fois DiBAC 4 (3) et PI fluorescence simultanément nous a permis d&#39;examiner cette relation entre les deux événements de la membrane, ce qui est un avantage supplémentaire de l&#39;utilisation de la fluorimétrie à la place de la cytométrie de flux. Pour contrôler le flux d&#39;ions bactérienne, il ya eu un certain succès avec l&#39;utilisation de radio-isotopes précédente, y compris la mesure de l&#39;absorption de45 Ca 2 + dans le pneumocoque 19,20, que nous avons également utilisé dans nos études récentes 18, 21. Cependant, travailler avec ces ions radioactifs présente plusieurs inconvénients. Ils peuvent être coûteux, fastidieux et salissant, et peut également exposer la personne effectuant l&#39;expérience de nuire, en fonction de l&#39;isotope d&#39;intérêt. En outre, il est difficile de surveiller des changements rapides dans le temps. Ainsi, nous nous sommes tournés vers une méthode de mesure alternative qui emploie versions acétoxyméthylique (AM) d&#39;esters de l&#39;indicateur fluorescent colorants sensibles aux ions. Par lui-même, le colorant indicateur est chargé et ne passe pas facilement à travers la membrane, mais avec l&#39;addition du groupe ester lipophile, la molécule non chargée peut maintenant passer à travers la membrane de la bactérie. En entrant dans l&#39;habitacle, les estérases bactériennes cliver le groupe ester, en laissant libre le colorant à l&#39;intérieur de la cellule et à nouveau chargé, ce qui ralentit considérablement sa capacité à sortir de la cellule et en permettant au colorant to s&#39;accumuler à l&#39;intérieur au fil du temps. Cependant, l&#39;utilisation de ces colorants ester n&#39;a été décrite que dans quelques espèces bactériennes à détecter les changements dans intracellulaire de Ca 2 + et H + 22-24 16, avec diverses méthodes de chargement, de détection et de succès. Avec le désir de suivre l&#39;évolution de Ca 2 + intracellulaire et aussi les niveaux K + et H + dans S. pneumoniae lors du traitement avec Hamlet et d&#39;autres composés, nous avons créé avec succès des protocoles pour charger efficacement colorants indicateurs fluorescents dans des cellules bactériennes. Chargement efficace dans des bactéries nécessaires à la fois probénécide qui augmente la rétention de colorant en bloquant d&#39;anions transporteurs et PowerLoad, un composé exclusif de Life Technologies qui augmente l&#39;efficacité de chargement. Fura-2/AM (détection Ca 2 +), PBFI / AM (détection K +), et BCECF / AM (détection H +) ont été chargés avec succès à la fois non encapsulé et encapsulé pneumocoque stpluies permettant la mesure des motifs de fluorescence résultant après l&#39;addition d&#39;ionophores, tels que l&#39;ionomycine (Ca 2 + découpleur), la valinomycine (K + découpleur) et CCCP (H + découpleur) en utilisant un lecteur de plaques de détection de fluorescence 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Membrane dépolarisation et les flux ioniques sont des événements qui ont été largement étudiés dans des systèmes biologiques en raison de leur capacité à influer profondément fonctions cellulaires, y compris l&#39;énergétique et des transductions de signaux. Bien que les deux méthodes fluorescentes et électrophysiologiques, y compris l&#39;utilisation de l&#39;électrode et patch-clamp, ont été bien développés pour mesurer ces événements dans les cellules eucaryotes, la méthodologie de mesure des événements similaires dans des micro-organismes ont prouvé plus difficile à développer en raison de leur petite taille en combinaison avec la plus complexe surface externe de la membrane des bactéries de blindage. Au cours de nos études de mort initiation à Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), nous voulions élucider le rôle des événements de la membrane, y compris les changements de polarité, l&#39;intégrité et la concentration des ions intracellulaires. Recherche de la littérature, nous avons constaté que très peu d&#39;études existent. D&#39;autres chercheurs ont suivi l&#39;absorption de radio-isotopes ou d&#39;équilibre pour mesurer la grippe ionxes et potentiel de membrane et un nombre limité d&#39;études, principalement dans des organismes Gram-négatifs, avaient connu un certain succès en utilisant carbocyanine ou oxonol colorants fluorescents pour mesurer le potentiel de membrane, ou le chargement des bactéries avec acétoxyméthylique cellulaire infiltrant (AM) versions d&#39;ester de sensible aux ions colorants indicateurs fluorescents. Nous avons donc créé et optimisé les protocoles de mesure du potentiel de membrane, la rupture, et d&#39;ions de transport dans l&#39;organisme Gram-positif S. pneumoniae. Nous avons développé des protocoles utilisant le bis-oxonol colorant DiBAC 4 (3) et le colorant iodure de propidium cellulaire-imperméant pour mesurer dépolarisation de la membrane et de la rupture, respectivement, ainsi que des méthodes pour charger de manière optimale le pneumocoque avec les esters AM des colorants ratiométriques Fura-2, PBFI, BCECF et à détecter des changements dans les concentrations intracellulaires de Ca2 +, K + et H +, respectivement, en utilisant un lecteur de plaque par fluorescence détection. Ces protocoles sont les premiers de leur genre pour le pneumocoqueet la majorité de ces colorants n&#39;ont pas été utilisés dans d&#39;autres espèces bactériennes. Bien que nos protocoles ont été optimisés pour S. pneumoniae, nous croyons que ces approches devraient constituer un excellent point de départ pour des études similaires dans d&#39;autres espèces bactériennes.

Pour toutes les expériences, il existe une série d&#39;échantillons et les conditions présentes dans chaque puits. Ainsi, chaque tracé représente l&#39;intensité de fluorescence d&#39;une population entière de bactéries au cours du temps. Les résultats devraient être faciles à interpréter, avec une distinction claire entre la fluorescence des échantillons traités et que des témoins non traités. La cinétique et le degré de changement observé dans fluorescence pourraient fournir des informatio...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d&#39;études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d&#39;ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K vues.  University at Buffalo, State University of New York.  Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniq...

Vidéo: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Recherche

Immunologie et infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulaire sérotypage des<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation de la réaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsulaire sérotypage<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Par agglutination au latex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...