이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.

1. 세균 배양을 준비 <ol><li> 실험에 사용하기 위해 문화를 성장 <ol><li> 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진. </li><li> 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어. </li></ol></li></ol> 2. 막 탈분극과 파열을 검출 <ol><li> 준비 시약 <ol><li> DiBAC 4의 50 μm의 주식 (3) 100 % DMSO에서, 그리고 DDH 2 O.에서 PI의 2 ㎎ / ㎖ 재고를 준비 DiBAC 4 (3) 주식은 6 개월 이상 -20 ° C에서 안정적이다. PI의 주식은 6 개월 이상 4 ° C에서 안정적이다. </li><li> 빛으로부터 보호하기 위해 호일 주식을 감싸십시오. </li></ol></li><li> 로딩박테리아 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 2,400 XG에서 원심 분리 단계 1.2.2에서 박테리아 세포 펠렛 및 2400 XG에서 다시 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 및 원심 분리기 10ml에 펠렛을 재현 탁, 상청액을 제거하여 두 번 씻어 10 분. </li><li> 원래 볼륨에 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 밀리리터 당 세균의 약 10 8 집락 형성 단위에 제공 할 것입니다. 세척 세포 (5 샘플에 대한 충분한) 1 ㎖를 제거하고 microcentrifuge 관에 배치합니다. </li><li> 이 세포에 25 mM의 포도당의 최종 농도 포도당의 1 M 필터 살균 원액 (DDH 2 O에서 제조 및 0.45 μm의 필터를 통해 여과)의 25 μl를 추가하고 37 ° C 가열 블록에 품어 십오 분. 참고 :이 모든 ATP 의존 막 채널과 세포 성분을위한 에너지를 제공합니다. 이 단계에 대한 필요성은 실험에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 50 μM DiBAC 4 (3) 주식의 5 μL 및 2 ㎎ / ㎖ PI 주식의 10 μl를 추가합니다. 이 각각 250 nM의 최종 농도 20 ㎍ / ㎖를 제공한다. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래 철저하게 섞는다. 분명 96 - 웰 플레이트의 각 샘플 아니라이 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 형광 검출 <ol><li> 예비 가온 (37 ℃) 형광 검출 플레이트 리더의 장소 접시. </li><li> 적절한 필터 DiBAC 4 (3) (490 nm의 여기, 516 nm의 방출)와 PI (535 nm의 여기, 617 nm의 방출) 검출 위치에 있는지 확인합니다. </li><li> 독서가 안정 될 때까지 (3) 막에 약 30 ~ 40 분 동안 모든 분 형광 측정을 수행 할 수있는 리더를 설정하거나 DiBAC 4의 평형을 (그리고 동시에 모니터링)을 허용하기 위해,이는 &quot;전처리&quot;독서 역할을합니다. </li><li> 접시를 꺼내 선택의 실험 에이전트를 추가하고 IMMEDiately DiBAC 4 원하는 시간에 대한 (3) 및 PI 형광 모니터링을 계속 독자에 다시 접시를 놓습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하는 것은 모든 우물에 동시에 에이전트를 추가하는 것이 도움이 될 수 있다면. </li><li> Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 막 탈분극과 파열을 평가하는 시간에 플롯 형광. DiBAC와 PI의 증가 형광 탈분극과 파열이 발생하고 있음을 나타냅니다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 내 칼슘 2 + 또는 K + 농도의 변화를 감지 <ol><li> 준비 시약 및 로딩 버퍼 <ol><li> 다음과 같은 시약을 준비 이온에 민감한 형광 염료의 5 mM의 재고 (fura-2/AM을 또는 PBFI / AM는, 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가), &quot;100 배는&quot;프로 베네 시드 (추가 1 77 mg을 유리 병에 PBS의 ML). 가용화염료는 -20 ° C 한 번에 냉동과 프로 베네 시드 6 개월 -20 ° C에서 용액에 안정되어있는 반면, 3 개월, 솔루션에 안정 될 수있다. </li><li> 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에, 5 mM의 이온 2 μL 다음 (6 개월 2-8 ° C에서 안정적) 100X PowerLoad 농축의 20 μl를, 분배 직접 PowerLoad에 민감한 염료. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드 20 ㎕ 다음 PBS 960 μl를 추가합니다. 혼합 한 마지막 시간을 소용돌이. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸. </li></ol></li><li> 염료와 박테리아를로드 <ol><li> 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 박테리아 문화를 씻는다. &quot;2 배&quot;세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 5ml에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 배 로딩 버퍼에 2 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 최종 concentr을 제공합니다1X PowerLoad, 5 μm의 형광 염료 및 1X의 프로 베네 시드의 관리 포인트. 참고 : 측정을 위해 각 샘플도 200 μl를 포함하는 것이기 때문에이 정지 10 샘플에 대한 충분한 음량을 제공합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 75 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 주 : 염료가 임의의 당분 해 기판 ​​부재와 염료의 유출을 최소화하는 프로 베네 시드의 존재 하에서 박테리아 세포에로드된다. </li><li> WASH 1 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고, 2 ㎖의 PBS에 재현 탁은 1X 프로 베네 시드를 포함. WASH 2, 3 단계를 반복 3.2.4 배. 또 다른 30 ​​분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이 세균 에스 테라 제 시간 거리에 내면화 형광 염료의 AM 에스테르 그룹을 가수 분해 할 수 있습니다. </li><li> WASH 4 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고에 resuspend 1X 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 2 ㎖에. 참고 : experime에 따라NT, 포도당은 다시 활력을 불어 박테리아에 여기에 다시 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 형광 검출 <ol><li> 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm </li><li> 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 3.2.8에서)로드 셀 200 μl를 추가합니다. (한 번에 하나의 잘 / 샘플 완료 다음 단계를 수행). </li><li> 의 ( &quot;값 1&quot;과 &quot;값 2&quot;에 대한 380 nm의 여기 / 510 nm의 방출을 위해 340 nm의 여기 / 510 nm의 방출) 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더에 잘 장소 접시 독서 기준을 설정하려면 1 분간 모든 초. </li><li> 접시를 꺼냅니다 (약 5 μL의 작은 볼륨)이 아니라에 선택의 처리를 추가, 신속하게 피펫 몇 번 아래로 혼합하고, 즉시 원하는마다 초를 읽을 형광 검출 플레이트 리더에 다시 배치 시간의 길이. (만약에플레이트 리더와 관련된 젝터)이도 완벽하게 읽기를 중지하고 판을 배출 할 필요없이, 원하는 치료를 추가하는 데 사용할 수있는, 사용할 수 있습니다. </li><li> Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 값이 값 1로 분할하여 각각의 시간 지점에 대한 형광 값의 비율을 계산하고, 그래프의 비율 값을 플롯. </li></ol></li></ol> 4. 세포 내 pH의 변화 감지 <ol><li> 준비 시약 및 교정 버퍼 <ol><li> 다음과 같은 시약을 준비 BCECF / AM의 5 mM의 주식은 (. 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가이 재고 3 개월 -20 ° C에서 안정), 100 배 프로 베네 시드 (1 ㎖의 추가 PBS 77 mg을 유리 병에). 에탄올 nigericin의 1 ㎜ 주식 준비는 주변 버퍼의 pH의 세포 (세포의 pH (산도 나는 평형 필수)이 주식들입니다6 개월 -20 ° C)에서 테이블;. DMSO (양성자 동기가되는 힘을 풀다하는 protonophore 카보 닐 시안화 3 chlorophenylhydrazone (CCCP)의 0.5 mM의 주식이 주식은 6 개월 -20 ° C에서 안정) </li><li> 135 밀리 KH 2 PO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (염기), 110 mM의 K 2 HPO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (이염) : 다음과 같은 높은 칼륨 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. 필터는 0.45 μm의 필터를 사용하여 멸균. (이 버퍼를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.) </li><li> 6.5-8.0까지 적어도 5-6 pH 값과 높은 칼륨 버퍼를 생성하기 위해 필요한 비율에 높은 칼륨 버퍼를 섞는다. </li><li> 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에 직접 PowerLoad에 5 mM의 이온 성 염료 20 ㎕ 다음에 100 배 PowerLoad의 40 μl를, 분배. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드의 40 μL 다음 PBS 900 μl를 추가합니다. Vort예 혼합 한 마지막 시간. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸. </li></ol></li><li> 염료와 박테리아를로드 <ol><li> 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 세균성 문화의 8 ㎖를 씻어. &quot;배&quot;세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 2 ml의 상층 액에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 배 로딩 버퍼에 4 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 배 세포의 최종 농도 2 배 PowerLoad, 50 μM 형광 염료 및 배 프로 베네 시드에 제공 할 것입니다. </li><li> 빛으로부터 보호 40 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 품어. NOTE : 염료가 30 ° C의 낮은 온도에서 염료의 유출을 최소화 할 수있는 당분 해 기판의 부재하에 세균 세포에로드된다. </li><li> WASH 1 : 펠렛 10 분 2,400 XG에 원심 분리하여 세포가 과잉 색소를 제거하는 상층 액을 제거하고, 4 ㎖의 PBS에 재현 탁 2 배 프로 베네 시드의를 포함차 1 mM의 포도당 (박테리아를 재 활성화하기 위해). WASH 2, 3 배 프로 베네 시드와 10 mM의 포도당을 함유하는 (1X 세포의 최종 농도) 4 ㎖의 PBS의 최종 재 부상과 두 단계를 반복합니다 4.2.7. </li><li> 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이것은 세포가 완전히 재충전 멀리 내재화 BCECF에서 AM 에스테르기를 절단하는 세균 에스 테라위한 시간을 허용하는 것을 허용 할 것이다. </li></ol></li><li> 배경 형광을 수립하고 생체 내 보정 곡선 <ol><li> 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm </li><li> 배경 형광을 확인하려면, 박테리아를 제거한다 (단계 4.2.7에서)로드 및 통전 세균 현탁액 500 μl를 필터 소독, 및 96 - 웰 플레이트의 웰에 여과 액을 200 μl를 추가합니다. </li><li> (490 nm의 여기 / 530 nm의 방출 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더의 판을 놓습니다&quot;값 1&quot;1 분 &quot;값 2&quot;)에 대한 440 nm의 여기 / 530 nm의 방출. 이 배경 형광이 검량선 및 실험 샘플 모두에 대한 비율을 계산하기 전에 감산한​​다. </li><li> 생체 내 보정 곡선을 얻으려면 (6.5-8.0까지) 다른 pH 값에서 높은 칼륨 버퍼에서 한 번에 resuspend 단계 4.2.7에서로드 및 통전 세포를 500 ㎕의 분취 액을 씻어. </li><li> 주변의 버퍼의 pH에​​ 세포의 세포 내 pH가 평형을 5 분 동안 37 ° C에서 배양 샘플에 20 μM의 nigericin를 추가합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 세균 / pH 완충 조합의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 대한 꾸준한 독서를 확립하기 위해 몇 분 동안 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓습니다. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. </li><li> 학사 학위를 뺀 후ckground 형광 값,이 값에 의해 값 1을 분할하여 형광 값의 비율을 계산한다. 검량선을 작성하기 위해 각각의 pH 완충액에 대한 비율 값을 플롯. (박테리아에로드되는 형광 염료의 양마다 다를 수 검량선은,로드 셀의 각 새로운 배치에 대해 생성되어야한다.) </li></ol></li><li> 세포 내 pH의 변화 측정 <ol><li> 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 4.2.7에서)로드와 활력 세포를 200 μl를 추가합니다. </li><li> 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓고 5 분 동안 매 5 초마다 샘플의 형광을 측정합니다. </li><li> 접시를 꺼내서 잘 하나 (세포 내 산도를 감소시키는 긍정적 인 제어 역할을) 다른 우물에 관심있는 실험 에이전트 (들)에 10 μM의 CCCP를 추가합니다. 정확하게, 시간이 지남에 따라 자신의 효과를 비교 오전를 사용하여 동시에 CCCP 선택의 에이전트를 추가하려면ultichannel 피펫. </li><li> 즉시 플레이트 리더로 ​​판을 반환하고 형광 10 분 동안 매 5 초마다 측정을 계속합니다. 추가 컨트롤과 같은 접시를 꺼내 주변의 버퍼의 pH에 박테리아의 pH 나는 평형을 모든 샘플에 20 μM Nigericin을 추가하고 5 분 동안 읽습니다. </li><li> 배경 형광 값을 뺀 후, 각 샘플에 대한 형광의 비율을 계산합니다. 검정 곡선의 각 읽기의 pH 나 보간. </li></ol></li></ol>

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S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

저자는 선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 ?...

우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다. 우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 10-16. 하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 - 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC 4라는 비스 - 옥소 놀 염료 (3) (비스 - (1,3 - dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 17 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다. 우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 - 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC (4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 - 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC 4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다. 세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 (18), (21)에 사용한 폐렴 구균 19, 20, 2 +. 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 2 + 22 ~ 24과 H + 16의 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다. 세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 2 +와 S.에도 K +와 H + 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K +을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca 2 +을 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 +를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 18, 21을 사용하여 (K + uncoupler)와 CCCP (H + uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 2 + uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.

모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K 조회수.  University at Buffalo, State University of New York.  진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; Quellung 반응을 이용하여

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 라텍스 응집에 의해

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...