ويدعم البحوث في المختبر P. Cossart من قبل معهد باستور، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث MEDICALE، والمعهد الوطني للبحوث الزراعية لا، ERC المتقدم المنحة (233348)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (المنحة النثريات- SignRupVac)، ومؤسسة لويس Jeantet ومؤسسة روش لو ليه Mousquetaires. AK هو حاصل على منحة دراسية من جامعة باستور باريس الدولي الدكتوراه البرنامج / معهد كارنو علل Infectieuses. نشكر جيسون ميرسر لتحسين بروتوكول ترنسفكأيشن الخلوية.

1. الثقافات إعداد الخلوية والبكتيرية، أدوات ترنسفكأيشن والأجسام المضادة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة آغار جديدة لعزل الفرد L. المستوحدة المستعمرات من الأسهم الجلسرين البكتيرية (50٪ glycerol/50٪ المشبعة البكتيرية الثقافة بين عشية وضحاها السائل) يحتفظ بها في -80 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الألومنيوم رف (الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية) لنقل الأسهم المجمدة الجلسرين البكتيرية، والبكتيريا متتالية على القلب ضخ الدماغ (بهي) لوحة أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال 48 ساعة (أو حتى المستعمرات البكتيرية الفردية يمكن أن تكون معزولة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على هذا العمل بعد ذلك لوحة في 4 درجات مئوية خلال فترة أقصاها شهر 1 (سيتم استخدامه على البذور الثقافات السائل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بروتوكول لدينا، ونحن نستخدم L. المستوحدة المصلي 1/2â EGDe.PrfA * السلالة، ولكن كما هو موضح في الشكل 1، وL. المستوحدة المصلي 4B P14.PrfA * سلالة يعطي نتائج مماثلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هوتزرع الخلايا CCL2 لا ATCC في Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في غياب المضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمامات مستقلة عن تدافعت (السيطرة) ويتم تحميل مكافحة الأرصاد الرناوات siRNAs باللون الأسود 384 جيدا لوحات زراعة الخلايا المجهري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 160 بمول من سيرنا في 500 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه وإضافة 5 ميكرولتر من هذا الحل لكل بئر (تركيز النهائي: 1.6 بمول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء هذه اللوحة في -20 درجة مئوية لمدة أقصاها سنة 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل ضد البروتين البكتيري InlC قد تم الحصول عليها عن طريق التحصين باستخدام البروتين المؤتلف InlC-GST كما هو موضح سابقا 25. </li></ol> 2. عكس سيرنا ترنسفكأيشن الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ساعة قبل الإصابة تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة السوداء 384 جيدا لوحة الثقافة التي تحتوي على الخلايا المجهري 1.6 بمول سيرنا في 5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 3 دقائق في 300إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة لاسقاط سيرنا التي كان يمكن المودعة في جدران الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد درجة حرارة الغرفة DMEM تستكمل مع 0.4٪ Lipofectamine RNAiMAX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر من ترنسفكأيشن المتوسطة DMEM / RNAiMAX إلى كل بئر (لا احتضان المتوسطة ترنسفكأيشن أطول من 20 دقيقة قبل إضافته إلى سيرنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة ذهابا وإيابا لمزج سيرنا مع الحل ترنسفكأيشن، ثم الحفاظ على لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجمعات سيرنا Lipofectamine لتشكيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا هيلا من قارورة-متموجة أو خلية ثقافة فرعية متكدسة مرة واحدة مع 10 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل خلايا هيلا بإضافة 1 مل 37 درجة مئوية prewarmed التربسين إلى قارورة زراعة الخلايا واحتضان لمدة 3 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في 10 مل 37 درجة مئوية prewarmed DMEM تستكمل مع FBS 16٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا وإعداد تعليق خلية من خلايا 12،000 لكل مل في DMEM تستكمل مع16٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر في لوحة 384 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة بسرعة ذهابا وإيابا لتوزيع الخلايا والسماح خلايا يستقر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع parafilm والحفاظ عليه لمدة 72 ساعة في ترطيب 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 3. العدوى الخلوية وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من العدوى، واتخاذ مستعمرة واحدة من L. المستوحدة من لوحة بهي أجار و resuspend في 5 مل من السائل بهي المتوسطة في أنبوب البوليسترين 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جهاز التسكع للسماح لنمو البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم من العدوى، وغسل 1 مل من L. بين عشية وضحاها المستوحدة الثقافة بواسطة الطرد المركزي 2 دقيقة في إطار التعاون الإقليمي على 10،600 جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف (الذي يحتوي على ذيفان خلوي يفرز listeriolysin O) وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (repeaر الخطوة الغسيل 3 مرات أكثر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الكثافة الضوئية البكتيرية في 600 نانومتر وتقدير عدد البكتيريا (OD = 1 ما يعادل 1E9 البكتيريا / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد L. كافية المستوحدة التخفيف في DMEM تستكمل مع 1٪ FBS: باستخدام سلالات الغازية للغاية مثل EGDe.PrfA *، نقترح استخدام البكتيريا 5E4 في 30 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر (ويقدر تعدد العدوى إلى 25 ل 2،000 الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت خلية في كل بئر (80 ميكرولتر) واستبداله بإضافة 30 ميكرولتر من L. المستوحدة المحتوية على المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في إطار التعاون الإقليمي 200 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لمزامنة عملية العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في ترطيب 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في كتلة الألومنيوم prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة L. المستوحدة التي تحتوي على المتوسطة من كل بئر وإضافة 30 ميكرولتر من DMEM prewarmed تستكمل مع FBS 10٪ و40 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل خارج الخلية L. المستوحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 4 ساعات في 5٪ CO 2 التي تحتوي على الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية على كتلة معدنية prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول PBS تستكمل مع 8٪ الفورمالديهايد (ينبغي إعداد هذا الحل الطازجة بحيث مونومرات الفورمالديهايد، بدلا من البوليمرات امتصاص العرق، وتستخدم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون التخلص من مستنبت الخلايا، إضافة 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 8٪ الفورمالديهايد (تركيز النهائي: 4٪)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (إبقاء الخلايا في الحجم النهائي من 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1:250 التخفيف من أرنب المضادة للInlC مصل في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.2٪ سابونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر بعد إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الابتدائيحل الأجسام المضادة وغسل أربع مرات مع 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثانوية اليكسا فلور 546 الضد يقترن-المضادة للأرنب (1:250)، والحل دابي (1:1،500) وphalloidin-Dy647 (1:150) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.2٪ سابونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من هذا الحل تلطيخ الثانوية إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل تلطيخ الثانوية وغسل أربع مرات مع 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر (ترك الحجم النهائي من 40 ميكرولتر في كل بئر وختم لوحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة يمكن تصويرها على الفور أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء (مع تغطية احباط الألومنيوم) لتحليلها لاحقا. </li></ol> 4. الحصول على الصور والتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور في ثلاث قنوات مختلفة (350 نانومتر، 546 نانومتر و 647 نانومتر) باستخدام الهدف 10X شنت على المجهر الآلي (اكتساب تفضيلي 9 صور لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن قياس إشارة InlC باستخدام صورةبرامج التحليل مثل CellProfiler التي تسمح تجزئة الآلي من النوى وأجسام الخلايا باستخدام دابي وتلطيخ phalloidin، على التوالي. </li></ol>

<ol>
	<li>Pizarro-Cerd&#225;, J., K&#252;hbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells:+an+updated+view.">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li><li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resistance+to+infection.">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li><li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments+and+the+growth,+movement,+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite,+Listeria+monocytogenes.">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li><li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes:+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin.">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li><li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin,+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci.">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li><li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated.">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li><li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product,+a+surface+protein.">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li><li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Listeria+species.">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape:+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes.">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li><li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin,+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells.">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li><li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase.">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li><li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake.">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li><li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion.">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li><li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase.">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Jonqui&#232;res, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes.">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells.">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li><li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins.">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li><li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection.">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Ripio, M. T., Dom&#237;nguez-Bernal, G., Lara, M., Su&#225;rez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes.">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li><li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria.">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li><li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I&#954;B+kinase+subinit+IKK&#945;.">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the I&#954;B kinase subinit IKK&#945;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens:+the+Listeria+monocytogenes+system.">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li><li>Snijder, B., Sacher, R., R&#228;m&#246;, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection.">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

العديد من المعلمات حاسمة لنجاح لدينا بروتوكول InlC الكشف، بما في ذلك استخدام خطوط الخلايا السليمة عرض على السيتوبلازم كبيرة بما فيه الكفاية للسماح الكشف لا لبس فيه للإشارة InlC. في مقايسة نقدم في هذه المقالة نقترح استخدام خلايا هيلا CCL2، والتي هي مناسبة بشكل خاص لفحص لدي?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

البكتيريا موجبة الجرام المستوحدة الليستيريا هو الممرض المنقولة عن طريق الأغذية التي تغزو الخلايا المضيفة، يعطل فجوة الداخلي ويتكاثر في سيتوبلازم الخلايا المضيفة 1. L. المستوحدة سهولة التلاعب في سياق مختبر (النمو السريع، وسمية منخفضة بالنسبة للأفراد الأصحاء) المرتبطة استمرار الصفات الفوعة البكتيرية التي لوحظت في النماذج الخلوية والحيوانية (النشاط الانحلالي، زيادة عدد الكريات البيضاء) يسمح استخدام الأولي في 1960s كنموذج رئيسي ل دراسة التطفل داخل الخلايا ولإنشاء الأسس النظرية من المناعة الخلوية ضد العدوى 2. في أواخر 1980s وأوائل 1990s، وتشريح الخلايا البكتيرية دورة 3 وكذلك التوصيف الجزيئي للبكتيريا الفوعة أهم عوامل 4-7 يفضل استخدام L. المستوحدة كأداة جزيئية أساسية للتلاعب وعشيقذ من وظائف الخلية المضيفة. وجود الفوعة (L. innocua) وخبيثة (المستوحدة L.) الأنواع في جنس الليستيريا مهدت الطريق لدراسات الجينوم المقارن 8 التي، جنبا إلى جنب مع إنشاء الأخيرة لL. كاملة المستوحدة Transcriptome على 9، زادت فهمنا للتطور L. المستوحدة كما الممرض الإنسان وكنظام نموذج للعدوى يدرس 10. المستوحدة L. يدفع تدخيل حيز الخلايا المضيفة على تفاعل البروتينات السطحية البكتيرية InlA وInlB مع مستقبلات الخلايا المضيفة E-كادهيرين والتقى على التوالي 11-12. أدت الدراسات القائمة على المرشح الأولي لتحديد الرابط catenins-الأكتين α / β باعتبارها عنصرا هاما من مسار InlA الغزو و13 من فسفوإينوزيتيد 3 كيناز (PI 3-K) باعتباره المستجيب تنتقد InlB- تعتمد الغزو كاسكادي 14-15. يسمح فحوصات البروتين ومقرها ظيفية في وقت لاحق تحديد عناصر هيكل الخلية رواية 16 ورسله الثانية من المادة الدهنية 17 المطلوبة لغزو الخلية المضيفة. وتسلط الدراسات النسخي 18 و المستندة إلى مطياف الكتلة الكمي البروتيوميات 19 مؤخرا ضوءا جديدا بشأن تفعيل المضيف يشير شلالات وقمع الاستجابات المناعية خلال L. المستوحدة العدوى. نهج بيولوجيا النظم القائمة على تعطيل مجموعات كبيرة من الجينات (kinomes، الجينوم الكامل) عن طريق الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) إسكات قد فتحت مؤخرا آفاقا جديدة لتحليل المضيف العالمية يشير شلالات في سياق الوظائف الخلوية محددة، بما في ذلك البلعمة و الممرض استيعاب 20. شاشات سيرنا على نطاق الجينوم وقد أجريت سابقا للتحقيق شلالات الخلوية اللازمة لإصابة L. المستوحدة في أكلة ذبابة الفاكهة </eم&gt; خلايا S2 21-22، ولكن لم يتم تنفيذ هذا النوع من التحليل في الخلايا غير البلعمية، والتي تمثل أهدافا حاسمة للعدوى في الجسم الحي. لدينا بروتوكول الأمثل للكشف المجهري من المراحل المتأخرة من العدوى عن طريق L. المستوحدة التي تناسب دراسات الإنتاجية العالية سيرنا من دخول البكتيريا داخل الخلايا الظهارية. لدينا فحص يستفيد من L. الغازية للغاية المستوحدة السلالة التي يمثل طفرة نقطة في PrfA، المنظم الرئيسي للالنسخي L. المستوحدة عوامل الفوعة 6: هذه الطفرة (اسمه PrfA *) يجعل PrfA نشطة جوهري 23 ويؤدي إلى زيادة تعبير من البروتينات الغزو InlA وInlB، وبالتالي تفضيل دخول البكتيريا في الخلايا غير المصابة إلا أكلة سيئة. ويستند لدينا قراءات للعدوى على الكشف عن تراكم عصاري خلوي من البروتين يفرز البكتيرية InlC: هذا هو جزيءوالمستجيب عديد المظاهر التي يعبر عنها بشكل تفضيلي من قبل داخل هيولي L. المستوحدة 9 والتي تشارك ليس فقط في الخلية الخلية الى البكتيرية تنتشر 24 ولكن الذي ينظم أيضا المضيف الاستجابات المناعية 25. وضع العلامات الفلورية إفراز InlC من البكتيريا داخل الخلايا يسمح ليس فقط لتميز بوضوح المصابة من الخلايا غير المصابة، ولكن أيضا يمثل قراءات نقطة النهاية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لتشريح العدوى في خطواتها مختلفة: الدخول، والهروب فجوي، عصاري خلوي البكتيرية انتشار وانتشار الخلية الى خلية. يمكن أن يقترن هذا البروتوكول القائم على الفحص المجهري لشاشات سيرنا بالتالي لدراسة مسارات الخلوية تشارك في إصابة الخلايا المضيفة التي كتبها L. المستوحدة.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td>For liquid BHI preparation</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Supplement to liquid BHI for BHI agar plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>51830-500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G1397-10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formaldehyde (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>Prepare fresh before each experiment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phalloidin Dy647</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>647-33</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Scramble</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Met</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003156-00-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 384-well microscopy cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007 9901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Metamorph analysis software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CellProfiler analysis software</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>Public software available at <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes

يمكن تصور مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الجزيئية كأدوات لتشريح شلالات الإشارات الخلوية وذلك بسبب قدرتها على التعامل بشكل رائع وتخريب وظائف الخلية التي هي المطلوبة لإصابة الأنسجة المستهدفة المضيف. بين هذه الجراثيم البكتيرية، المستوحدة الليستيريا هو الكائنات الحية الدقيقة موجبة الجرام التي تم استخدامها كنموذج للالتطفل داخل الخلايا في توصيف الاستجابات المناعية الخلوية، والتي لعبت أدوارا مفيدة في اكتشاف مسارات الجزيئية التي تتحكم في هيكل الخلية وغشاء ديناميات الاتجار. في هذه المقالة، ونحن تصف فحص مجهري قوية للكشف عن المراحل المتأخرة من العدوى الخلوية L. المستوحدة على أساس وضع العلامات الفلورية من InlC، وهو بروتين يفرز البكتيريا التي تتراكم في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، ويمكن أن يقترن هذا الفحص للمشاريع الصغيرة بالتدخل RNA شاشات عالية الإنتاجية الآلي من أجل شارacterize مسارات الإشارات الخلوية المشاركين في أعلى أو أسفل التنظيم من العدوى.

وضع العلامات الفلورية من حشوية InlC يوفر قراءات قوية للعدوى الخلية L. المستوحدة، كما هو موضح في الشكل رقم 1: الخلية المركزية في صورة مجهرية مصاب كبير من قبل سلالة P14.PrfA * 23 كما يمكن ملاحظتها في مرحلة تباين الصورة (النصال، 1A الشكل) ويتم تأكيد ذل?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

المستوحدة الليستيريا هو الممرض الجرثومي موجبة الجرام كثيرا ما تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة التطفل داخل الخلايا. التصوير أواخر L. المستوحدة مراحل العدوى في سياق شاشات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة يسمح للدراسة عالمية من مسارات الخلوية اللازمة لعدوى بكتيرية من الخلايا المضيفة الهدف.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

imaging-inlc-secretion-to-investigate-cellular-infection-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

9.8K Views.  Pasteur Institute.  المستوحدة الليستيريا هو الممرض الجرثومي موجبة الجرام كثيرا ما تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة التطفل داخل الخلايا. التصوير أواخر L. المستوحدة مراحل العدوى في سياق شاشات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة يسمح للدراسة عالمية من مسارا...

Video: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

النقل الشفوي لل<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في الفئران عن طريق ابتلاع الطعام الملوث

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

العدوى التجريبية مع<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; نموذجا لدراسة المضيف الردود انترفيرون γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.