P. Cossart Araştırma laboratuvarında Pasteur Enstitüsü, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant Mie-tarafından desteklenmektedir SignRupVac), Louis-Jeantet Vakfı ve Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK Pasteur-Paris Üniversitesi Uluslararası Doktora Programı / Institut Carnot İlletler Infectieuses bir burs bir alıcı. Biz hücresel transfeksiyon protokolü optimize Jason Mercer teşekkür ederim.

1.. Hücresel hazırlanması ve Bakteriyel Kültürleri, Transfeksiyonu Araçlar ve Primer Antikorlar <ol><li> Bireysel L. izole etmek için taze bir agar plaka hazırlayın -80 ° C&#39;de tutulan bir bakteri gliserol stoku (bakteriyel sıvı kültürü bir gece boyunca, doymuş glycerol/50% 50%) dan koloniler monocytogenes <ol><li> Bir Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) agar plaka üzerinde donmuş bir bakteri gliserol stok, çizgi bakteri taşımak için (-80 ° C&#39;de muhafaza) bir alüminyum raf kullanma. </li><li> 48 saat (ya da bireysel bakteriyel koloniler izole edilebilir ye kadar) içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Sıvı tohum kültürleri için kullanılacaktır), 1 aydan fazla bir süre boyunca 4 ° C &#39;de sonra bu çalışma plakası tutun. </li><li> Bizim protokol, L. kullanın serotip 1/2ã EGDe.PrfA * suşu monocytogenes, ancak Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi L. P14.PrfA 4b monocytogenes serotip * gerginlik benzer sonuçlar verir. </li></ol></li><li> OLa ATCC CCL2 hücreleri, antibiyotik olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde büyütülür. </li><li> Karıştırılmış (kontrol) ve anti-Met siRNA&#39;lar 384 oyuklu siyah mikroskopi hücre kültürü plakaları içinde yüklenir bağımsız havuzlar. <ol><li> RNase-içermeyen su içinde 500 ul siRNA 160 pmol seyreltin ve bu çözeltinin oyuk başına 5 ul (nihai konsantrasyon: 1.6 pmol) ekleyin. </li><li> 1 yıllık bir süre için -20 ° C &#39;de bu plaka tutun. </li></ol></li><li> 25, daha önce tarif edildiği gibi bir inlc-GST rekombinant proteini kullanılarak aşılama ile elde edilmiştir inlc bakteriyel proteine ​​karşı poliklonal tavşan antikorlarının seviyelerini yükseltmiştir. </li></ol> 2. SiRNA hücre transfeksiyonu Ters <ol><li> Enfeksiyondan önce 72 saat oda sıcaklığında her bir hazne içinde RNase içermeyen su içinde 5 ul 1.6 pmol siRNA içeren siyah 384 oyuklu mikroskopi hücre kültürü plakası getirmek. </li><li> 300 3 dakika boyunca plaka santrifüjkuyuların duvarlarında biriken olabilirdi siRNA&#39;yı aşağı getirmek için oda sıcaklığında rcf. </li><li> % 0.4 Lipofectamine RNAiMAX ile takviye edilmiş DMEM oda sıcaklığı hazırlayın. </li><li> (SiRNA eklemeden önce uzun süre 20 dakika daha inkübe transfeksiyon ortamı yok), her bir oyuğa DMEM / RNAiMAX transfeksiyon ortamı 25 ul ekle. </li><li> Transfeksiyon solüsyonu ile siRNA karıştırmak için ileri ve geri hareket plaka, daha sonra siRNA Lipofectamine kompleksleri oluşturmak için izin vermek için, oda sıcaklığında, 1 saat boyunca levha tutun. </li><li> Bir kere, 10 ml 37 ° C önceden ısıtılmış PBS ile birleşen veya alt konfluent hücre kültürü şişesinden yıkama HeLa hücreleri. </li><li> 1 ml 37 ° eklenerek HeLa hücreleri ayırın C hücre kültürü şişesine tripsin önceden ısıtılmış ve 37 ° C&#39;de 3-5 dakika boyunca inkübe </li><li> 10 ml 37 ° C &#39;de yeniden askıya hücreler% 16 FBS ile takviye edilmiş DMEM önceden ısıtılmış. </li><li> Hücre sayımı ve hazırlanması DMEM içinde, ml başına 12,000 hücre, bir hücre süspansiyonu ile desteklenmiş% 16 FBS. </li><li> 384-kuyulu bir levhadaki her kuyuya, hücre süspansiyonu, 50 ul ekle. </li><li> Hücreleri dağıtmak ve hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerleşmek izin hızla ileri ve geri plakasını taşıyın. </li><li> Parafilm ile plaka yalıtılır ve 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş% 5 CO2 içeren bir atmosferde 72 saat boyunca tutmak </li></ol> 3. Hücresel Enfeksiyon ve Boyama <ol><li> Enfeksiyondan bir gün önce, L. tek bir koloni almak BHI agar plakasından monocytogenes ve bir 15 ml tüp içinde polistiren sıvı BHI ortamı içinde, 5 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bakteri büyümesi için izin vermek için bir shacking cihazı içerisinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Enfeksiyonun gün, L., gece boyunca 1 ml yıkama bir masa üstü santrifüj 10.600 RCF 2 dakika santrifüj edilerek kültür monocytogenes. </li><li> (Salgılanmış sitotoksin listeriolisin O içerir) Süpernatant atılır ve 1 ml PBS (repea pelet yeniden askıya) yıkama aşaması 3 kez t. </li><li> 600 nm&#39;de optik yoğunluk bakteriyel okuma ve bakteri sayısını (OD = 1 1E9 bakteri / ml &#39;ye eşdeğerdir) tahmin ediyoruz. </li><li> Yeterli L. hazırlanması % 1 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde seyreltme monocytogenes: EGDe.PrfA * gibi, yüksek oranda istilacı türleri kullanılarak, biz oyuk başına 30 ul ortam içinde 5E4 bakterilerin kullanımını (enfeksiyon çokluğu 2.000 hücreleri için 25 olarak tahmin edilir) göstermektedir. </li><li> Her çukurdaki hücre kültür ortamı (80 ul) çıkarın ve L. 30 ul eklenmesi ile değiştirin orta monocytogenes-ihtiva etmektedir. </li><li> Enfeksiyon süreci senkronize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 RCF plaka santrifüj. </li><li> Önceden ısıtılmış alüminyum blok üzerinde, 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş% 5 CO2 içeren bir atmosfer altında 1 saat boyunca inkübe edin. </li><li> L. çıkarın de her bir ikinci orta monocytogenes-ihtiva eden ve% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde önceden ısıtılmış 30 ul ekle ve40 ug / ml gentamisin dışı L. öldürmek için monocytogenes. </li><li> Önceden ısıtılmış metal blok üzerinde, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içeren bir atmosferde 4 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> % 8 formaldehit (yerine paraformaldehid polimerlerden daha formaldehit monomerler kullanılır, ki bu çözelti, taze olarak hazırlanmalıdır) ile takviye edilmiş PBS içinde bir çözeltisi hazırlandı. </li><li> Hücre kültür ortamı atarak olmadan,% 8 formaldehit (nihai konsantrasyon:% 4) ile takviye edilmiş 30 ul PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve (oyuk başına 80 ul PBS nihai hacmi içinde hücreleri tutun) oyuk başına 80 ul PBS ile hücreler üç kez yıkayın. </li><li> Hazırlama bir 1:250 PBS içinde tavşan anti-serumu inlc seyreltme% 0.2 saponin ile takviye edilmiştir. </li><li> De PBS çıkarılmasından sonra her bir birincil antikor çözeltisinin 10 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Birincil atınAntikor çözeltisi ve oyuk başına 40 ul PBS ile dört kez yıkayın. </li><li> PBS içinde ikincil Alexa Fluor 546-bağlı anti-tavşan antikoru (1:250), DAPI çözeltisi (1:1,500) ve phalloidin-Dy647 (1:150) ile seyreltilir,% 0.2 saponin ile takviye edilmiştir. </li><li> Her çukuruna Bu ikinci boyama çözeltisi 10 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İkinci boyama solüsyonu atın ve (her bir kuyucuğa 40 ul bir son hacim bırakın ve plaka mühür) oyuk başına 40 ul PBS ile dört kez yıkayın. </li><li> Plaka hemen görüntülü olabilir ya da bir sonraki analiz için ışıksız bir 4 ° C (alüminyum folyo ile kapak) saklanabilir. </li></ol> 4. Görüntü Toplama ve Analizi <ol><li> Otomatik bir mikroskop üzerine monte edilmiş bir 10X objektif (kuyu başına tercihen 9 görüntüleri elde) kullanarak üç farklı kanal (350 nm, 546 nm ve 647 nm) görüntü elde. </li><li> Inlc bilgi sinyali görüntü kullanılarak ölçülebilirsırasıyla DAPI ve phalloidin lekeleme kullanarak çekirdekleri ve hücre gövdeleri otomatik segmentasyon sağlar CellProfiler gibi analiz yazılımı. </li></ol>

<ol>
	<li>Pizarro-Cerd&#225;, J., K&#252;hbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells:+an+updated+view.">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li><li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resistance+to+infection.">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li><li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments+and+the+growth,+movement,+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite,+Listeria+monocytogenes.">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li><li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes:+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin.">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li><li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin,+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci.">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li><li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated.">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li><li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product,+a+surface+protein.">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li><li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Listeria+species.">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape:+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes.">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li><li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin,+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells.">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li><li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase.">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li><li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake.">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li><li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion.">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li><li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase.">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Jonqui&#232;res, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes.">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells.">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li><li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins.">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li><li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection.">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Ripio, M. T., Dom&#237;nguez-Bernal, G., Lara, M., Su&#225;rez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes.">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li><li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria.">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li><li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I&#954;B+kinase+subinit+IKK&#945;.">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the I&#954;B kinase subinit IKK&#945;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens:+the+Listeria+monocytogenes+system.">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li><li>Snijder, B., Sacher, R., R&#228;m&#246;, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection.">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Çeşitli parametre inlc sinyalinin kesin bir algılanmasına izin vermek için yeteri kadar büyük bir sitoplazma gösteren sağlıklı hücre çizgilerinin kullanımı da dahil olmak üzere inlc bilgi algılama protokolün başarısına için kritik öneme sahiptir. Deneyde biz nedeniyle sitosolik boşluğun genişletilmesi için tahlil için özellikle uygun olan HeLa CCL2 hücrelerin kullanımı önermek bu madde içinde mevcut bu tür Kyoto HeLa hücreleri gibi diğer HeLa klonlar daha küçük bir ekran ancak sit...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Gram pozitif bakteri Listeria monocytogenes, konakçı hücreleri işgal onun içselleştirme vakuol bozar ve konakçı hücreler 1 sitoplazması içinde replike olan bir gıda kaynaklı patojendir. L. hücre ve hayvan modellerinde görülen bakteriyel hastalık özelliklerin kalıcılığı ile ilişkili laboratuar bağlamında (hızlı büyüme, sağlıklı bireyler için düşük toksisite) manipülasyon kolaylığı monocytogenes (hemolitik aktivite, lökositoz) için önemli bir model olarak 1960 yılında ilk kullanım izin hücre içi asalaklık ve enfeksiyondan 2 karşı hücresel bağışıklığın teorik temellerinin kurulması için çalışma. 1980&#39;lerin sonu ve 1990&#39;ların başlarında, bakteri hücre içi döngüsü 3 yanı sıra en önemli bakteriyel virulans moleküler karakterizasyonu diseksiyonu 4-7 L. kullanımını tercih faktörleri manipülasyon ve damızlık için önemli bir moleküler araç olarak monocytogeneskonakçı hücre fonksiyonlarının y. Listeria cinsinin Avirulent varlığı (L. innocua) ve öldürücü (L. monocytogenes) türleri karşılaştırmalı genomik çalışmalar 8 önünü açtığını, birlikte tam L. son kurulması ile monocytogenes L. evrim anlayışımızı artış, 9 transcriptome bir insan patojeni olarak ve enfeksiyonu için bir model sistem olarak monocytogenes 10 çalışmalar. L. monocytogenes ev sahibi hücre reseptörleri, sırasıyla E-kadherin ve Met, 11-12 ile bakteriyel yüzey proteinleri ve InlA ınlB etkileşimi üzerine konakçı hücreler içine içselleşmesini uyarır. Başlangıç ​​aday bazlı çalışmaları ınlB-kritik bir effektör olarak InlA istilası yolunun 13 ve fosfoinositid 3-kinaz (PI 3-K) önemli bir bileşeni olarak α / kateninler β-aktin bağlantı tanımlanmasına yol açtı bağımlı işgali Cascade 14-15. Proteomik ve fonksiyonel bazlı deneyler sonradan izin roman sitoskeletal elemanları 16 ve konakçı hücre işgali için gerekli lipid ikinci haberciler 17 tanımlama. Transkripsiyonal çalışmalar 18 ve kütle spektrometresi tabanlı nicel proteomiks 19 Yakın zamanlarda sinyal şelaleden aktivasyonu ve L. sırasında bağışıklık tepkilerinin baskılara ilişkin yeni bir ışık tutmuştur monocytogenesin. Sistem biyolojisi küçük müdahale RNA genlerin (kinomes, tam genomları) büyük setleri inaktive dayalı yaklaşımlar (siRNA) susturulması son zamanlarda fagositozundan dahil, spesifik hücresel fonksiyonları bağlamında sinyal basamaklarının küresel ana analizi için yeni yollar açtı ve var patojen içselleştirilmesi 20. Genom siRNA&#39;nın ekranlar önceden L. enfeksiyonu için gerekli hücresel kaskadlar araştırmak için yapılmıştır fagositik Drosophila monocytogenes </em&gt; S2 hücreleri 21-22 ancak bu tip analiz fagositik olmayan hücrelerde gerçekleştirilen edilmemiştir, in vivo enfeksiyonu için önemli hedefleri temsil eder. Biz, L. tarafından enfeksiyonun geç aşamalarında mikroskobik tespiti için bir protokol optimize epitel hücre içinde bakteri giriş yüksek verimli siRNA çalışmaları için uygundur monocytogenes. Bizim deney oldukça invazif L. yararlanır PrfA, L. majör kopyalama düzenleyicisi olarak, bir nokta mutasyon sunulur gerginlik monocytogenes 6, hastalık oluşturma faktörleri monocytogenes (PrfA * olarak adlandırılır) bu mutasyon 23 PrfA kurucu bir şekilde etkin hale getirir ve bu yüzden başka türlü kötü enfekte fagositik olmayan hücrelere bakteriyel girişi lehine, istila protein InlA ve ınlB bir artış çıkmasına yol açar. Enfeksiyon Bizim okuma salgılanan bakteriyel protein inlc sitozolik birikiminin saptanması üzerine dayanmaktadır: Bu molekülintra-sitoplazmik L. tarafından tercihen eksprese edilen bir pleiotropik efektör monocytogenes 9 ve katılır bakteri hücreden hücreye yayılan 24 değil, aynı zamanda konak immün yanıtları modüle 25, bunlar sadece. Hücre içi bakterilerin inlc salgılanmasının floresan etiketleme açıkça enfekte olmayan hücrelerin enfekte ayırt etmesine olanak veren, aynı zamanda, bir uç-nokta, daha sonra, farklı adımlarda enfeksiyon incelemek için kullanılabilir okuma temsil eder, sadece: girişi, vakuolar kaçış, sitosolik bakteriyel çoğalması ve hücre-hücre yayıldı. Bu mikroskopi tabanlı protokol Bu nedenle L. tarafından konak hücrelerin enfeksiyonu ile ilgili hücresel yolları okumak için siRNA ekranlara bağlanabilir monocytogenes.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td>For liquid BHI preparation</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Supplement to liquid BHI for BHI agar plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>51830-500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G1397-10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formaldehyde (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>Prepare fresh before each experiment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phalloidin Dy647</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>647-33</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Scramble</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Met</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003156-00-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 384-well microscopy cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007 9901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Metamorph analysis software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CellProfiler analysis software</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>Public software available at <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes

Bakteriyel hücre içi patojenler zarif işlemek ve ana hedef dokuların enfeksiyonu için gerekli olan hücre fonksiyonlarını yıkmak için kendi kapasitesi nedeniyle hücresel sinyal kaskadlar incelemek için moleküler araçlar olarak tasavvur edilebilir. Bu bakteriyel patojenler arasında, Listeria monocytogenes hücresel bağışıklık tepkilerinin karakterizasyonunda hücre içi parazitlenme için bir paradigma olarak kullanılan bir Gram pozitif mikroorganizma ve hücre iskeleti ve membran ticareti dinamiklerini kontrol moleküler yollarının bulunması etkili rol oynamıştır. Bu yazıda, L. geç hücre enfeksiyonu aşamalarının saptanması için bir tahlili tarif sağlam mikroskobik monocytogenes inlc, enfekte olmuş hücrelerin sitoplazması içinde biriken bir salgılanan protein bakteriyel floresan etiketleme göre, bu deney, Char için otomatik yüksek verimli, küçük müdahale edici RNA ekranlara bağlanabilirenfeksiyon yukarı-veya aşağı-regülasyonunda rol oynayan hücresel sinyal yolları acterize.

Sitoplazmik inlc floresan etiketleme L. tarafından hücre enfeksiyon için sağlam okunmasını sağlar monocytogenes, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi: mikrografta merkez hücre yüksek P14.PrfA * 23 suşu ile enfekte edilir bu faz kontrast çekimi (ok uçları, Şekil 1A) gözlenebilir ve bu sinyali DAPI ile doğrulanır gibi olduğu Bireysel bakteri açık (Şekil 1B) ayırt edilebilir. (Şekil 1 C &#39;de DAPI lekelemesi ile üst ü...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

imaging-inlc-secretion-to-investigate-cellular-infection-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

9.8K Görüntüleme.  Pasteur Institute.  Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar. 