وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (WT 0795880).

وبروتوكول التالية تصف الدراسة لغزو الخلايا البطانية التي كتبها S. ويمكن نظريا المذهبة ولكن يمكن استخدامها لدراسة الغزو الخليوي عن أي بكتيريا زروع. مراحل محددة لS. يشار المذهبة والبطانية الخلايا. 1. اعداد البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة س سلالات المكورات ل16/04 ساعة (تبعا لمرحلة النمو المطلوبة) في 10 مل الدماغ و القلب مرق (بهي) تسريب عند 37 درجة مئوية في الهواء مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. هذه الشروط هي محددة لنمو س. قد المذهبة ، وتحتاج إلى تكييف للبكتيريا أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البكتيريا ثلاث مرات في المتوسط ​​Dulbecco في التعديل النسر (DMEM ؛ Invitrogen) بواسطة قذائف بديلة للطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (5000 س ز ، 10 دقيقة) ، وإزالة لطاف والثقافة ، وإعادة تعليق من بيليه الجرثومي في وحدة تخزين ما يعادل DMEM. قياس كثافة بصرية لتعليق الناتجة من البكتيريا ومن ثم يمكن تعديله على النحو المطلوب. لS. المذهبة ، ونحن نستعد تعليق على OD 600 = 1 ، والذي يتوافق مع 10 ~ 9 -1 مل CFU. </li></ol> 2. الخلية البطانية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية البطانية EA.hy926 1 في DMEM تستكمل مع الجنين مصل الأبقار (FBS ؛ 10 ٪) والجلوتامين L - (2 ملم) في 37 درجة مئوية في ثاني ٪ 5 2. بدلا من ذلك ، يمكن شراؤها المجمعة الأولي الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) من Lonza (بازل ، سويسرا) والمثقف في المتوسط ​​القاعدية البطانية تستكمل مع FBS 2 ٪ ، واستخراج الدماغ البقري (بما في ذلك الهيبارين) ، والبشرية عامل النمو البطاني والهيدروكورتيزون في 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Lonza). هذه الشروط هي محددة لنمو هذه الخلايا ، وربما تحتاج إلى أن تتكيف لغيرها من أنواع الخلايا المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا بطانية T75 في قوارير لإكمال confluency ، التحقق من العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات 24 - جيدا لادراج coverslips. وهناك حاجة إلى ملقط غرامة (لهب تعقيمها) لنقل coverslips التي سطح واحد لامعة شفافة واحد. coverslips مكان في الآبار من 24 لوحة جيدا مع سطح معتم تواجه صعودا للسماح مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الخلايا من القارورة T75 مع 3 مل التربسين - EDTA (0.25 ٪) وإضافة إلى 10 مل من مستنبت ذات الصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى جانب 24 لوحات تحتوي على زجاج coverslips Thermanox. قدم أحد T75 قارورة متموجة من الخلايا خلايا كافية لوحات 24 على اثنين ، مما أدى إلى حوالي 5 × 10 5 خلايا لكل بئر (في المتوسط ​​500 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة 48 ساعة كما هو موضح أعلاه ، وتحقق 100 ٪ الخلية confluency بواسطة المجهر الضوئي مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع غسل coverslips في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى لوحات 24 بئر جديدة تحتوي على 490 DMEM ميكرولتر FBS تحتوي على 10 ٪ في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للنظر في دور العمليات الأيضية محددة في غزو الخلايا ، يمكن إضافة مثبطات إلى الخلايا المستزرعة ح 1 قبل إضافة البكتيريا وتجمعات المحافظة خلال الفحص. على سبيل المثال ، لتحديد دور في إعادة ترتيب أكتين س. غزو ​​الخلايا البطانية المذهبة ، ويمكن اضافة 50 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D ، أو لدور caveolae ، 5 ملي الميثيل β - cyclodextrin يمكن إضافتها. </li></ol> 3. غزو ​​الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من البكتيريا غسلها (مما أدى إلى ما يقرب من 2 × 10 7 مل CFU المذهبة س -1) التي تحتوي على كل بئر ساترة غسلها مع طبقة من الخلايا البطانية متكدسة في 490 DMEM ميكرولتر تحتوي على 10 ٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان 15-90 دقيقة في 37 في 5 ٪ CO 2 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس العدد الكلي للبكتيريا المرتبطة الخلايا (ملتصقة والمنضوية) ، وتراجع في غسل coverslips ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى آبار جديدة تحتوي على 500 ميكرولتر تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. لضمان الخلايا ليز بالكامل والإفراج عن جميع البكتيريا المنضوية ، ماصة لعدة مرات ، لافتا غيض من ماصة مباشرة على سطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد البكتيريا عن طريق طلاء تعليق السائل (أو التخفيفات هذا إذا لزم الأمر) على سطح اللوحات TSA. منذ TX - 100 وليز العديد من الجراثيم سلبية الغرام ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك سابونين 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس عدد من البكتيريا المنضوية ، إزالة طاف الثقافة من كل البكتيريا غير منضم يحتوي جيدا واستبدالها ب 500 ٪ FBS DMEM/10 ميكرولتر تستكمل مع 200 ميكروغرام جنتاميسين -1 مل. نستخدم عادة جنتاميسين بدلا من lysostaphin هنا كما هو أرخص ويسمح لنا للتبديل بين التجارب باستخدام أنواع مختلفة من البكتيريا (مثل المكورات العنقودية وLactococci) دون الحاجة إلى تغيير بروتوكول التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 لمدة 60 دقيقة لقتل جميع الجراثيم خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في برنامج تلفزيوني ،ليز و تعداد بواسطة الطلاء على TSA صفه للمقايسة التصاق أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بعض الحالات قد يكون من الأفضل أن نعتمد بصريا عدد من البكتيريا باستخدام المجهر الضوئي. في هذا المثال ، ومحددة لس. المكورات غزو الخلايا ، استخدم lysostaphin (10 ميكروغرام مل -1) بدلا من الجنتاميسين لتدمير البكتيريا فعليا خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان coverslips 20min عند 37 درجة مئوية في ثاني 2 في حل lysostaphin ، ثم شطف والإصلاح مع Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات coverslips مع الكريستال البنفسجي (0.5 ٪ ، ث / ت) ل5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الماء ، والهواء الجاف وتراجع شطف جبل على الشرائح الزجاجية. ويمكن قياس عدد من البكتيريا في 2 مم من الخلايا البطانية متموجة باستخدام المجهر الضوئي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : التعبير عن البروتينات ملزمة فبرونيكتين (FnBPA وFnBPB) على سطح س. المكورات يمنح القدرة على غزو الخلايا البطانية. الأعمال الأخيرة أدى إلى إعادة تعريف المجال فبرونيكتين الملزم FnBPA 3. البرية من نوع (WT) س. المكورات 8325.4 يغزو الخلايا البطانية ذات كفاءة عالية ، في حين تفتقر سلالة كلا FnBPA وباء (Δ FNB) أظهرت انخفاض مستويات كبيرة من تدخيل (الشكل 1A). تكامل للمتحولة مع ترميز FNB البلازميد ناقص لم المجال فبرونيكتين ملزم (pFnR0) لا تشجع الغزو (الشكل 1A). على النقيض من ذلك ، تكامل للمتحولة مع ترميز البلازميد في FNB كامل المورثة (pFnBA4) استعادة الغزو إلى مستويات WT (الشكل 1A). ويمكن أيضا دور في غزو FnBPA الخلية البطانية يمكن أظهر باستخدام المضيف اللبنية التعبير Lactococcus مغاير. التعبير عن بلازميد ترميز FnBPA في L. لم اللبنية (pRM9 9) لن يعزز بشكل ملحوظ لالتصاق الخلايا البطانية مقارنة البكتيريا معربا عن أي FnBPA (CTL) (الحانات مفتوحة ، 1B الشكل). على النقيض من ذلك ، معربا عن FnBPA - L. غزت اللبنية الخلايا البطانية على مستويات أعلى بكثير من سلالة غير التعبير عن (الحانات التي أغلقت ، 1B الشكل). وأجريت التجارب في مكررة أربع مرات ، وقدم يعني ± الانحراف المعياري. * تمثيل البيانات الإحصائية التي تختلف اختلافا كبيرا (ع = &lt;0.05) من وزن أو قيم CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. غزو EA. Hy926 الخلايا البطانية التي كتبها س. الذهبية (A) أو L. اللبنية (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> يستند مقايسة وصفنا على مقايسة حماية الجنتاميسين ، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة غزو الخلايا المضيفة البكتيريا. واستخدمت ملاحظات لعدم قدرة المضادات الحيوية وغيرها من الجنتاميسين لقتل البكتيريا داخل الخلايا في الدراسات المبكرة على غزو الخلايا المضيفة 4-8 البكتيريا. استخدام 48 أو 24 أو حتى 96 - جيدا يسمح لوحات توليد كميات كبيرة من البيانات ، وكمية استنساخه في فترة قصيرة من الوقت وبتكلفة منخفضة نسبيا. في مقايسة غير جذابة أيضا لأنها لا تتطلب معدات متخصصة ، يمكن أن تكون مصممة للعمل مع مختلف الجراثيم والخلايا ، ويمكن استخدامها لدراسة دور كل من عمليات الخلية البكتيرية والمضيفة في غزو 9. في الواقع ، منذ وقت التجارب ، وقد تم فحص الحماية المستخدمة على نطاق واسع الجنتاميسين لقياس الخلية المضيفة غزو من قبل مجموعة من البكتيريا أو تركيبات مختلفة من البكتيريا حتى 10،11. في حين أن المبادئ الأساسية هي أن العديد اختلافات دقيقة في نفس الأسلوب قد تم الإبلاغ عنها. في هذه المقالة قد وصفنا نسختنا وأشار إلى التعديلات التي قد تكون ضرورية لغيرها من البكتيريا أو الخلايا المضيفة. عند تصميم تجربة لقياس المضيف غزو الخلايا باستخدام هذا النهج أن هناك عددا من النقاط الهامة في الاعتبار : الحساسية البكتيرية للجنتاميسين. قد يبدو هذا واضحا ، ولكن من المهم التأكد من أن هذه البكتيريا التي يجرى بحثها هي عرضة للجنتاميسين في درجة الحرارة ، وتركيز وعلى مدى الفترة الزمنية التي يتعين استخدامها. في حالة عدم الاكتراث ، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية الأخرى 5. ويمكن اتباع نهج بديل يتمثل في استخدام الإنزيمات lytic (lysostaphin ، mutanolysin ، الليزوزيم) 12. حضانة وقيحة. عند تنفيذ هذا الاختبار للمرة الأولى ، من المهم لإنشاء حضانة مرات الأمثل واللقاح الجرثومي لاستخدامه. ولذلك ، ينبغي النظر في التجارب الأولية على حد سواء التصاق والغزو على مر الزمن (5 دقائق ليصل الى 6 ساعات). من المهم أيضا لتقييم مدى تأثر غزو من جانب تعدد العدوى (وزارة الداخلية ، وعدد من البكتيريا في الخلية). عموما فإنه من الأفضل استخدام عدد من البكتيريا بأقل عدد ممكن لأن هذا سيؤدي إلى تقليل الأضرار إلى الخلايا المستزرعة. قد يكون غاب عن اختلافات مهمة بين سلالات إذا فترات حضانة طويلة أو قائح كبيرة تستخدم 9،13. تلف الخلايا ، ومن المهم أن يغسل البكتيريا قبل الاستخدام. ومع ذلك ، لا يقتصر الضرر الخلوي لإنتاج السم. الغزو الجرثومي ، ويمكن استحثاث موت الخلايا المبرمج ، وتعطل الوظائف الخلوية العادية تتسبب جميع الأضرار الخلوية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغلغل الجنتاميسين في الخلية ، وقتل البكتيريا المنضوية إعطاء الانطباع بأن الغزو لم يحدث 14. شروط الحضانة. ويمكن لدرجة الحرارة وتكوين ثقافة المتوسطة يكون لها تأثير كبير على الغزو. على سبيل المثال ، والغزو من الخلايا العقدية المقيحة هيلا التي تعتمد على وجود فبرونيكتين القابلة للذوبان ، والتي هي عادة موجودة في المصل 15. وهناك اعتبار آخر هو نمو البكتيريا في مستنبت أثناء التجربة. ثقافة وتقدير من البكتيريا داخل الخلايا. وعلى الرغم TX - 100 قد لا تقتل البكتيريا داخل الخلايا ، فإنه قد تحول دون نموها. على هذا النحو ، فمن المهم للتحقق من النسخ المتماثل على وسائط جرثومية الصلبة في وجود المنظفات. حيث تتأثر ، قد يكون من الممكن استخدام تركيزات أقل من المنظفات أو استخدام بديل مثل سابونين. وهناك فائدة للمقايسة حماية الجنتاميسين على تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري هو أنه أقل من العمالة المكثفة ، وأنها تسمح للكشف والتمييز بين المجموعات الفرعية من السكان من البكتيريا المنضوية. على سبيل المثال ، S. يمكن أن تنتج إما المذهبة نوع مستعمرة العادي (NCT) أو المتغير مستعمرة صغيرة (SCV) 16 ، والتي لن تكون مميزة من خلال الفحص المجهري للخلايا بكتيرية الفردية. وهناك فائدة من تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري على مقايسة حماية الجنتاميسين هو يمكن شكلت خلية للتكتل وأن البكتيريا التي تدخل الخلايا &quot;قابلة للحياة ولكن غير زروع&quot; وسيتم الكشف عن 17 حالة. دراسة دور عمليات الخلية المضيفة في الغزو الجرثومي. استخدمت العديد من الدراسات مثبطات وظيفة الخلايا المضيفة مثل D مثبط حركة الخلايا ، والتي تتعارض مع إعادة ترتيب أكتين. مثل هذه الدراسات يمكن أن تشمل أيضا الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات سطح الخلية وضربة قاضية للجينات محددة سيرنا 18. من المهم جدا للتأكد من أن هذه العلاجات لا تؤثر على صلاحية أو مرفق من الخلايا المستنبتة أو تكون لها آثار سامة على البكتيريا. التوجهات المستقبلية : ontent &quot;&gt; لأنه يتم عادة إجراء هذا الاختبار في لوحات متعددة جيدا ثقافة الخلية ، فمن الممكن نظريا لتكييفه مع عملية الفرز الفائق الإنتاجية ، والتي قد تنطوي على دراسة المكتبات وظيفة الخلية مثبطات المحتملة ، ومكافحة العدوى أو المضادات الحيوية صممت لاستهداف البكتيريا داخل الخلايا. كبديل ، يمكن أن تستخدم مثل هذا النهج إلى الشاشة متحولة المكتبات لتحديد الجينات المسؤولة عن الالتصاق ، والغزو ، أو البقاء داخل الخلايا ، وفي بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه لتشمل قوى القص (التدفق) في النظام النموذجي ، على سبيل المثال عندما النمذجة البطانة ، على نحو أوثق محاكاة البيئة في الجسم الحي. التقدم الحالي في مجال تصميم وتصنيع الخلايا التدفق ونظم ميكروفلويديك خلية ثقافة توفر إمكانية توظيف مقايسة الجنتاميسين في حماية المضيف الممرض النماذج التي تضم قوى القص. باختصار ، يقوم بروتوكول الموصوفة هنا على النهج المماثلة المستخدمة على مدى سنوات عديدة. فمن على نطاق واسع ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المستزرعة ، والأنواع البكتيرية ويمكن أن تولد كميات كبيرة من البيانات بسرعة وبتكلفة قليلة نسبيا.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

هنا سنقوم بشرح كيف ندرس غزو الخلايا البطانية الإنسان عن طريق البكتيريا العنقودية الذهبية الممرض. ويمكن تطبيق بروتوكول عام لدراسة الغزو خلية بكتيريا أي تقريبا زروع. وسيتم تسليط الضوء على المراحل التي يمكن أن تدرس جوانب محددة من الغزو ، مثل إعادة ترتيب دور الأكتين أو caveolae. تزرع الخلايا المضيفة في قوارير والمصنف عندما جاهزة للاستخدام في 24 لوحات تحتوي كذلك coverslips Thermanox. يسمح باستخدام coverslips اللاحقة إزالة الخلايا من الآبار للحد من التدخل من بروتينات مصل المودعة على الجانبين من الآبار (S. المذهبة التي سوف نعلق). تزرع البكتيريا إلى الكثافة المطلوبة وغسلها لإزالة أي تفرز بروتينات (مثل السموم). يتم نقل Coverslips مع طبقات من الخلايا البطانية متكدسة لوحات 24 بئر جديدة طازجة تحتوي على مستنبت قبل إضافة البكتيريا. ثم يتم تحضين الجراثيم والخلايا معا من أجل المبلغ المطلوب من الوقت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. لS. المكورات هذا هو عادة بين 15-90 دقيقة. تتم إزالة coverslips Thermanox من كل بئر وتراجع غسلها في برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير مرتبط. إذا كان مجموع البكتيريا المقترنة (ملتصقة والمنضوية) هي أن يكون كميا ، ثم توضع في بئر coverslips الطازجة التي تحتوي على تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. pipetting طيف يؤدي إلى تحلل الخلايا وإكمال يتم تعداد البكتيريا عن طريق التخفيف المتسلسل والطلاء على أجار. اذا كانت هناك حاجة لعدد من البكتيريا التي قد غزت الخلايا ، تضاف إلى coverslips الآبار تحتوي على 500 زراعة الأنسجة ميكرولتر المتوسطة تستكمل مع الجنتاميسين وحضانة استمرت لمدة 1 ساعة ، والتي سوف تقتل كل البكتيريا الخارجية. lysed الخلايا يمكن أن تكون ثم Coverslips غسلها ، والبكتيريا التي تم تعدادها على الطلاء أغار على النحو المبين أعلاه. إذا كانت التجربة يتطلب رؤية مباشرة ، يمكن ان تكون ثابتة وcoverslips ملطخة المجهري للضوء ، أو مضان مبائر أو معدة للفحص المجهري الإلكترون.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

بروتوكول عام لدراسة غزو الخلايا المضيفة من قبل الممرض الجرثومي ، مع التركيز على<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; والخلايا البطانية الإنسان.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.6K Views.  University of Bath. بروتوكول عام لدراسة غزو الخلايا المضيفة من قبل الممرض الجرثومي ، مع التركيز على المكورات العنقودية الذهبية والخلايا البطانية الإنسان.

Video: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي