الهدف العام لهذا البروتوكول هو دراسة وتحديد تجديد العضلات في نموذج حمار وحشي لمرض العضلات. توفر هذه الطريقة خط أنابيب عالي الإنتاجية ليس فعالا من حيث التكلفة فحسب ، بل يمكن استنساخه أيضا بشكل كبير في تسجيل الإمكانات التجديدية للعضلات المريضة في بيئة الجسم الحي. إظهار الإجراء معي سيكون Avnika روبارليا، زميل باحث في المعهد الأسترالي للطب التجديدي.
للكتابة الجينية الجنين الحية، قشر فيلم واقية واضحة من السطح العلوي من رقاقة استخراج الحمض النووي من 24 غرفة واستخدام تلميح مرشح 20 ميكرولتر مع طرف قطع لنقل جنين واحد مخدر في 13 ميكرولتر من المتوسط الجنين في كل غرفة من رقاقة. عندما يتم تحميل جميع الأجنة، قم بتركيب الشريحة بلطف على منصة جينوتيبينج جنين حمار وحشي عن طريق وضع جانب واحد في البداية، تليها بقية الشريحة. لصق غطاء المنصة المغناطيسية على الشريحة لمنع تبخر الجنين المتوسط خلال بروتوكول استخراج الحمض النووي وإغلاق الغطاء.
تعيين وحدة قاعدة إلى 2.4 فولت، 0.051 أمبير، و 0.12 واط وبدء بروتوكول استخراج الحمض النووي. يجب أن تبدأ المنصة في الاهتزاز ، والتي يمكن تقييمها عن طريق لمس الغطاء بلطف. أثناء تشغيل البرنامج، قم بإعداد لوحة من 24 بئرا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من متوسط الجنين إلى كل بئر وتسمية أنابيب الشريط ذات ثمانية آبار لاستخدامها في جمع مواد الحمض النووي من كل جنين.
بعد ثماني دقائق من الاستخراج، اضغط على زر التشغيل/إيقاف التشغيل لإيقاف اهتزاز المنصة، وإزالة الغطاء المغناطيسي برفق ورفع الشريحة من المنصة. نقل 10 ميكرولتر من المتوسط الجنين من غرفة واحدة إلى البئر المناسب للأنبوب الشريط ثمانية آبار وإضافة على الفور قطرتين من المتوسط الجنين الطازج إلى الغرف. نقل الجنين من الغرفة إلى بئر مناسبة من لوحة 24 جيدا المعدة سابقا.
عندما يتم نقل جميع الأجنة، ضع اللوحة في حاضنة 28 درجة مئوية. إجراء المقايسات الجينية المناسبة في المصب على المواد الوراثية التي تم جمعها في أنابيب الشريط ثمانية آبار لتحديد النمط الجيني لكل جنين. بمجرد تحديد النمط الجيني لكل جنين، قم بنقل الأجنة إلى أطباق بيتري عيار 90 ملليمترا التي تحتوي على 25 ملليلتر من الماء المتوسط واحتضان الصفائح عند 28 درجة مئوية حتى إصابة العضلات.
في أربعة أيام بعد الإخصاب ، استخدم ماصة لنقل يرقة تخدير واحدة إلى طبق بيتري جديد وإزالة أي وسيطة زائدة بعناية من الطبق تحت مجهر تشريح. توجيه الأسماك بحيث الرأس على اليسار، الذيل هو على اليمين، والمنطقة الظهرية هو أعلى، والمنطقة البطنية هو أسفل، واستخدام إبرة قياس 30 لجعل طعنة دقيقة سريعة في واحد إلى اثنين من somites في العضلات epaxial فوق المسام الشرجية والأفقية إلى الميوسبتوم. ضع قطرة من متوسط الجنين على سمك الحمار الوحشي المصاب ونقل اليرقة بعناية إلى بئر واحد من طبق من 24 بئرا يحتوي على ملليلتر واحد من متوسط الجنين الطازج لكل بئر.
عندما تصاب جميع اليرقات ، ضع اللوحة في حاضنة 28 درجة مئوية حتى يتم تصوير سمك الحمار الوحشي. لتحديد كمية تجديد العضلات، افتح صورة ما بعد الإصابة ليوم واحد في برنامج تحليل الصور المناسب واستخدم أداة المضلع لرسم شكل حول موقع الجرح. استخدم البرنامج لقياس المنطقة ويعني كثافة ثنائية التخبير في المنطقة ونسخ هذه القيم إلى الخلايا D3 و E3 من القالب المقدم.
رسم منطقتين إضافيتين تمتد كل منهما من واحد إلى اثنين من السخامات غير المصابة وقياس المنطقة ويعني كثافة ثنائية التجويف في كل من هذه المناطق. نسخ هذه القيم إلى الخلايا D4 و D5 و E4 و E5 في القالب. ثم كرر القياس لنفس المناطق في صورة ما بعد الإصابة لمدة ثلاثة أيام.
عندما يتم قياس ثنائية التفحم بنفس الطريقة في جميع الصور، احسب ثنائية الefringence العادية لكل منطقة من خلال تقسيم متوسط كثافة ثنائيةefringence لكل منطقة على منطقتها. لكل نقطة زمنية، حساب متوسط birefringence تطبيع المنطقتين غير المصابين لتوفير نقطة مرجعية للعضلات غير مصاب. لتحديد مدى إصابة العضلات في اليوم الأول بعد الإصابة ، قم بتقسيم birefringence الطبيعية لمنطقة الإصابة من خلال متوسط birefringence تطبيع المناطق غير المصابة.
لتحديد مدى تجديد العضلات، تقسيم birefringence تطبيع المنطقة إصابة في صورة ما بعد الإصابة ثلاثة أيام من قبل متوسط كثافة تطبيع المناطق غير المصابة في هذه المرحلة. وأخيرا، حساب مؤشر التجديد عن طريق تقسيم قيمة لمدى تجديد العضلات في اليوم الثالث بعد الإصابة على قيمة مدى إصابة العضلات في اليوم الأول بعد الإصابة. في هذا التحليل التمثيلي، تم نقل مخلب من الأجنة من صليب بين اثنين من سمك الحمار الوحشي لاما2 heterozygous إلى رقاقة استخراج الحمض النووي وجنوتية في وقت لاحق.
في حين أن إصابة العضلات تؤدي إلى انخفاض في كثافة ثنائية الدماغ في اليوم الأول بعد الإصابة ، فإن التجديد الناجح للعضلات يؤدي إلى زيادة ثنائية التخبير داخل المنطقة نفسها. ومن الجدير بالذكر أيضا أنه في حين أن يرقات النوع البري تعرض كثافة ثنائية تثميط موحدة بسبب نمط العضلات الطبيعي ، فإن كثافة ثنائية التجويف في عضلة يرقات خروج المغلوب Lama2 غير متساوية ومتقطعة للغاية بسبب انخفاض سلامة العضلات. كما لوحظ ، يظهر كل من النوع البري واليرقات التي تعاني من نقص Lama2 زيادة كبيرة في كثافة ثنائية الدماغ في موقع الجرح في ثلاثة أيام بعد الإصابة مقارنة بيوم واحد بعد الإصابة ، مما يشير إلى أن العضلات قد تجددت.
يكشف تحديد المؤشر التجديدي أن اليرقات التي تعاني من نقص Lama2 تظهر زيادة مذهلة في تجديد العضلات مقارنة بالحيوانات البرية. في حين أن هذا البروتوكول سيسمح لنا بتحديد أي تعديلات في قدرة العضلات على التجديد في نماذج أمراض العضلات ، يجب إجراء التحليل الخلوي والجزيئي في المصب لتحديد الآليات المسؤولة عن التغييرات الملحوظة. وقد سمحت لنا هذه الطريقة بتحديد كيفية مساهمة ضعف وظيفة الخلايا الجذعية العضلية وضعف العناصر المتخصصة المرتبطة بها في مسببات أمراض العضلات ، مما يسمح لنا بتحديد آليات جديدة للمرض.
