Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione the Australian Research Council Federation Discovery Project #1096623.

1. Creazione del vettore di ricombinazione
<ol><li>Identificare le regioni di omologia lunghe 150 bp (indicate come braccia sinistra e destra) necessarie per etichettare n o c-terminale il gene virale di interesse (vedere figura 1b).</li>
	<li>Progettare una sequenza oligonucleotide che comprenda i bracci sinistro e destro da 150 bp separati da una coppia di siti di restrizione di scelta. L'intera sequenza deve anche essere affiancata da una seconda coppia di siti di restrizione (diversi dalla prima coppia) per consentire l'incorporazione nel vettore TDS una volta sintetizzati. Fare attenzione quando si progetta l'oligonucleotide con siti di restrizione che le sequenze sono in cornice con il sito di inserimento desiderato.</li>
	<li>Incorporare siti di restrizione tra i bracci sinistro e destro durante la progettazione dell'oligonucleotide per la sintesi, che deve corrispondere a quelli che fiancheggiano il telaio di lettura aperto dell'etichetta fluorescente scelta (vedere figura 1b). È possibile utilizzare un sito di restrizione NotI come un collegamento a tre amminoacidi tra il braccio sinistro e l'inizio del tag fluorescente.</li>
	<li>Incorporare questi stessi siti di restrizione su entrambi i lati del tag fluorescente tramite PCR (vedere la figura 1c).</li>
	<li>Clonare il frammento sintetizzato nel vettore TDS.</li>
	<li>Clonare il tag fluorescente nel vettore di ricombinazione risultante utilizzando i siti di restrizione tra le regioni di omologia del braccio sinistro e destro (vedere figura 1d).</li>
</ol>2. Generazione di virus ricombinanti
<ol><li>Come nella figura 2, infettare un monostrato di cellule BS-C-1 con virus vaccinia in mezzi liberi da siero a una molteplicità di infezioni (MOI) > 1.</li>
	<li>1 ora dopo l'infezione, cellule di salvataggio con il Mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco e trasfezione con una miscela di plasmide vettoriale di ricombinazione e reagente di trasfezione in un rapporto di 3:1 in mezzi privi di siero.</li>
	<li>Dopo 24 ore, raschiare e recuperare le cellule in DMEM senza siero bovino fetale (FBS) ed eseguire tre cicli di congelamento-disgelo per rompere le cellule aperte e rilasciare particelle virali.</li>
	<li>Eseguire un saggio di placca con una sovrapposizione liquida del 10% di FBS DMEM e GPT selezione reagenti acido micofenolico (25 μg/ml) e xantina (250 μg/ml) come segue:<ol>
<li>Seminare una piastra a 6 pomerismi con un monostrato di cellule BS-C-1.</li>
		<li>Infettare monostrati a cellule confluenti al 100% con diluizioni seriali delle cellule congelate contenenti particelle virali per garantire un'adeguata separazione delle singole placche.</li>
		<li>Sovrapposizione con FBS liquido al 10% contenente DMEM contenente i reagenti di selezione GPT - acido micofenolico e xantina a concentrazioni finali rispettivamente di 25 μg/ml e 250 μg/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere la sovrapposizione liquida e utilizzare un microscopio fluorescente per cercare placche che mostrino fluorescenza rossa diffusa corrispondente all'incorporazione di mCherry dal vettore TDS nel virus. A seconda del gene bersaglio e dell'etichetta fluorescente scelta, la fluorescenza localizzata del gene taggato può anche essere osservata nella stessa placca rossa.</li>
	<li>Raccogliere più placche per ogni virus ricombinante raschiando localizzato con una punta di pipetta e 100 μl di FBS al 5% contenente DMEM per trasferire le cellule in un tubo Eppendorf, seguito da tre cicli di congelamento-scongelamento di cellule raschiate per rilasciare virus ricombinanti.</li>
	<li>Aggiungere il DMEM contenente virus congelato a un monostrato di cellule in una piastra da 12 pomeriggi per amplificare i virus ricombinanti con reagenti di selezione GPT nei mezzi di crescita. Raschiare amplificazioni di successo 24 ore dopo l'infezione.</li>
	<li>Eseguire un saggio di placca di placche amplificate con successo che mostrano fluorescenza rossa, questa volta con una sovrapposizione di agarosio e selezione GPT, come segue:<ol>
<li>Seminare una piastra a 6 pomerismi con un monostrato di cellule BS-C-1.</li>
		<li>Eseguire una diluizione seriale dei virus ricombinanti e infettare i pozzi con una crescente diluizione di virus in DMEM privo di FBS.</li>
		<li>1 ora dopo l'infezione, rimuovere il mezzo liquido e sovrapporre ogni bene con 0,5% di agarosio in mezzo essenziale minimo (MEM) contenente 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina, insieme ai reagenti di selezione GPT.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 giorni dopo l'infezione, scegli le placche che mostrano fluorescenza che è sia rossa che il colore dell'etichetta fluorescente scelta per amplificarsi di nuovo, questa volta senza selezione GPT.</li>
	<li>Eseguire il saggio della placca successiva con una sovrapposizione di agarosio senza selezione.</li>
	<li>Scegli le placche che hanno perso la loro fluorescenza rossa diffusa ma mantieni la fluorescenza localizzata corrispondente all'etichetta preferita.</li>
	<li>Continuare la purificazione della placca senza alcuna selezione per ottenere uno stock puro di virus ricombinanti che hanno perso i geni di selezione mCherry e gpt ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al tag scelto. Le scorte di controllo sono pure per saggio di placca, tutte le placche dovrebbero avere un fenotipo di placca simile.</li>
	<li>Utilizza lo screening PCR del DNA genomico per garantire che le scorte virali siano pure.<ol>
<li>Primer di progettazione che fiancheggiano il sito di inserimento genico fluorescente e primer che amplificano il gene fluorescente inserito stesso. Diverse combinazioni di questi primer produrranno ampliconi PCR che rileveranno l'inserimento genico e indicheranno purezza.</li>
		<li>Amplificare le scorte virali per essere vengono schermate pcr in un pozzo di un monostrato a piastre a 12 po po', di cellule BS-C-1.</li>
		<li>24 ore dopo l'infezione, raschiare le cellule infette in 250 μl di DMEM.</li>
		<li>Centrifugare le cellule infette (18.000 x g per 10 min, 4 °C), rimuovere il pellet di cellule supernatanti e resuspend in 500 μl TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8) con SDS 0,1% (v/v). Vortice per lelizzare le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 500 μl fenolo-cloroformio-isoamile acolo, invertire per mescolare. Centrifuga (18.000 x g per 4 min, 4 °C). Prendi il supernatante e ripeti.</li>
		<li>Eseguire una precipitazione di etanolo sul supernatante aggiungendo 1 ml 100% di etanolo (refrigerato) e 50 μl di acetato di sodio, invertire per mescolare.</li>
		<li>Lasciare a -20 °C durante la notte o -80 °C per 1 ora. Centrifuga (18.000 x g per 30 min, 4 °C), rimuove tutto il liquido e lascia asciugare ad aria il DNA precipitato. Resuspend in 50 μl TE.</li>
		<li>Usalo come modello per lo screening genomico della PCR del DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generazione di virus ricombinanti che trasportano più di un tag
<ol><li>Coinfetto lo stesso monostrato cellulare con virus ricombinanti fluorescenti per creare virus a doppia o tripla etichetta o procedura di ripetizione dal protocollo 1) con un tag diverso.</li>
	<li>Purificare i virus basati sul fenotipo della placca o sullo screening PCR del DNA genomico isolato dal virus.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates.">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li><li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus.">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li><li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat.">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li><li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination.">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li><li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3+'-to-5+'+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination.">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li><li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination.">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li><li>Ward, B., Isaacs, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).</li><li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25,000.">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+&amp;#34;honeycomb&amp;#34;+surface+coat.">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &amp;#34;honeycomb&amp;#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+host+cell+entry.">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li><li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions.">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li><li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules.">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li><li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants.">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation.">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li><li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression.">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors.">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li><li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+(Tian-Tan+strain)+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker.">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li><li>Dom&#237;nguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry.">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li><li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection.">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li><li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis.">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li><li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen.">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li><li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li><li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection.">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li><li>Broder, C. C., Earl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 62, 173-197 (1997).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37,000-dalton+outer+envelope+protein.">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li><li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+Navigating+the+subcellular+space:+Lessons+from+vaccinia+virus.">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).</li><li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy.">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li><li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2/3-complex-dependent+actin-based+motility.">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li><li>D&#233;nes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors.">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread.">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li><li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy.">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li><li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus.">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questa tecnica descrive un protocollo efficiente e modulare per la creazione di virus ricombinanti che esprimono proteine virali contrassegnate fluorescentmente. Il metodo garantisce che l'unica modifica al genoma virale sia l'aggiunta di un tag o di un marcatore, senza lasciare alcun marcatore di selezione. La breve lunghezza del braccio richiesta per la ricombinazione omologa ne consente la sintesi diretta, eliminando diversi cicli dispendiosi in termini di tempo di PCR e clonazione, mentre la fluorescenza della selezione di mCherry e GPT metabolica viene utilizzata per isolare gli intermedi di ricombinazione virale. Questi intermedi possono essere risolti, dopo la rimozione della selezione, in un virus con un gene taggato o di nuovo al tipo parentale. Un metodo simile che prevede l'uso della selezione sia fluorescente che metabolica è stato descritto inprecedenza 27, sebbene il metodo utilizzato in questo studio utilizzi regioni di omologia più brevi e sintetizzati, consentendo l'identificazione del virus ricombinante desiderato imagingndo la fluorescenza del gene taggato di interesse. Questa selezione secondaria è applicabile solo per l'etichettatura di geni virali altamente espressi che producono fluorescenza sufficiente in un saggio di placca. In alternativa, si potrebbe prevedere l'inserimento di una cassetta di espressione completa, ad esempio una proteina fluorescente sotto un forte promotore virale. In questo caso le braccia sinistra e destra definirebbero il punto di inserimento piuttosto che il gene virale da taggare.
Ci sono alcuni passaggi chiave che si sono rivelati utili durante la procedura sperimentale. La sovrapposizione liquida nel passaggio 2.3.3 sopra descritta si è rivelata cruciale per il rilevamento e l'isolamento delle placche fluorescenti rosso/verde. Riteniamo che la combinazione dei reagenti di selezione GPT e della sovrapposizione di agarosio abbia scoraggiato la crescita dei virus ricombinanti e quindi sia passata a una sovrapposizione liquida per il primo passo di amplificazione dei virus dopo la trasfezione. È anche importante scegliere placche fluorescenti che mostrino fluorescenza localizzata del colore delle targhe per l'arricchimento e la purificazione, poiché gli intermedi risultanti dalla ricombinazione del braccio sinistro possono causare fluorescenza diffusa osservata nelle placche se il braccio sinistro contiene anche una sequenza di promotori. Il gene marcatore mCherry nel vettore TDS può anche essere sostituito da gfp, ad esempio, per consentire la facile incorporazione e selezione di mCherry come tag fluorescente.
Alcune tecniche sopra descritte variano leggermente dai metodi stabiliti per creare il virus vaccinia ricombinante. Ad esempio, il MOI del virus utilizzato per creare ricombinanti è normalmente inferiore a 128, tuttavia l'uso di IBI più elevati è stato sufficiente per la creazione di virus vaccinia ricombinante con questo metodo. L'uso di reagenti di selezione GPT richiede normalmente la preincubazione delle cellule con reagenti diselezione 18,tuttavia aggiungendoli durante la fase di salvataggio post-infezione ha comunque fornito una selezione sufficiente dei ricombinanti desiderati, in particolare a causa della presenza di un marcatore di selezione fluorescente.
Come accennato in precedenza, uno dei limiti di questa tecnica è che la fase di selezione della fluorescenza secondaria si basa sul fatto che la proteina taggata di interesse sia altamente espressa, ad un livello che consente il suo rilevamento a occhio in un saggio di placca. Senza questo, sarebbe possibile purificare i virus che mostravano solo fluorescenza mCherry, di cui almeno il 50% conterrebbe i virus ricombinanti desiderati, che potrebbero essere identificati da strategie molecolari come la PCR descritta al precedente passaggio 2.12. Un'altra limitazione potrebbe essere l'inattivazione di alcune proteine come risultato del loro tagging. Il tag fluorescente può subire mutazioni o essere asportato dal virus ricombinante con passaging nel tempo. Pertanto, si raccomanda un campionamento regolare delle scorte di virus ricombinanti mediante microscopia e PCR. Infine, potrebbe esserci un limite al numero di proteine contrassegnate fluorescentmente che possono essere incorporate in un singolo virus. Un aspetto di questo è la capacità di visualizzarli tutti contemporaneamente; data la natura sovrapposta degli spettri di emissione dei tag fluorescenti disponibili, è importante selezionarli con attenzione per garantire un'esentata spettrale minima. Inoltre, l'uso di tag strettamente correlati come GFP e Cerulean apre la possibilità di ricombinazione tra i due, a seconda della loro posizione nel genoma ricombinante.
La natura modulare di questa tecnica consente la semplice sostituzione dei tag fluorescenti in base alla compatibilità con altre scelte di colorazione e/o tag. Con l'accisa di marcatori selezionabili, il metodo TDS consente l'aggiunta seriale di varie proteine fluorescenti o la combinazione di tagging basato su TDS con deezioni geniche basate su TDS per analisi fenotipiche29. Ad esempio per l'utilità di questo approccio, è stato generato un virus fluorescente a doppia taggazione che etichetta i nuclei dei virus e la membrana WV. Studi di imaging con questo virus potrebbero essere utilizzati per studiare il movimento, la morfogenesi e l'avvolgimento del virus durante la replicazione del virus. Ancora non caratteristiche vaccinia proteine virali possono anche essere taggati e studiati con questa tecnica.
Il virus vaccinia è stato ampiamente utilizzato negli studi di imaging a causa di molte caratteristiche del virus che sono favorevoli alla microscopia a cellule vive. I tag fluorescenti sono espressi dal genoma virale, eliminando la necessità di trasfezione, consentendo di analizzare facilmente le cellule primarie derivate da animali infetti o cellule non trasffetbili. Inizialmente, i VAV fluorescenti sono stati utilizzati per il semplice tracciamento subcellulare del movimento del virus30, ma approcci più recenti hanno ampliato la loro utilità per includere studi FRET31, FRAP a singole particelle di virus32, giornalisti promotori33,imaging intravitale34e studi strutturali35-37. Tutte queste tecniche potrebbero essere più facili e più vicine insieme a questo metodo per creare virus fluorescenti ricombinanti.

Il virus vaccinia (VACV) è il poxvirus prototipale e altamente correlato al virus della variola, l'agente causale del vaiolo. Entrambi questi virus sono membri del genere ortopox che include altri agenti patogeni degni di nota come monkeypox e virus ectromelia (toppox)1. Gli ortopoxvirus hanno grandi genomi di DNA a doppio filamento (180-220 kb) che codificano verso l'alto di 200 fotogrammi di letturaaperti previsti 2,3. La replicazione di questi virus comporta la formazione di una fabbrica di virus perinucleari, dove sono fatti virus maturi (MV), e la rete trans-Golgi dove un sottoinsieme di MV acquisisce due membrane aggiuntive per generare virus avvolti (WV) (esaminati da Roberts e Smith4). I genomi ortopox sono altamente suscettibili alla manipolazione genetica a causa dell'alto grado di ricombinazione genetica che è una caratteristica della replicazione del genoma VACV ed è mediato dalla DNA polimerasi virale5. La generazione di virus ricombinanti si basa sulla ricombinazione omologa e su molecole lineari di DNA con omologie di appena 12 bp sufficienti a mediare la ricombinazione nelle cellule infettate da virus vaccinia6. L'etichettatura fluorescente del virus vaccinia può produrre particelle di virus estremamente luminose a causa delle grandi dimensioni delle particelle di ortopox, che consente l'incorporazione di molte proteine fluorescenti pervirione 7. Vaccinia ha la capacità di trasportare grandi frammenti di DNAestraneo 8 e, inoltre, la mancanza di simmetria rigida del capsid può consentire un certo grado di flessibilità nell'esprimere fusioni geniche proteiche virali dal loro loci endogeno9. L'etichettatura fluorescente delle proteine VACV si è dimostrata preziosa per lo studio delle interazioni ospite-patogeno a livello subcellulare, in particolare nel campo dell'ingresso del virus10,del trasporto 11-13e della morfogenesi, in particolare dei virioni avvolti7.
I virus ricombinanti possono essere selezionati salvando un fenotipo di crescita attenuato14,15, selezione metabolica16-18o per espressione di un gene marcatore(ad esempio X-gal19 o proteinafluorescente 13,20). Qui descriviamo la selezione di virus fluorescenti utilizzando una potente combinazione di selezione fluorescente e metabolica. I vettori di selezione dominante transitoria (TDS), sviluppati da Faulkner e Moss (1990)21,consentono di integrare i marcatori insieme al gene di interesse contrassegnato fluorescentmente desiderato. Quando la selezione metabolica viene rimossa, può verificarsi un evento di ricombinazione secondario che asporta i geni di selezione, ma lascia intatta la proteina virale contrassegnata fluorescentmente. La figura 2 che segue fornisce una panoramica della procedura sperimentale. I geni di selezione utilizzati in questo studio sono mCherry e il gene Escherichia coli guanina fosforibosiltransferasi (gpt), entrambi espressi da un promotore virale sintetico precoce/tardivo e usati in precedenza da Cordeiro et al. 22 Inoltre, vi è fluorescenza della proteina di fusione taggata di interesse. Quando la selezione metabolica viene rimossa, i marcatori selezionabili (mCherry e gpt) vengono asportati, lasciando solo la fluorescenza del gene taggato, che consente l'identificazione dei virus ricombinanti corretti. L'escissione dei marcatori di selezione offre la possibilità di combinare più tag fluorescenti, consentendoci di creare virus con la capacità di etichettare fluorescentmente diverse proteine virali contemporaneamente. Studi precedenti hanno determinato i requisiti minimi di omologia per la ricombinazione vaccinia di molecole di DNA lineari e circolari trasfette in cellule infettate da virus vaccinia6. Volevamo determinare l'efficienza di ricombinazione di varie lunghezze di omologia dei bracci di fianco nel vettore TDS gpt-mCherry attraverso la sua incorporazione nel genoma virale di Vaccinia. È stato determinato che le regioni omologhe di 100 bp nel vettore TDS sono sufficienti per colpire e mediare l'inserimento del DNA ricombinante nel genoma VACV mediante ricombinazione omologa (Figura 4). Mentre lunghezze di omologia più piccole consentirebbero anche la ricombinazione, le lunghezze di omologia di 100 bp fornivano abbastanza virus ricombinanti che potevano essere facilmente identificati con la selezione metabolica e fluorescente. Frammenti di DNA di queste dimensioni possono essere sintetizzati commercialmente a costi relativamente bassi e facilitano notevolmente la produzione di più vettori per la creazione di virus ricombinanti. Abbiamo optato per aumentare la lunghezza dell'omologia a 150 bp per fornire una maggiore frequenza di ricombinazione mantenendo bassi i costi di sintesi della sequenza oligonucleotide delle regioni di fianco.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

L'etichettatura delle proteine virali con proteine fluorescenti ha dimostrato un approccio indispensabile per promuovere la nostra comprensione delle interazioni virus-ospite. Il virus Vaccinia (VACV), il vaccino vivo utilizzato nell'eradicazione del vaiolo, è particolarmente suscettibile di microscopia fluorescente a cellule vive grazie alle sue grandi dimensioni di virione e alla facilità con cui può essere progettato a livello genomico. Qui viene segnalato un protocollo ottimizzato per la generazione di virus ricombinanti. Sono stati determinati i requisiti minimi per la ricombinazione omologa mirata durante la replicazione della vaccinia, che consente la semplificazione della generazione di costrutti. Ciò ha permesso l'alleanza della selezione dominante transitoria (TDS) con un reporter fluorescente e la selezione metabolica per fornire un approccio rapido e modulare alle proteine virali fluorescenti. Semplificando la generazione di virus ricombinanti fluorescenti, siamo in grado di facilitare applicazioni downstream come l'analisi avanzata dell'imaging di molti aspetti dell'interazione virus-host che si verifica durante la replicazione dei virus.

Nella figura 1 sono elencati i vari costrutti necessari per questa procedura, sintetizzati (figure 1b e 1c) o creati mediante passaggi di clonazione (Figura 1d). La figura 2 fornisce un quadro della procedura sperimentale con immagini rappresentative della placca fluorescente di un VACV ricombinante A3-GFP raffigurato per ogni fase del processo di selezione. Nella figura 3vengono mostrati i virus della vaccinia ricombinante che esprimono proteine taggate con marcatori fluorescenti mirati alle proteine strutturali virali A3 e F13, che fanno parte rispettivamente del nucleo del virus interno23 e dell'involucroesterno 24. Vengono raffigurate osservazioni di placche virali e cellule infette per ciascuno dei virus ricombinanti creati. L'efficienza della ricombinazione omologa dei vettori con il genoma VACV, contenente fino a 70 regioni bp di omologia ad esso, è stata testata e i risultati sono raffigurati nella figura 4. Il relativo successo nell'identificare le placche virali fatte dalla ricombinazione con vettori contenenti omologia da 100 bp fu il ragionamento alla base della scelta di sintetizzare 150 bp di lunghezza a sinistra e a destra dei bracci di omologia al gene bersaglio.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figura 1. Vettore di ricombinazione TDS (Transient Dominant Selection). (a) Vettore TDS con marcatori di selezione gpt e mCherry. b) Ibracci di omologia sinistro e destro sono progettati con specifici siti di restrizione nel mezzo e affiancare i bracci di omologia. I siti di restrizione tra i bracci sinistro e destro usati in questo metodo erano NotI e BamHI, il sito NotI veniva anche usato come collegamento tra il gene e il tag fluorescente. (c) I tag fluorescenti compatibili con questo metodo sono affiancati da siti di restrizione corrispondenti. Alcuni tag utilizzati sono GFP (proteina fluorescente verde), RFP (proteina fluorescente rossa), Cerulean (un miglioramento sull'ECFP, una proteina fluorescente ciano, per mutagenesisite-directed 25) e mini-SOG, una proteina fluorescente progettata da GFP che crea un prodotto risolvibile da EM all'illuminazione26. (d) Fasi di clonazione coinvolte nella generazione del vettore finale di ricombinazione del TDS. L'oligonucleotide sintetizzato contenente i bracci laterali sinistro e destro viene prima clonato nel vettore TDS. Ciò fornisce un vettore di ricombinazione in cui qualsiasi tag di scelta può essere shuttleto in entrata e in uscita clonando nei siti di restrizione incorporati tra il braccio sinistro e quello destro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figura 2. Schema della procedura sperimentale per creare un virus vaccinia ricombinante. Sono raffigurati eventi che si verificano a livello genetico e cellulare, insieme a immagini rappresentative della placca che delineano i passaggi successivi alla creazione di un virus vaccinia fluorescente etichettato A3-GFP. (A) Le cellule infettate dal virus vaccinia sono trasfette dal vettore di ricombinazione del TDS. (B) In questa figura viene rappresentato solo il risultato della ricombinazione a sinistra e nell'esempio viene utilizzata la GFP come tag fluorescente preferito. La ricombinazione a destra comporterebbe l'incorpore dell'intero plasmide TDS nel genoma in modo simile, tranne per il fatto che il tag sarebbe fuso all'intero gene bersaglio nella fase intermedia, cioè al passaggio C. Un saggio di placca viene eseguito su un monostrato cellulare con la miscela di ricombinazione e sottoposto a selezione GPT. (C) Le placche che presentano fluorescenza sia rossa che verde, corrispondenti rispettivamente all'espressione mCherry e GFP, vengono raccolte e amplificate. Una volta rimossa la selezione, si rà una perdita di fluorescenza rossa corrispondente alla perdita dei geni gpt e mCherry (D) e le placche che presentano fluorescenza esclusivamente verde vengono raccolte e amplificate (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figura 3. Risultati rappresentativi del sistema di ricombinazione del TDS. Le immagini raffigurano intere placche di cellule ricombinanti che infettano il VACV dopo 48 ore(a, c, e ; barra di scala 100 μm), accompagnateda un'immagine di una singola cellula infettata dal corrispondente virus ricombinante dopo 8 ore(b, d, f; barra di scala 10 μm). I geni corrispondenti alle proteine localizzate al virione sono stati selezionati per visualizzare le particelle virali. A3 è una proteina fondamentale del virione vaccinia (a, b) e F13 (c, d) è una proteina virale dell'involucro. Viene inoltre mostrato un virus a doppia etichetta con etichetta fluorescente A3 e F13 (e, f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figura 4. Analisi quantitativa delle efficienze di ricombinazione tra vettori ricombinanti e genoma VACV. I monostrati BS-C-1 sono stati infettati da VACV e hanno trasfetto 1 ora dopo l'infezione con tre vettori di ricombinazione contenenti regioni di omologia di 500 bp, 100 bp o 70 bp al genoma VACV. Ogni vettore conteneva anche la cassetta TDS comprendente geni di selezione gpt e mCherry. Le cellule sono state recuperate 24 ore dopo l'infezione e lese per rilasciare i virus ricombinanti formatisi. I test di placca sono stati eseguiti su llysati cellulari con mezzi di selezione GPT e le placche che mostrano la fluorescenza mCherry sono state conteggiate come ricombinanti di successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figura 5. Mappa del vettore TDS gpt-mCherry che mostra il sito di clonazione multipla. Il vettore è stato descritto inprecedenza 22 e la mappa vettoriale è stata creata con l'aiuto di EZ Plasmid Map v1.9 dal Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins at JoVE.com

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  University of Sydney. Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.