وأود أن أشكر CL-ريتشاردز Zawacki لمساعدة تصور التصميم التجريبي والمساعدة مع المواد، A. Pessier لمساعدة إنشاء نظام العلاج والتشريح ويحلل، MWH شاتفيلد، MJ Robak، K. تاسكر وD. Lenger للمساعدة في المختبرات والدعم وM. مكفادين وP. هارلو في حديقة حيوان تارونغا لاستخدام الفضاء أثناء التصوير. وقد تم تمويل المشروع جزئيا من قبل وزارة ولاية لويزيانا من الحياة البرية والثروة السمكية من خلال منحة لجنة التعليم البيئي لويزيانا منحت لLA Brannelly وتقنيات الحياة.

الأخلاق الموافقة: تمت الموافقة على هذه الدراسة وأساليبها من خلال استخدام الحيوان والعناية جنة جامعة تولين في (البروتوكول لا 0407). 1. اختبار للعدوى دينار بحريني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينظف لدينار بحريني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات مسحة مع مسحة القطن المعقم خمس مرات على ventrum، خمس مرات على كل الفخذ، كل جانب، ولكل الأطراف لما مجموعه 45 السكتات الدماغية. ينظف هو أسلوب موسع لأخذ العينات للدينار بحريني على الجلد البرمائيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوب بلطف مسحة أثناء والسكتات الدماغية بين لضمان جمع أكبر قدر من الحمض النووي على مسحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر مسحات في 1.5 مل microtubes في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي وفحص QPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الجيني من مسحات باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي، وفقا لتعليمات لأنسجة الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الحمض النووي المستخرج باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QPCR) التالية بويل <eم&gt; وآخرون 17، مع إجراء التعديلات التالية: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع عينات استخراج الحمض النووي 1:10 مع الماء منزوع الأيونات مزدوجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.7 ميكرولتر من ألبومين المصل البقري (BSA) لمنع تثبيط PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشمل مراقبة إيجابية الداخلية في كل عينة لضمان وPCR تثبيط لا تؤثر النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تشغيل مع السيطرة الإيجابية والسلبية وسلسلة من المعايير لتقدير التخفيف بوغ حرك (العدوى) حمولة. </li></ol></li></ol> 2. تلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة دينار بحريني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرق تريبتون بإضافة 10 ز تريبتون إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، تعقيمها (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) وتترك لتبرد. مرة واحدة يتم تبريده الى 23 درجة مئوية، إضافة 1 مل البنسلين، الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو سلالة دينار بحريني (JEL411 من J. Longcore، معزولة عن Guabal، بنما من Phyllomedusa يمور) في مرق تريبتون لمدة سبعة أيام في 23 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بروث الثقافة وتريبتون لوحات أجار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل لوحات، إضافة 10 ز 10 ز تريبتون وأجار إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الخليط تعقيمها هو باردا بما فيه الكفاية للمس، ولكن قبل ذلك تجميده، تصب في أطباق بتري، 1/4-1/3 الكامل، في غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الاكرم أجار وتبرد تماما، إضافة 0.5 مل مرق دينار بحريني إلى كل لوحة وموزعة بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. السماح ليجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تلقيح لوحات مع zoospores دينار بحريني، لوحات الختم مع parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات لاحتضان عند 23 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام. تحقق بوغ حرك الحركة لضمان الجدوى قبل التلقيح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات الفيضانات لحل التلقيح بوغ حرك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5-7 أيام من الحضانة دينار بحريني والنمو، وإغراق كل لوحة مع 5 مل من ماء الصنبور العمر وتسمح zoospores للدخول وسائل الإعلام لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب suspe بوغ حركnsion في وعاء المحمولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويقدر تركيز بوغ حرك مع عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخليط إلى تركيز من 1 × 10 6 في 3 مل ماء الصنبور مع العمر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الفردي 50 مل الحاويات، وتطعيم كل حيوان بصب 3 مل مزيج اللقاح على ventrum لها. سماح اضافية لقيحة بالتنقيط في قاعدة الحاوية التلقيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستبقى كل حيوان في حاوية التلقيح لمدة 24 ساعة لضمان العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من التلقيح، والعودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح العدوى لبناء لمدة أسبوعين. تأكيد الإصابة مع مسحة والنتائج QPCR، وبدء العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضوابط BD-السلبية والفيضانات الحرة BD-لوحات أجار مع 5 مل الذين تتراوح أعمارهم بين ماء الصنبور، وتلقيح الحيوانات وهمية باستخدام نفس الأساليب على النحو الوارد أعلاه. </li></ol></li></ol> 3. العلاج حمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعداداتإعادة حمام العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.50 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى 1 L الحل رينغر البرمائيات (0.0025٪ الايتراكونازول - أدنى تركيز العلاج الفعال). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرمائيات رينغر الحل وصفة: 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، وكلوريد الصوديوم 6.6 جم، 0.15 جم كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 0.15 غرام، و 0.2 غرام بيكربونات الصوديوم. الحل الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل0.01٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 10.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل0.005٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 5.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضوابط BD-الإيجابية والسلبية BD-، والاستحمام الحيوانات في الحل رينغر البرمائيات مع عدم وجود الايتراكونازول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البرمائيات الفردية في تطهير الحاويات 50 مل مع 35 مل من محلول العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تغطية ضمان الحيوانات تماما لمدة خمس دقائق قبل يحوم بلطف الحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها. أكرر لمدة ستة أيام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان نجاح العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني على العلاج اليوم تبدأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني بعد أسبوع واحد التشطيبات العلاج، ومرة واحدة في الأسبوع وتطهيرها لمدة أربعة أسابيع لضمان العدوى. </li></ol></li></ol> 4. دينار بحريني لعائلة السلمان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسبوعية terraria الفردية تطهير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستحم الحاويات terraria والعلاج في 10٪ التبييض حمام الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف كل حاوية المبيضة مرتين مع المياه الجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الحاويات لتجف لمدة 24 ساعة قبل إعادة استخدامها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء القفازات عند التعامل مع النتريل نظيفة الحيوانات لمنع التلوث المتبادلدينار بحريني الممرض. تغيير القفازات بين التعامل مع كل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير جميع النفايات السائلة قبل التخلص منها من خلال جلب حل التبييض 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف جميع النفايات الصلبة التي من المحتمل ان تعرض لدينار بحريني قبل التخلص منها. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Wake, D. B., Vredenburg, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloquium+paper:+are+we+in+the+midst+of+the+sixth+mass+extinction?+A+view+from+the+world+of+amphibians.">Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians.</a> PNAS. 105, 11466-11473 (2008).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrolyte+depletion+and+osmotic+imbalance+in+amphibians+with+chytridiomycosis.">Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis.</a> Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).</li><li>Ramsey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+immune+defenses+against+Batrachochytrium+dendrobatidis:+A+war+between+host+and+pathogen.">Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen.</a> , (2011).</li><li>McMahon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+has+nonamphibian+hosts+and+releases+chemicals+that+cause+pathology+in+the+absence+of+infection.">Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection.</a> PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).</li><li>Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+chytridiomycosis+requires+urgent+clinical+trials.">Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials.</a> Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).</li><li>Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+temperature+as+a+treatment+for+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection+in+captive+frogs.">Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs.</a> Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).</li><li>Karbowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical-induced+megamitochondria+formation+and+apoptosis.">Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis.</a> Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).</li><li>Bishop, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+by+Archey's+frog+Leiopelma+archeyi.">Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi.</a> Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).</li><li>Pessier, A. P., Mendelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , (2009).</li><li>Page, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloramphenicol+1.+Hazards+of+use+and+the+current+regulatory+environment.">Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment.</a> Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).</li><li>Yoon, H. -. J., Seo, M. H., Kim, J. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).</li><li>Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+itraconazole+to+clean+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection,+and+subsequent+depigmentation+of+Alytes+muletensis+tadpoles.">Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles.</a> Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).</li><li>Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+with+itraconazole+as+a+treatment+for+chytrid+fungal+infections+in+amphibians.">Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians.</a> Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).</li><li>Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+chytridiomycosis+with+reduced-dose+itraconazole.">Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole.</a> Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+safe+antifungal+treatment+protocol+to+eliminate+Batrachochytrium+dendrobatidis+from+amphibians.">Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians.</a> Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).</li><li>Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+hydrochloride+in+ethanol+effectively+clears+Batrachochytrium+dendrobatidis+in+amphibians.">Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians.</a> J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).</li><li>Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloramphenicol+with+fluid+and+electrolyte+therapy+cures+terminally+ill+green+tree+frogs+(Litoria+caerulea)+with+chytridiomycosis.">Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis.</a> J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).</li></ol>

يعلن المؤلف لا المصالح المالية المتنافسة.

باستخدام هذا البروتوكول تمكنا من خفض بأمان وفعالية جرعة العلاج ووقت العلاج الايتراكونازول للدينار بحريني في البرمائيات. كان أقل جرعة العلاج والوقت (0.0025٪ لمدة ستة أيام) لعلاج ناجح لإصابة دون سريريا أولا nebulifer. فعالية كل جرعة أقل ووقت العلاج تدليل على الحاجة إلى إجراء تجارب العلاج السريري لعلاج العدوى دينار بحريني، كما أن هناك حاليا أي علاجات آمنة وفعالة لاستخدامها لجميع الأنواع والفئات العمرية من البرمائيات. سبب الوفاة الناتجة عن المعالجة الايتراكونازول غير معروف في هذه المرحلة 11. أجريت التشريح والتشريح المرضي على مجموعة فرعية صغيرة من الأفراد الذين لقوا حتفهم خلال أو بعد فترة وجيزة من فترة العلاج في الدراسة Brannelly وآخرون 15 آل. وكانت نتائج هذه التحليلات غير حاسمة لسبب الوفاة، على الرغم من أنه من الواضح أن أي حيوان ماتمن chytridiomycosis. وقع انحلال ذاتي المعتدل بين الموت والحفاظ على العينة، التي قد تؤثر على قدرتنا على كشف الفروق الدقيقة بين مجموعات العلاج. على الرغم من أن هذا البروتوكول يدعم وجود نظام آمن وفعال العلاج واحد، أكثر التجارب مثل هذا واحد تحتاج إلى أن تكون جارية. وقد أظهر العلاج آزول الثانية، voriconazole، أن تكون فعالة في واحد على الأقل من الأنواع 18. Voriconazole أكثر استقرارا في محلول الماء من يتراكونازول وثبت أن تكون آمنة للاستخدام الشرغوف 18. على الرغم من أن جرعة واحدة من العلاج يتراكونازول وvoriconazole متشابهة في التسعير، voriconazole هو أغلى بكثير للشراء من الايتراكونازول، مما يؤدي الباحثين ومديري أسيرة لاختيار الايتراكونازول أكثر انتظاما. في هذا الوقت، أظهرت دراسة نشرت احد فقط على نحو فعال من voriconazole 18. لإثبات فعالية، لا بد من محاكمتهم أكثر الأنواع. &lt;مضادات الفطريات ع الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; آزول تمثل نوع واحد من العلاج الكيميائي مضاد للفطريات التي تمنع نمو الفطريات 13. هناك أساليب العلاج الأخرى التي تهدف لقتل الممرض الفطرية بدلا من مجرد خفض النمو. قتل دينار بحريني في المختبر في درجات الحرارة فوق 28 درجة مئوية، والعلاج الحراري تهدف إلى قتل دينار بحريني في البشرة. هيدروكلوريد تيربينافين، وهو مضاد للفطريات البديلة التي نجحت في علاج العدوى دينار بحريني في بعض الأنواع 19، ويعمل من خلال التسبب في تحلل الخلايا الفطرية. مضادات الفطريات التي تهاجم مباشرة الممرض يمكن أن يكون العلاج أكثر نجاحا، ويحتاج الى مزيد من العمل الذي يتعين القيام به لاختبار خيارات العلاج واعدة للعدوى دينار بحريني. وقد تبين العلاج الايتراكونازول أن تكون فعالة في الحيوانات المصابة دون سريريا، ولكن تم علاج chytridiomycosis السريرية إلى حد كبير ناجحة. وقد عالج دراسة واحدة فقط حتى الآن 20 بنجاح عضال ط<html> البرمائيات ليرة لبنانية، والعلاج ينطوي على مزيج من العلاج العدوانية بالكهرباء والعلاج الكيميائي. وهناك حاجة إلى خيارات العلاج الناجح للحيوانات المرضى الميؤوس من شفائهم، وخاصة للحيوانات المهددة بالانقراض في المستعمرات الأسير حيث حماية كل فرد أمر ضروري لحفظ الأنواع. على الرغم من تخفيض جرعة العلاج ووقت كانت ناجحة للI. nebulifer، لم يتم محاكمتهم المعالجة على الأنواع أو غيرها من الحيوانات مع الالتهابات السريرية. بعض الأنواع ومراحل الحياة هي التعصب للعلاج الايتراكونازول، وذلك قبل تطبيق نظام العلاج على نطاق واسع، وينبغي على مديري الأسير العلاج المحاكمة في مجموعة فرعية صغيرة من الأفراد لتحديد سلامة وفعالية. اختبار الحيوانات المعالجة لمدة أربعة أسابيع على الأقل بعد الانتهاء من العلاج هو ضروري لضمان القضاء على العدوى مستوى منخفض 7، وينبغي أن تنفذ بعد كل نظام المعالجة. خيمة &quot;&gt; إنشاء خيارات علاج آمن وفعال للالتهابات دينار بحريني في الأولوية الأسير منطقة المستعمرات ضمان لجهود المحافظة على البرمائيات. الحفاظ دينار بحريني المستعمرات حرة أمر ضروري لنجاح جهود المحافظة والمستعمرات الأسير قد تكون شريان الحياة الوحيد للأنواع على شفا الانقراض .

البرمائيات تشهد حاليا أكبر انخفاض في التنوع البيولوجي من جميع الأصناف الفقارية 1. Chytridiomycosis، مرض جلدي الناجمة عن حيدة الخلية لدى الحيوانات الفطرية dendrobatidis الممرض Batrachochytrium (دينار بحريني)، هي واحدة من الأسباب الرئيسية لهذه الانخفاضات الدراماتيكية 2 دينار بحريني هو أسوأ الممرض على الاطلاق عن التسبب في فقدان التنوع البيولوجي: أن يصيب أكثر من 600 نوعا من البرمائيات وديه تسبب انخفاض في أكثر من 300 نوعا، منها أصبحت ما يصل الى 200 أنواع المهددة بالانقراض أو انقرضت 2،3. وحيدة الخلية لدى الحيوانات البرمائية الفطر لا تستضيف محددة وليس واضحا ما هي الصفات للمضيف السماح للعدوى دينار بحريني إلى التقدم المسببة للأمراض شديدة. Chytridiomycosis يسبب الوفاة عن طريق تعطيل القنوات الأيونية في الجلد، مما يؤدي إلى فقدان الكهارل وفشل القلب 4. أيضا، طاف دينار بحريني (لا تحتوي على zoospores دينار بحريني) يسبب استجابة مناعية في الضفادع الصغيرة 5 الشجريةز الباحثين إلى الاعتقاد دينار بحريني تنتج السمية من قبل المنتج 6. لأن العديد من الأنواع آخذة في الانخفاض بسرعة، المستعمرات ضمان الأسير وبرامج التربية هي التدابير الهامة الحفظ، ويمكن أن تكون شريان الحياة الوحيد بالنسبة لبعض الأنواع. إنشاء وصيانة المستعمرات خالية من المرض يشكل تحديا لإدارة المرافق البرمائيات. أساليب العلاج الكيميائي الحالي لعلاج الالتهابات دينار بحريني، على الرغم من فعالية، يمكن أن تكون ضارة للحيوانات يعالجون، وكانت لا توجد طريقة علاج واحد ناجح في كل أنواع وفئات العمر من البرمائيات 7. وقد أجريت التجارب السريرية قليلة من العلاجات لعدوى دينار بحريني 7. الطرق الثلاثة الأكثر شيوعا للعلاج هي العلاج الحراري، الكلورامفينيكول والايتراكونازول. العلاج الحراري هو خيار العلاج nonchemotherapeutic الذي يظهر لديهم آثار جانبية قليلة، ويمكن استخدامها على عدة مراحل الحياة، وينايرحليف فعالة. في محاكمة العلاج، وجدت شاتفيلد وريتشاردز-8 Zawacki أن 96٪ من الحيوانات المعالجة قد مسح العدوى بعد أن يقع في 30 درجة مئوية لمدة 10 يوما. على الرغم من أن هذه المحاكمة لم تكن ناجحة 100٪، فإنه يوفر الأساس للآخرين لتقييم العلاج الحراري للأنواع الخاصة بهم. العلاج الحراري، على الرغم من فعالية بالنسبة لكثير من الأنواع، وغير عملي لكثير من الأنواع جبال الألب التي لا يمكن أن تبقى في درجات حرارة عالية لفترة طويلة من الزمن. الكلورامفينيكول، وهو مضاد للجراثيم، وقد استخدمت بنجاح لعلاج دينار بحريني في كثير من الأنواع، ويمنع نمو الفطريات في المختبر. باعتبارها مضادة للجراثيم، والكلورامفينيكول لا يهاجم الفطر على وجه التحديد ولكن كان من المعروف أن يسبب موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة 9. وكان قد تردد أن العلاج يسبب موت الخلايا المبرمج الكلورامفينيكول في الجلد، مما أسفر عن مقتل مباغات داخل الخلايا، على الرغم من أن الآلية الدقيقة لعمل غير معروف. على الرغم من أنه لم يتم إجراء التجارب السريرية، وبالتاليلم يتم تقييم الجرعة ووقت العلاج، تتطلب بروتوكولات العلاج الحالية عادة غمر لمدة يومين أو أربعة أسابيع 10،11، مما يجعل هذا العلاج غير عملي لالبرمائيات الأرضية. كما تم تقييد الكلورامفينيكول في بعض البلدان للاستخدام البيطري لأن ارتبط التعرض البشري مع شكل نادر من فقر الدم اللاتنسجي 12. الايتراكونازول، وهو مضاد آزول، هو الأكثر استخداما على نطاق واسع لعلاج عدوى دينار بحريني في عام البرمائيات في الأسر. البروتوكول الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الحيوانات الاستحمام في حل الايتراكونازول 0.01٪ لمدة خمس دقائق في اليوم لمدة 11 يوما متتالية. وقد اشتق هذا البروتوكول من المعايير المستخدمة لإدارة الثدييات، و، في حين فعالة لالبرمائيات، لا يقوم على التجارب السريرية في البرمائيات 11،13. هذا البروتوكول يمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية في بعض الأنواع، وخاصة في جنس رنا والضفادع الصغيرة وmetamorphs الأخيرة 11.وقد كان العلاج الشرغوف ناجحة باستخدام تركيز أقل من ذلك بكثير (0.0005٪) من الايتراكونازول، ولكن كان مرتبطا مع تصبغ 14. تم محاكمتهم هذا نفس التركيز على metamorphs الأخيرة وجدت أن تنجح في علاج العدوى 15. لأن هناك خطر الآثار الجانبية السلبية مع العلاج الايتراكونازول، استخدمت بعض الممارسين نصف تركيز المعتادة (0.005٪) لمدة 11 يوما متتالية وجدت هذا أن تكون ناجحة في علاج الالتهابات دينار بحريني 16. هذه الدراسة هو ملخص لمحاكمة العلاج السريري باستخدام الايتراكونازول لعلاج العدوى دينار بحريني 15. يصف بروتوكول محاولة للعثور على أقل جرعة العلاج والوقت الذي هو على حد سواء آمنة وفعالة لعلاج الحيوانات المصابة دينار بحريني مع الايتراكونازول. كانت الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة metamorphs الأخيرة من الضفادع ساحل الخليج، Incilius nebulifer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="503">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox</td>
			<td style="width:147px;">Janssen Pharmaceutica Inc.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">NaCl</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">S640-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">KCl</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP366-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">CaCl2</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP510-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP328-500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:147px;">Medical and Wire Equipment</td>
			<td style="width:177px;">MW113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">1.5 ml micro tubes</td>
			<td style="width:147px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:177px;">73.703.217</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:177px;">69581</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">7500 Real-time PCR</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">4351104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">VIC IPC</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">4308323</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">BSA</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">AM2618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Agar</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">30391023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Tryptone</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">Q10029</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:177px;">CLS430589</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reduced itraconazole concentration and durations are successful in treating batrachochytrium dendrobatidis infection in amphibians

البرمائيات تواجه أكبر انخفاض من أي فئة الفقاريات والسبب الرئيسي لهذه الانخفاضات هو الممرض الفطرية، dendrobatidis Batrachochytrium (دينار بحريني)، والذي يسبب chytridiomycosis المرض. المستعمرات ضمان الأسير مهمة في جميع أنحاء العالم للأنواع المهددة والبرمائيات قد تكون شريان الحياة الوحيد لتلك الموجودة في التهديد الحرجة من الانقراض. الحفاظ على المستعمرات خالية من المرض هو من أولويات مديري الأسير، لم يتم تحديدها حتى الآن علاجات آمنة وفعالة لجميع الأنواع وعبر مراحل الحياة. العلاج الكيميائي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الايتراكونازول، على الرغم من أن الجرعة المستخدمة عادة يمكن أن تكون ضارة لبعض الأفراد والأنواع. أجرينا محاكمة العلاج السريري لتقييم ما إذا كانت الجرعة أقل وأكثر أمانا لكنها فعالة من الايتراكونازول يمكن العثور على علاج التهابات دينار بحريني. وجدنا أن طريق الحد من تركيز العلاج ،01-،0025٪ وتخفيض مدة العلاج من 11-6 أيام من 5 دقائق الحمامات، ويمكن علاجه الضفادع من عدوى دينار بحريني مع آثار جانبية أقل وأقل الوفيات المرتبطة العلاج.

واعتبر العلاج الايتراكونازول ناجحة إذا كانت جميع الحيوانات BD-سلبية بعد أربعة أسابيع انتهت العلاج. قبل العلاج بدأت، بعد أسبوعين من التلقيح، وأصيب جميع الحيوانات الملقحة دينار بحريني، مع حمولة بوغ حرك متوسط ​​1،121.7 (± 17.34)، بينما بعد أربعة أسابيع انتهت العلاج، وكان الحيوانات السيطرة BD-الإيجابية الحمل وسيلة من بوغ حرك 16،765.12 ( ± 14643.08). وكان علاج Incilius nebulifer (ن = 15) ناجحة باستخدام الحمامات في 0.0025٪ تركيز الايتراكونازول لمدة خمس دقائق في اليوم لمدة ستة أيام. لم هذا الدواء تركيز منخفض من العلاج الايتراكونازول لا تختلف اختلافا كبيرا في وفيات بالمقارنة مع الضوابط BD-الإيجابية (كوكس الانحدار: χ 2،1 = 2.17، إكسب (ب) = 20،500، ع = 0.339) (الشكل 1B)، وكثير من منهم على قيد الحياة حتى نهاية المحاكمة مع العدوى دينار بحريني. حمامات 0.0025٪ ط<html> traconazole لمدة 11 يوما، وكلا 0.005٪ و 0.0025٪ الايتراكونازول لمدة ستة أيام تم العثور على جميع لتكون فعالة وخيارات العلاج آمن (أرقام 1A و 1B). تركيز العلاج الموصى به ونصف هذا التركيز لفترة علاج 11 يوما زيادة كبيرة وفيات بالمقارنة مع الضوابط BD-الإيجابية (كوكس الانحدار: 0.01٪ الايتراكونازول χ 2،1 = 35.68، إكسب (ب) = 307.54، ف &lt;0.01؛ 0.005٪ الايتراكونازول χ 2،1 = 16.17، إكسب (ب) = 9.40 ، ف &lt;0.01) (الشكل 1A). علاج الايتراكونازول 0.01٪ لمدة 11 يوما تسبب وفيات 100٪ في I. nebulifer، ونصف هذا التركيز (0.005٪ الايتراكونازول لمدة 11 يوما) تسبب وفيات 60٪ (الشكل 1A). أجريت التشريح والتشريح المرضي لمجموعة فرعية صغيرة من الحيوانات التي نفقت خلال فترة العلاج. توفي أي حيوان في هذه الدراسة من chytridiomycosis. ن = صفحة &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51166/51166fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51166/51166fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. الاختلافات في البقاء على قيد الحياة في جميع أنحاء العلاجات الايتراكونازول 15 (A) Incilius nebulifer: 11 د العلاج (ن = 15 لكل تركيز الايتراكونازول من 0.01، 0.005، 0.0025 و٪، ن = 17 لمجموعة المراقبة BD-الإيجابية و n = 9 ل مجموعة مراقبة BD-سلبية). (B) I. nebulifer: 6 د العلاج (ن = 15 لكل تركيز الايتراكونازول من 0.01، 0.005 و0.0025٪، ن = 17 لمجموعة المراقبة BD-الإيجابية و n = 9 لمجموعة المراقبة السلبية BD-). السهام السوداء تشير إلى اليوم الأخير من العلاج. خطوط الصلبة تشير إلى بقاء مجموعات المراقبة (أسود = BD-الإيجابية، والرمادي = BD-سلبية). خطوط متقطعة تشير إلى بقاء مجموعات العلاج الايتراكونازول (النقاط رمادي فاتح = 0.01٪، نقاط رمادية متوسطة = 0.005٪، النقاط السوداء = 0.0025٪ الايتراكونازول). (تم تعديل هذا الرقم من 15 Brannelly آخرون، الشكل 1B و 1C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51166/51166fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians at JoVE.com

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

يمكن القضاء على العدوى dendrobatidis Batrachochytrium في البرمائيات باستخدام التركيز المنخفض (0.0025٪) ومدة أقصر (الحمامات خمس دقائق لمدة ستة أيام) من الايتراكونازول من يستخدم عادة. وقد لوحظت أقل وفيات وعدد أقل من الآثار الجانبية السلبية باستخدام هذا البروتوكول العلاج تعديلها.

انخفاض تركيز إتراكونازول والآماد ناجحة في علاج<em&gt; dendrobatidis Batrachochytrium</em&gt; عدوى في البرمائيات

Amphibians are experiencing the greatest decline of any vertebrate class and a leading cause of these declines is a fungal pathogen, Batrachochytrium ...

reduced-itraconazole-concentration-durations-are-successful-treating

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

11.5K Views.  James Cook University.  يمكن القضاء على العدوى dendrobatidis Batrachochytrium في البرمائيات باستخدام التركيز المنخفض (0.0025٪) ومدة أقصر (الحمامات خمس دقائق لمدة ستة أيام) من الايتراكونازول من يستخدم عادة. وقد لوحظت أقل وفيات وعدد أقل من الآثار الجانبية السلبية باستخدام هذا ?...

Video: Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

تحليل نظائرها حمض الأيوفينوكسيك في النمس الهندي الصغير (الهربساتوبوتوس)سيرا لاستخدامها كعلامة بيولوجية التطعيم داء الكلب عن طريق الفم

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple centers. The challenges of using two flow cytometers in different labs include the lack of standardized materials, software compatibility issues, inconsistencies in instrument setup, and the use of different configurations for different flow cytometers. To establish a standardized flow cytometry experiment to achieve the consistency and comparability of experimental results across multiple centers, a rapid and feasible standardization method was established to transfer parameters across different flow cytometers. 
The methods developed in this study allowed the transfer of experimental settings and analysis templates between two flow cytometers in different laboratories for the detection of lymphocytes in Japanese encephalitis (JE)-vaccinated children. A consistent fluorescence intensity was obtained between the two cytometers using fluorescence standard beads to establish the cytometer settings. Comparable results were obtained in two laboratories with different types of instruments. Using this method, we can standardize analysis for evaluating the immune function of JE-vaccinated children in different laboratories with different instruments, diminish the differences in data and results among flow cytometers in multiple centers, and provide a feasible approach for the mutual accreditation of laboratory results. The standardization method of flow cytometer experiments will ensure the effective performance of research projects across multiple centers.

In this study, a method was developed to facilitate the transfer of experimental settings and analysis templates between two flow cytometers in two laboratories for the detection of lymphocytes in Japanese encephalitis-vaccinated children. The standardization method for the flow cytometer experiments will allow research projects to be effectively conducted in multiple centers.

توحيد النقل عبر المختبرات بين أجهزة قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...