אני רוצה להודות לCL ריצ&#39;רדס-זאוואצקי לעזרת המשגה תכנון הניסוי וסיוע עם חומרים, א Pessier לעזרת הקמת משטר טיפול ונתיחה לאחר מות ניתוחים, MWh Chatfield, MJ Robak, ק טסקר וד &#39;לנגר לעזרה ב מעבדה ותמיכה ומ &#39;מקפאדן ופ הארלו בגן החיות Taronga לשימוש במרחב שלהם במהלך צילומים. הפרויקט מומן בחלקו על ידי מחלקת לואיזיאנה של חיות הבר ודיג באמצעות מענק ועדת החינוך הסביבתי לואיזיאנה העניק ללוס אנג&#39;לס Brannelly ועל ידי חיים טכנולוגיים.

אישור אתיקה: מחקר זה והשיטות שלה אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת טוליין שימוש בבעלי חיים ובטיפול (פרוטוקול לא 0407.). 1. בדיקות לזיהום Bd <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניקוי עבור BD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים ספוגית עם מקלון צמר גפן סטרילי חמש פעמים בventrum, חמש פעמים בכל ירך, מכל צד, וכל איבר בסכום כולל של 45 שבץ. בניקוי הוא שיטה לא פולשנית של דגימה עבור BD על עור של דוחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב את ספוגית בזמן ובין שבץ על מנת להבטיח את הכמות הגדולה ביותר של ה-DNA שנאספה בספוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטליות חנות ב1.5 מיליליטר microtubes ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת DNA וassay qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-DNA הגנומי מהמטליות באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי, בהתאם להוראות לרקמות בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את ה-DNA שחולץ באמצעות זמן אמת PCR (qPCR) הבאה בויל <eמ &#39;&gt; אח&#39; 17, בשינויים הבאים.: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות מיצוי DNA 1:10 עם מים כפולים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.7 μl של אלבומין בסרום שור (BSA) על מנת למנוע עיכוב ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל שליטה פנימית חיובית בכל דגימה כדי להבטיח עיכוב PCR לא משפיע על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ עם ביקורת חיובית ושלילית ושורה של סטנדרטים דילול להעריך עומס zoospore (זיהום). </li></ol></li></ol> 2. חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Bd <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מרק tryptone ידי הוספת tryptone 10 גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, autoclaved (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות) ונותנת לו להתקרר. ברגע שהתקרר ל23 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זן BD (JEL411 מג&#39; Longcore, מבודד מGuabal, פנמה ממור Phyllomedusa) במרק tryptone במשך שבעה ימים ב23 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את bרוט התרבות לtryptone וצלחות אגר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את הצלחות, להוסיף 10 tryptone גרם ו10 אגר גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized וחיטוי (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתערובת autoclaved הוא מגניב מספיק כדי לגעת, אבל, לפני שהוא נקרש לשפוך לתוך צלחות פטרי, 1/4-1/3 מלאים, בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אגר נקרש והתקררתי לחלוטין, להוסיף 0.5 מיליליטר מרק Bd לכל צלחת ולהתפשט באופן שווה סביב הצלחת. לאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות מחוסנת עם zoospores BD, צלחות חותם עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות לדגירה על 23 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. בדוק zoospore תנועה כדי להבטיח את הכדאיות לפני החיסון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מבול לפתרון חיסון zoospore <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חמישה עד שבעה הימים של הדגירה Bd וצמיחה, להציף כל צלחת עם 5 מיליליטר של מים ברז בגילים ולאפשר zoospores להיכנס לתקשורת ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את suspe zoosporension לתוך מיכל נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעריך ריכוז zoospore עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תערובת לריכוז של 1 x 10 6 ל3 מיליליטר עם מי ברז בגילים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן חיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב50 מיליליטר מכלים נפרדים, לחסן כל חיה על ידי שפיכת 3 תערובת הבידוד מיליליטר מעל ventrum. אפשר לבידוד נוסף כדי לטפטף לתוך הבסיס של מיכל החיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל בעל חיים יישארו במכל חיסון ל24 שעות כדי להבטיח זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של חיסון, להחזיר חיות לTerraria חיטוי הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זיהום לבנות במשך שבועיים. לאשר זיהום עם ספוגית ותוצאות qPCR, ולהתחיל בטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים BD-שליליים, צלחות אגר מבול BD-חופשי עם 5 מיליליטר בגילי מים ברז, ולחסן מדומה בעלי החיים משתמשים באותן השיטות כאמור לעיל. </li></ol></li></ol> 3. טיפול משטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשיריםמחדש אמבטיה טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.50 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון 1 של L אמפיבי רינגר (itraconazole 0.0025% - ריכוז הטיפול היעיל הנמוך ביותר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתכון של דוחי רינגר פתרון: אוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, נתרן כלורי 6.6 גרם, 0.15 אשלגן כלורי גרם, 0.15 כלוריד הסידן גרם, ו0.2 סודיום ביקרבונט גרם. פתרון החיטוי (C ° 121 ל40 דקות) ולהתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל0.01% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף itraconazole 10.00 מיליליטר מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל0.005% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף 5.00 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים BD-חיוביים ו-BD-שליליים, לרחוץ בעלי חיים בפתרון של אמפיבי רינגר ללא itraconazole. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דו חיים בודדים ב50 מיליליטר מכולות לחטא עם 35 מיליליטר של פתרון הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים להבטיח מכוסים במלואן במשך חמש דקות על ידי בעדינות מתערבל מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר חיות לTerraria חיטוי. חזור על פעולה במשך שישה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את הצלחה של טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים מבחן לזיהום Bd על טיפול היום מתחילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מבחן לזיהום Bd שבוע לאחר סיום טיפול, ופעם בשבוע במשך ארבעה שבועות כדי להבטיח זיהום יש פינה. </li></ol></li></ol> 4. BD כBiohazard <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא שבועי Terraria בודד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחץ מכולות Terraria וטיפול ב10% אמבטיה פתרון אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל מיכל מולבן פעמיים עם מים זורמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מכולות להתייבש במשך 24 שעות לפני שימוש חוזר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש כפפות nitrile נקיות בעת טיפול בבעלי חיים על מנת למנוע זיהום צולבשל הפתוגן Bd. שינוי כפפות בין טיפול בכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את כל הפסולת נוזלית לפני סילוק על ידי הבאת הפתרון לאקונומיקת 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי כל הפסולת מוצקה כי הוא עלול להיות חשוף לBd לפני הסילוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Wake, D. B., Vredenburg, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloquium+paper:+are+we+in+the+midst+of+the+sixth+mass+extinction?+A+view+from+the+world+of+amphibians.">Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians.</a> PNAS. 105, 11466-11473 (2008).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrolyte+depletion+and+osmotic+imbalance+in+amphibians+with+chytridiomycosis.">Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis.</a> Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).</li><li>Ramsey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+immune+defenses+against+Batrachochytrium+dendrobatidis:+A+war+between+host+and+pathogen.">Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen.</a> , (2011).</li><li>McMahon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+has+nonamphibian+hosts+and+releases+chemicals+that+cause+pathology+in+the+absence+of+infection.">Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection.</a> PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).</li><li>Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+chytridiomycosis+requires+urgent+clinical+trials.">Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials.</a> Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).</li><li>Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+temperature+as+a+treatment+for+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection+in+captive+frogs.">Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs.</a> Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).</li><li>Karbowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical-induced+megamitochondria+formation+and+apoptosis.">Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis.</a> Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).</li><li>Bishop, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+by+Archey's+frog+Leiopelma+archeyi.">Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi.</a> Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).</li><li>Pessier, A. P., Mendelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , (2009).</li><li>Page, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloramphenicol+1.+Hazards+of+use+and+the+current+regulatory+environment.">Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment.</a> Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).</li><li>Yoon, H. -. J., Seo, M. H., Kim, J. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).</li><li>Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+itraconazole+to+clean+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection,+and+subsequent+depigmentation+of+Alytes+muletensis+tadpoles.">Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles.</a> Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).</li><li>Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+with+itraconazole+as+a+treatment+for+chytrid+fungal+infections+in+amphibians.">Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians.</a> Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).</li><li>Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+chytridiomycosis+with+reduced-dose+itraconazole.">Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole.</a> Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+safe+antifungal+treatment+protocol+to+eliminate+Batrachochytrium+dendrobatidis+from+amphibians.">Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians.</a> Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).</li><li>Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+hydrochloride+in+ethanol+effectively+clears+Batrachochytrium+dendrobatidis+in+amphibians.">Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians.</a> J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).</li><li>Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloramphenicol+with+fluid+and+electrolyte+therapy+cures+terminally+ill+green+tree+frogs+(Litoria+caerulea)+with+chytridiomycosis.">Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis.</a> J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).</li></ol>

המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

שימוש בפרוטוקול זה היינו יכול בצורה בטוחה ויעיל להפחית את מינון טיפול ובזמן טיפול itraconazole עבור BD ב דו חיים. המינון הנמוך ביותר לטיפול והזמן (0.0025% במשך שישה ימים) היה טיפול מוצלח לט הנגוע subclinically nebulifer. היעילות של שני מינונים נמוכים יותר וזמן טיפול להדגים א...

דו חיים כיום חווים את הירידה הגדולה ביותר במגוון הביולוגי של כל מיני חוליות 1. Chytridiomycosis, מחלת עור הנגרמת על ידי פטריית dendrobatidis chytrid Batrachochytrium הפתוגן (BD), היא אחד מהגורמים העיקריים לירידות הדרמטיות הללו 2 BD הוא פתוגן הגרוע ביותר על שיא בגרימת אובדן מגוון ביולוגי:. זה מדביק מעל 600 מינים של דו חיים ויש לו גרם לירידות בלמעלה -300 מינים, מתוכם רבים ככל 200 מינים הפכו בסכנת הכחדה או שנכחד 2,3. פטריית chytrid דוחי לא לארח ספציפית ולא ברור מה איכויות של המארח לאפשר לזיהום Bd להתקדם ולגרום למחלות קשות. Chytridiomycosis גורם למוות ע&quot;י שיבוש תעלות יונים בעור, וכתוצאה מכך אובדן אלקטרוליטים ואי ספיקת לב 4. כמו כן, supernatant Bd (לא מכיל zoospores BD) גורם לתגובה חיסונית בראשנים 5 leadinחוקרים גרם להאמין Bd מייצר רעיל תוצר 6. מכיוון שמינים רבים הם במהירות בירידה, מושבות אבטחה בשבי ותוכניות רבייה הן אמצעי שימור חשוב, ועשויות להיות חבל ההצלה רק לכמה מינים. הקמת ותחזוקה של מושבות ללא מחלה היא אתגר עבור מתקני דוחי ניהול. השיטות כימותרפיות הנוכחיות לטיפול בדלקות BD, למרות יעיל, יכולות להזיק לבעלי החיים שטופלו, ואין שיטת טיפול אחת הייתה מוצלחת בין זנים וסוגים של דו חיים גיל 7. מספר מחקרים קליניים של טיפולים לזיהום Bd בוצעו 7. שלוש שיטות הנפוצות ביותר של טיפול הן טיפול בחום, כלורמפניקול וitraconazole. טיפול בחום הוא אפשרות טיפול nonchemotherapeutic שנראה שיש מעט תופעות לוואי, ניתן להשתמש בם בשלבי חייו מרובים, והוא generברית יעילה. בניסוי טיפול, Chatfield וריצ&#39;רדס-זאוואצקי 8 מצאו כי 96% מבעלי החיים שטופלו פינו זיהומים לאחר ששוכן ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים. למרות שהמשפט הזה לא היה 100% מוצלח, זה מספק בסיס לאחרים כדי להעריך טיפול בחום למיניהם. טיפול בחום, אם כי יעיל למינים רבים, אינו מעשי עבור מינים רבים אלפיני שלא יכול להישאר בטמפרטורות גבוהות לזמן ממושך. כלורמפניקול, אנטיבקטריאלי, שמש בהצלחה לטיפול בBd במינים רבים, ומעכב את צמיחת פטרייה במבחנה. כאנטיבקטריאלי, כלורמפניקול לא לתקוף את הפטרייה באופן ספציפי, אבל כבר ידוע לגרום לאפופטוזיס בתאי אוקריוטים 9. זה כבר העריך כי טיפול כלורמפניקול גורם אפופטוזיס בעור, הרג המנבגים תאיים, למרות שמנגנון פעולה המדויק אינו ידוע. למרות שאף ניסוי קליני כבר נערך, ולכןמינון וזמן טיפול לא הוערכו, פרוטוקולי טיפול הנוכחיים בדרך כלל דורשים טבילה לשבועות עד ארבעה שבועות 10,11, מה שהופך את הטיפול הזה מעשי עבור דו חיים יבשתיים. כלורמפניקול גם היה מוגבל במדינות מסוימות לשימוש וטרינרים כי חשיפה של בני אדם נמצאת קשורה לצורה נדירה של אנמיה אפלסטית 12. Itraconazole, פטריות azole, היא בשימוש נרחב ביותר לטיפול בזיהום בBd דו חיים בשבי. הפרוטוקול הנפוץ ביותר הוא חיות רחצה בפתרון itraconazole 0.01% במשך חמש דקות ביום במשך 11 ימים רצופים. פרוטוקול זה נגזר מסטנדרטים המשמשים לניהול של יונקים, ו, בעוד יעיל לדו חיים, הוא אינו מבוסס על ניסויים קליניים בדו חיים 11,13. פרוטוקול זה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות במינים מסוימים, במיוחד בסוג רנא ובראשנים וmetamorphs האחרון 11.טיפול ראשן היה מוצלח באמצעות ריכוז נמוך בהרבה (0.0005%) של itraconazole, אבל היה קשור עם depigmentation 14. ריכוז זהה זה trialed על metamorphs האחרון ונמצא כי הוא נכשל בטיפול בזיהום 15. מכיוון שקיימת סיכון לתופעות לוואי שלילי עם טיפול itraconazole, כמה מתרגלים השתמשו מחצית הריכוז הרגיל (0.005%) ל11 ימים רצופים ומצאו את זה כדי להיות מוצלח בריפוי דלקות Bd 16. המחקר הנוכחי הוא סיכום של ניסוי קליני לטיפול באמצעות itraconazole לטיפול בזיהום Bd 15. הפרוטוקול מתאר ניסיון למצוא את הזמן וטיפול במינון הנמוך ביותר שהוא גם בטוח ויעיל לטיפול בבעלי חיים נגועים Bd עם itraconazole. בעלי חיים המשמשים במחקר זה היו metamorphs האחרון של קרפדות חוף מפרץ, Incilius nebulifer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="503">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox</td>
			<td style="width:147px;">Janssen Pharmaceutica Inc.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">NaCl</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">S640-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">KCl</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP366-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">CaCl2</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP510-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:177px;">BP328-500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Sterile cotton swabs</td>
			<td style="width:147px;">Medical and Wire Equipment</td>
			<td style="width:177px;">MW113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">1.5 ml micro tubes</td>
			<td style="width:147px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:177px;">73.703.217</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:179px;">Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:177px;">69581</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">7500 Real-time PCR</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">4351104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">VIC IPC</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">4308323</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">BSA</td>
			<td style="width:147px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:177px;">AM2618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Agar</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">30391023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Tryptone</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">Q10029</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:179px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:177px;">CLS430589</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reduced itraconazole concentration and durations are successful in treating batrachochytrium dendrobatidis infection in amphibians

דו חיים חווים את הירידה הגדולה ביותר מכל סוג חוליות וגורם מוביל לירידות אלה הוא הפתוגן פטרייתי, dendrobatidis Batrachochytrium (BD), מה שגורם chytridiomycosis המחלה. מושבות הבטחה השבויה חשובות בעולם עבור מיני דוחי מאוימים ועשויות להיות חבל ההצלה רק לאלה באיום קריטי של הכחדה. שמירה על מושבות ללא מחלה היא בראש סדר עדיפויות של מנהלים בשבי, עדיין טיפולים יעילים ובטוחים לכל מינים ובכל שלבי חיים לא זוהו. הטיפול הכימותרפי בשימוש נרחב ביותר הוא itraconazole, אם כי המינון נפוץ יכול להזיק לאנשים מסוימים ומינים. ביצענו ניסוי טיפול קליני להעריך האם מינון נמוך יותר ובטוח יותר, אך אפקטיבי של itraconazole אפשר היה לציין לרפא זיהומי Bd. מצאנו כי על ידי הפחתת ריכוז הטיפול .01-.0025% וצמצום משך הטיפול מ11ימים -6 5 אמבטיות דקות, צפרדעים יכולים להירפא של זיהום Bd עם תופעות לוואי ותמותה הקשורים לטיפול פחות פחות.

טיפול Itraconazole נחשב מוצלח אם כל בעלי החיים היו BD-שליליים ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים. לפני הטיפול החל, כשבועיים לאחר החיסון, כל בעלי החיים מחוסן-BD היו נגועים, עם מטען ממוצע zoospore של 1,121.7 (± 17.34), בעוד ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים, חיות בקרת BD-החיוביות ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians at JoVE.com

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

זיהום dendrobatidis Batrachochytrium בדו חיים ניתן למנוע באמצעות ריכוז מופחת (0.0025%) ומשך זמן קצר יותר (אמבטיות של חמש דקות לשישה ימים) של itraconazole מ משמשים בדרך כלל. תמותה ותופעות לוואי שלילי פחות פחות נצפו באמצעות פרוטוקול טיפול שונה זה.

ריכוז Itraconazole מופחת ומשכים מצליחים בטיפול<em&gt; Dendrobatidis Batrachochytrium</em&gt; זיהום בדו

Amphibians are experiencing the greatest decline of any vertebrate class and a leading cause of these declines is a fungal pathogen, Batrachochytrium ...

reduced-itraconazole-concentration-durations-are-successful-treating

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

11.5K Views.  James Cook University.  זיהום dendrobatidis Batrachochytrium בדו חיים ניתן למנוע באמצעות ריכוז מופחת (0.0025%) ומשך זמן קצר יותר (אמבטיות של חמש דקות לשישה ימים) של itraconazole מ משמשים בדרך כלל. תמותה ותופעות לוואי שלילי פחות פחות נצפו באמצעות פרוטוקול טיפול שונה זה. 

Video: Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

ניתוח של חומצה והידרוקסימית מקבילים בנמייה הודית קטנה (הרבלס) סרה לשימוש בתור חיסון בעל פה כלבת מרקר ביולוגי

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple centers. The challenges of using two flow cytometers in different labs include the lack of standardized materials, software compatibility issues, inconsistencies in instrument setup, and the use of different configurations for different flow cytometers. To establish a standardized flow cytometry experiment to achieve the consistency and comparability of experimental results across multiple centers, a rapid and feasible standardization method was established to transfer parameters across different flow cytometers. 
The methods developed in this study allowed the transfer of experimental settings and analysis templates between two flow cytometers in different laboratories for the detection of lymphocytes in Japanese encephalitis (JE)-vaccinated children. A consistent fluorescence intensity was obtained between the two cytometers using fluorescence standard beads to establish the cytometer settings. Comparable results were obtained in two laboratories with different types of instruments. Using this method, we can standardize analysis for evaluating the immune function of JE-vaccinated children in different laboratories with different instruments, diminish the differences in data and results among flow cytometers in multiple centers, and provide a feasible approach for the mutual accreditation of laboratory results. The standardization method of flow cytometer experiments will ensure the effective performance of research projects across multiple centers.

In this study, a method was developed to facilitate the transfer of experimental settings and analysis templates between two flow cytometers in two laboratories for the detection of lymphocytes in Japanese encephalitis-vaccinated children. The standardization method for the flow cytometer experiments will allow research projects to be effectively conducted in multiple centers.

סטנדרטיזציה של העברה בין מעבדות בין ציטומטרים של זרימה לאיתור לימפוציטים בדלקת המוח היפנית ילדים מחוסנים

An increasing number of laboratories need to collect data from multiple flow cytometers, especially for research projects performed across multiple ...