فإن الكتاب أود أن أشكر H. اوليفاريس وD. روج لإجراء مناقشات قيمة والمشورة. وأيد هذا البحث في جزء من جائزة SBIR NSF (IIP-1127245 لBioSentinel شركة) وعقد وزارة الدفاع (W81XWH-07-2-0045 لBioSentinel شركة).

FM دانينغ، TM ساحة، F. Zeytin، ومرحاض تاكر هم موظفون أو أصحاب BioSentinel شركة BioSentinel حاليا بتصنيع وتسويق بعض الكواشف الواردة في هذا التقرير.

يصف هذا البروتوكول إجراءات لقياس بونت / مجمع، holotoxin، أو كلوستريديوم الثقافة طاف في مصفوفات معقدة. البروتوكول هو نفسه، ومع ذلك، عند اختبار الأنماط المصلية الأخرى بونت (بونت مثل / B، E، F و) مع المقايسات الخاصة ماتريكس منها 56،60، على الرغم من حساسية الفحص سو...

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ 1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك 3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية 6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات (فخ) البروتينات اللازمة لحويصلة الانصهار، مما يعوق الافراج عن العصبي ويؤدي إلى الشلل الرخو 7-14. والمعروف باسم مرض &quot;التسمم الغذائي&quot;، شلل الحجاب الحاجز والعضلات الوربية التي كتبها بونت يؤدي في النهاية إلىوردت فشل الجهاز التنفسي والموت ما لم التشخيص المبكر والعلاج. ويرتبط المنقولة بالغذاء الإنسان التسمم الغذائي الأكثر شيوعا مع بونت الأنماط المصلية A، B، E، F و(بونت / A، بونت / B، الخ) وعادة ما ينتج عن تناول الأغذية الملوثة 15،16، على الرغم من، العديد من حالات التسمم الغذائي الجرح ولم يبلغ عن وبين متعاطي المخدرات عن طريق الحقن الوريدي 17،18. في الولايات المتحدة، والتسمم الرضع الناتجة عن ابتلاع الجراثيم كلوستريديوم من قبل الأطفال الذين تقل أعمارهم عن واحد هو الشكل الأكثر شيوعا من التسمم الغذائي 19-21. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن تفشي المنقولة بالغذاء بونت الناتجة عن غير لائق تعليب المنزل وتجهيز الأغذية في كل من الولايات المتحدة والخارج. بين 2000-2009، تم الإبلاغ عن 338 حالة على الأقل من التسمم المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك ستة قتلى 22. القدرة بسرعة وحساسية للكشف عن تفشي التسمم الغذائي المنقولة عن طريق الأغذية هو مؤشر الحرجة التي يمكن أن تساعد التشخيص المبكر 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الكشف التي تسمح فعالة من حيث التكلفة واختبار الأغذية الروتينية تؤدي إلى تحسين الأمن الغذائي. خصوصية بونت في الخلايا العصبية وطويلة العمر النصفي البيولوجي أيضا يجعلها العلاجية القوية. في الولايات المتحدة، يتم الموافقة على المخدرات استنادا بونت من قبل إدارة الغذاء والدواء لعلاج الحالات مستحضرات التجميل والاضطرابات العصبية والعضلية ذات الصلة بما في ذلك خطوط المقطب، خلل التوتر عنق الرحم، والصداع النصفي، وفرط نشاط المثانة، والحول. يتم توثيق العديد من التطبيقات &quot;غير الرسمي&quot;، بما في ذلك العلاجات جرعة عالية لضعف شديد في العضلات 25-28. دقيقة السم الكمي هو أمر حاسم لالجرعات الصحيحة، كما underdosing قد يؤدي إلى العلاج غير فعال بينما الجرعة الزائدة يضع المرضى المعرضين لخطر الآثار الجانبية الضارة المحتملة. للأسف، يتم تقاسم أي بروتوكول رجولية فحص موحدة عبر الشركات المصنعة، مما أدى إلى عدم المساواة بين الم Ù حدة تعريف المخدرات استنادا بونت-سنت 29-31. معيار اختبار لبونت هو الأحيائي الماوس التي يتم حقن عينات بونت التي تحتوي على الغشاء البريتونى في الفئران وأعداد الوفيات المسجلة خلال 1-7 أيام 16،32،33. الأحيائي الماوس حساس جدا مع حدود الكشف (اللد) من 5-10 خريج بونت / A 34، ولكن المخاوف الأخلاقية على استخدام الحيوانات، والتكلفة العالية لتدريب الموظفين والحفاظ على مرافق الحيوان، مرات الفحص طويلة، وعدم وجود أدت بروتوكولات موحدة في المكالمات لتطوير موحدة، خالية من الحيوان بونت الاختبار وطرق القياس الكمي 35-39. مؤخرا، تم تطوير عدة أساليب القياس الكمي بونت البديلة التي توفر الماوس أو شبه الماوس الأحيائي حساسية 40-49. هذه الأساليب عادة ما تستخدم مضان، مطياف الكتلة، أو أساليب المناعية وتقديم مرات الفحص أقصر بكثير من الماوس الأحيائي بدون استخدام الحيوانات. مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع النهج techniq المناعيةعرضت شركة نظام الطاقة الموحد لكشف وتحديد بونت الواردة في المواد الغذائية وعينات أخرى معقدة، ولكن، ومتطلبات تدريب الموظفين والحد من المعدات المتخصصة هذه المقايسات 50-55. معظم فحوصات أخرى بديلة غير قابلة للتطبيق بسهولة لاختبار عينة معقدة أو تفتقر إلى الإنتاجية المطلوبة للاختبار الروتيني بونت. طبيعة متغير بدرجة كبيرة من اللزوجة عينة الغذاء، ودرجة الحموضة ومحتوى الملح، ومكونات المصفوفة يمثل تحديا صعبا خصوصا عندما تحاول تطوير أساليب الفحص في المختبر مع حساسية لتتناسب مع قوة متطرفة من بونت. وعلاوة على ذلك، حتى الأنظمة الوقائية بسيطة وحميدة نسبيا، مثل تلك الناجمة عن إعادة تعليق من المنتجات القائمة على المخدرات بونت، تحتوي على الملح، والزلال، والسكر مثبتات (أي السواغات) التي تؤثر بشكل كبير في المختبر بونت رجولية 56. مطلوب تنقية السم لاختبار دقة النشاط من جميع ولكن أبسط من عينات 56-59. الوقد صممت BoTest المقايسات مصفوفة لالسريع، والإنتاجية العالية، وتقدير ثابت من بونت من عينات معقدة للغاية باستخدام المعدات التي توجد عادة في مختبرات البحوث 56،60. هذه المقايسات استخدام حبات ممغطس مرتبطة تساهميا لالمصلي محددة الأجسام المضادة للبونت لربط وعزل بونت من عينة ثم قم بإزالة التدخل مركبات المصفوفة عن طريق الغسيل. بعد الغسيل، ثم يتم كميا المقيدة النشاط بروتين بونت في رد فعل العازلة الأمثل باستخدام مراسل متوافقة مع النمط المصلي بونت التي يجري اختبارها. هذه هي بروتينات صحفيين الفلورة تتكون من السماوي N-محطة البروتين الفلوري (CFP) شاردة وبروتين فلوري الصفراء المشتقة-C محطة (فينوس) شاردة ويربطها به الركيزة بونت، وبقايا SNAP25 141-206 أو بقايا synaptobrevin 33-94 تشكل BoTest A / E أو B / D / F للصحفيين / G، على التوالي 45. ويتم رصد مراسل الانقسام من قبل بونت باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق). عندما رانه مراسل سليمة، إثارة CFP النتائج في الحنق الى كوكب الزهرة، التبريد والانبعاثات CFP الانبعاثات فينوس مثيرة. الانقسام لمراسل بواسطة بونت يمنع الحنق، مما يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات CFP وانخفاض في الانبعاثات فينوس. ويمكن بعد ذلك أن يقاس النشاط بونت كميا باستخدام نسبة من انبعاثات CFP والزهرة. اللد أقل من 3 خريج ممكنة من مجموعة واسعة من الأطعمة باستخدام 96 جيدا شكل عالية الإنتاجية لوحة 56. ويمكن الحصول على زيادة الحساسية باستخدام حجم العينة أكبر منذ مقايسة يسمح تركيز السامة على سطح حبة. تم تطوير المقايسات مصفوفة BoTest لBoNTs A، B، E، F واختبارها ومع المواد الغذائية والأدوية، والعينات البيئية 56،60. هنا، نحن تصف إجراءات لتنفيذ هذه المقايسات للكشف عن بونت في التعقيد منخفضة (مثل الأدوية، وبونت في المخزن) وعالية التعقيد (مثل المواد الغذائية والبيئية) العينات. طرق المعالجة محددةلتتم معالجتها عدة أنواع العينة في هذا البروتوكول، وأنواع العينات وليس وصفها هنا عادة ما يمكن تكييفها باستخدام مزيج من الأساليب المقدمة. وقد تم تطوير بروتوكول واختبارها مع بونت / A ولكن قابلة للتكيف مع الأنماط المصلية بونت أخرى باستخدام المقايسات الخاصة بها كما هو موضح في أماكن أخرى 56،60.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td>
			<td style="width:107px;">BioSentinel</td>
			<td style="width:104px;">A1015</td>
			<td style="width:245px;">Detection kits for BoNT/B and F are also available.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">5250040</td>
			<td style="width:245px;">Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">96-well Magnetic Bead Separation Plate</td>
			<td style="width:107px;">V&#38;P Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">VP771H</td>
			<td style="width:245px;">Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:192px;">Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td>
			<td style="width:107px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:104px;">ELx405 VSRM</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for automated plate washing.&#160; Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for samples needing centrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:192px;">MixMate plate mixer</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:104px;">22674200</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Used at room temperature or at 25 &#176;C If temperature control is available</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">EDTA-free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">4693132001</td>
			<td style="width:245px;">Only required for food or environmental testing.&#160; Protease inhibitors must be EDTA-free.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">BoNT/A&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for standardization and quantification purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Black, Flat-bottomed 96-well Plates</td>
			<td style="width:107px;">NUNC</td>
			<td style="width:104px;">237105</td>
			<td style="width:245px;">Plates should not be treated</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">96-well Plate Sealing Tape</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15036</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays

مطلوب كشف دقيق وتقدير حجم عصبي البوتولينوم (بونت) في مصفوفات معقدة للأدوية، والبيئية، واختبار عينة الغذاء. مطلوب السريع بونت اختبار المواد الغذائية خلال الطب الشرعي الفاشية، تشخيص المريض، واختبار سلامة الأغذية في حين أن المطلوب دقيقة اختبار فاعلية لتصنيع المنتجات القائمة على المخدرات بونت وسلامة المرضى. الأحيائي الماوس تستخدم على نطاق واسع لاختبار بونت هي حساسة للغاية لكنه يفتقر الى الدقة والإنتاجية اللازمة لاختبار بونت السريع والروتينية. وعلاوة على ذلك، أدى استخدام الأحيائي في الحيوانات في المكالمات من قبل السلطات التنظيمية المنتج المخدرات وأنصار حقوق الحيوان في الولايات المتحدة والخارج ليحل محل الماوس الأحيائي لاختبار بونت. وقد وضعت عدة فحوصات في المختبر الغيار التي تعمل بشكل جيد مع تنقيته بونت في مخازن بسيطة، ولكن لم يظهر معظم لتكون قابلة للتطبيق لاختبار المصفوفات في معقدة للغاية. هنا، وبروتوكول للكشف عنويرد في مصفوفات معقدة بونت باستخدام مصفوفة BoTest المقايسات. يتكون الاختبار من ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يشمل إعداد العينات للاختبار، والجزء الثاني هو خطوة مناعي استخدام الألغام المضادة للبونت المغلفة الأضداد الخرز ممغطس لتنقية بونت من المصفوفة، والجزء الثالث الكمي بروتين المعزول بونت ل النشاط باستخدام مراسل الفلورة. يتم كتابة بروتوكول للاختبار إنتاجية عالية في لوحات 96 جيدا باستخدام المصفوفات سواء السائلة والصلبة ويتطلب حوالي 2 ساعة إعداد دليل بإجمالي مرات الفحص من 4-26 ساعة اعتمادا على نوع العينة، تحميل السم، وحساسية المطلوب. يتم عرض البيانات لبونت / A الاختبار مع الفوسفات مخزنة المالحة، وهو منتج المخدرات، والثقافة طاف والحليب 2٪، والطماطم الطازجة ويتضمن مناقشة المعايير الضرورية للنجاح الفحص.

ويظهر رسم تخطيطي يلخص الخطوات في البروتوكول هو موضح في الشكل 2. مقايسة بين 4-26 ساعة يتطلب لاستكمال اعتمادا على نوع العينة وحساسية الفحص المطلوب، ولكن فقط ~ 2 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد. يتم إجراء الفحص في لوحات 96 جيدا، واعتمادا على نوع من التجارب ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays at JoVE.com

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب.

العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Views.  BioSentinel Inc., Madison, WI.  البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب. 

Video: Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

تعداد الخلايا الجذعية العصبية باستخدام نسيلي فحوصات

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

الامتزاز الجزيئي المستحث بالضوء من البروتينات باستخدام نظام بريمو لزخرفه الصغرى لدراسة استجابات الخلايا للبروتينات المصفوفة خارج الخلية

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...