Les auteurs tiennent à remercier H. Olivares et D. Ruge pour des discussions et des conseils précieux. Cette recherche a été financée en partie par une bourse NSF SBIR (PII-1127245 à BioSentinel Inc.) et un ministère de la Défense contrat (W81XWH-07-2-0045 de bien BioSentinel Inc.).

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeïtoun, et WC Tucker sont des employés ou des propriétaires de BioSentinel Inc. BioSentinel actuellement fabrique et a commercialisé certains des réactifs présentés dans ce rapport.

Ce protocole décrit les procédures permettant de quantifier BoNT / A complexe, holotoxine, ou Clostridium surnageant de culture dans des matrices complexes. Le protocole est le même, cependant, lors de l&#39;essai d&#39;autres sérotypes BoNT (par exemple de BoNT / B, E et F) avec leurs dosages matricielles respectives 56,60, même si la sensibilité dosage variera selon les sérotypes et dosages. Ce protocole ne tient pas compte de tous les types d&#39;échantillon possible et certaines ...

neurotoxines botuliques (de Bont) sont les substances les plus mortelles connues, avec des doses létales humaines intraveineuses estimés à 1-3 ng / kg 1,2. Sept sérotypes de BoNT structurellement similaires, marqués de A à G, exister, chacun consistant en un domaine de chaîne lourde responsable de la liaison cellulaire, l&#39;absorption et la translocation dans le cytosol et d&#39;une chaîne légère qui code pour une endopeptidase de zinc 5.3. La toxicité exquis de BoNT résulte, en partie, son entrée obligatoire et spécifique dans les neurones moteurs à la jonction neuromusculaire 6. Une fois à l&#39;intérieur du neurone, l&#39;endopeptidase de la chaîne légère clive spécifiquement une ou plusieurs de la N-éthylmaléimide sensible récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur (SNARE) des protéines nécessaires à la fusion des vésicules, l&#39;inhibition de la libération de neurotransmetteurs et conduisant à la paralysie flasque 7-14. Communément appelée la maladie &quot;botulisme&quot; paralysie du diaphragme et des muscles intercostaux par BoNT aboutit finalement dansinsuffisance respiratoire et la mort moins le diagnostic précoce et le traitement sont reçus. Origine alimentaire humaine botulisme est le plus souvent associée à BoNT sérotypes A, B, E, et F (BoNT / A, BoNT / B, etc) et se traduit généralement par l&#39;ingestion d&#39;aliments contaminés 15,16; bien que, plusieurs cas de botulisme par blessure ont été signalés chez les usagers de drogues par voie intraveineuse 17,18. Aux États-Unis, le botulisme infantile résultant de l&#39;ingestion de spores de Clostridium par les enfants de moins de un est la forme la plus commune de botulisme 19-21. Cependant, les épidémies d&#39;origine alimentaire de neurotoxines botuliques résultant de la mise en conserve domestique inadéquate et la transformation des aliments ont été signalés dans les États-Unis et à l&#39;étranger. Entre 2000-2009, au moins 338 cas de botulisme d&#39;origine alimentaire ont été signalés dans le monde entier, y compris six décès 22. La capacité de détecter rapidement et de manière sensible des éclosions de botulisme d&#39;origine alimentaire est une indication critique qui pourrait faciliter le diagnostic précoce 23,24. En outre, les méthodes de détection qui permettent rentable et les tests de routine alimentaire permettront d&#39;améliorer la sécurité alimentaire. Spécificité neuronale de BoNT et longue demi-vie biologique rend également une thérapeutique efficace. Aux États-Unis, les médicaments à base de BoNT sont approuvés par la Food and Drug Administration pour le traitement de conditions cosmétiques et de troubles liés neuromusculaires, y compris les rides glabellaires, la dystonie cervicale, des migraines, de la vessie hyperactive, et le strabisme. De nombreuses applications &quot;off-label&quot; sont documentées, y compris les traitements à forte dose pour grave dysfonctionnement musculaire 25-28. Précise toxine quantification est essentiel pour un dosage correct, comme un sous-dosage peut conduire à un traitement inefficace tout surdosage met les patients à risque d&#39;effets secondaires potentiellement dangereux. Malheureusement, aucun protocole de test de puissance normalisée est partagée entre les fabricants, ce qui entraîne des inégalités de définition de l&#39;unité entre les producteurs de médicaments à base de BoNTcts 29-31. Le test standard pour BoNT est le bio-essai souris dans lesquelles des échantillons contenant BoNT sont injectés par voie intrapéritonéale à des souris et le nombre de décès enregistrés plus de 1-7 jours 16,32,33. Le bio-essai sur souris est très sensible aux limites de détection (LOD) de 5-10 pg BoNT / A 34, mais les préoccupations éthiques sur l&#39;utilisation des animaux, le coût élevé de la formation du personnel et l&#39;entretien des installations d&#39;animaux, les temps de dosage longues, et le manque de protocoles normalisés ont donné lieu à des appels à se développer, les tests BoNT standardisé sans animaux et méthodes de quantification 35-39. Récemment, plusieurs méthodes de quantification de neurotoxines botuliques alternatifs ont été développés qui offrent la souris ou à proximité de la souris essai biologique sensibilité 40-49. Ces méthodes utilisent couramment fluorescence, spectrométrie de masse, ou des méthodes immunologiques et offrent des temps d&#39;analyse considérablement plus courte que le bio-essai sur souris sans l&#39;utilisation d&#39;animaux. Spectrométrie de masse approches combinées avec techniq immunologiqueues ont été présentés pour détecter et quantifier BoNT contenue dans les aliments et autres échantillons complexes; toutefois, les exigences de formation du personnel et la limite de l&#39;équipement spécialisé ces dosages 50-55. La plupart des autres tests alternatifs ne sont pas facilement applicable à des tests d&#39;échantillonnage complexe ou n&#39;ont pas le débit requis pour les tests de routine BoNT. La nature très variable de la viscosité de l&#39;échantillon alimentaire, le pH, la teneur en sel, et constituants de la matrice présente un défi particulièrement difficile lorsque vous essayez de développer des méthodes d&#39;essai in vitro avec une sensibilité pour correspondre à la puissance extrême de BoNT. De plus, même les systèmes tampons simples et relativement bénignes, telles que celles résultant de la remise en suspension de produits médicamenteux à base de BoNT, contiennent des sels, l&#39;albumine, le sucre et les stabilisants (par exemple excipients) qui ont une incidence significative in vitro BoNT puissance 56. purification de la toxine est nécessaire pour le contrôle de l&#39;activité précise de tous, mais le plus simple des échantillons 56-59. LaBoTest essais de Matrix ont été conçus pour rapide, à haut débit, et la quantification de la BoNT cohérente à partir d&#39;échantillons très complexes utilisant des équipements couramment dans les laboratoires de recherche 56,60. Ces tests utilisent des billes paramagnétiques liés de manière covalente à des anticorps anti-BoNT sérotypes spécifiques de lier et séquestrer BoNT sur un échantillon, puis retirez interférer composés de la matrice par lavage. Après lavage, l&#39;activité protéolytique de BoNT lié est ensuite quantifiée dans un tampon de réaction optimisé en utilisant un rapporteur compatible avec le sérotype BoNT testé. Ces rapporteurs sont des protéines fluorogènes constitués d&#39;un cyan N-terminal de la protéine fluorescente (PCP) du fragment et un jaune fluorescent dérivé de protéine C-terminal de la fraction (Venus) reliés par un substrat de BoNT, les résidus de SNAP25 141-206 ou les résidus Synaptobrevin 33-94 constituant l&#39; BoTest A / E ou B / D / F / G journalistes, respectivement 45. Reporter clivage par BoNT est contrôlée en utilisant Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET). Quand til rapporteur est intact, l&#39;excitation de la PCP en résulte FRET à Vénus, trempe PCP émission et passionnante émission Vénus. Le clivage de la reporter par la BoNT empêche FRET, conduisant à une augmentation de la PCP et de diminution de l&#39;émission de Vénus émission. Activité BoNT peut alors être mesuré quantitativement utilisant le ratio des émissions PCP et Vénus. LOD-dessous de 3 pg sont possibles à partir d&#39;un large éventail d&#39;aliments en utilisant un format de plaque de 96 puits à haut débit 56. Sensibilité accrue peut être obtenue en utilisant des volumes d&#39;échantillon plus grands depuis la concentration de dosage permet la toxine sur la surface des billes. Les essais de la matrice BoTest pour BoNTs A, B, E, et F ont été développés et testés avec de la nourriture, des produits pharmaceutiques, et les échantillons environnementaux 56,60. Ici, nous décrivons les procédures pour exécuter ces tests pour la détection des BoNT faible complexité (par exemple, pharmaceutique, BoNT dans le tampon) et haute complexité (par exemple la nourriture, de l&#39;environnement) des échantillons. Méthodes de traitement spécifiquespour plusieurs types d&#39;échantillons sont traités dans ce protocole et les types d&#39;échantillons ne sont pas décrites ici peuvent généralement être adaptées en utilisant une combinaison des méthodes présentées. Le protocole a été développé et testé avec BoNT / A, mais est adaptable à d&#39;autres sérotypes de neurotoxines botuliques en utilisant leurs analyses respectives comme en témoigne d&#39;ailleurs 56,60.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td>
			<td style="width:107px;">BioSentinel</td>
			<td style="width:104px;">A1015</td>
			<td style="width:245px;">Detection kits for BoNT/B and F are also available.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">5250040</td>
			<td style="width:245px;">Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">96-well Magnetic Bead Separation Plate</td>
			<td style="width:107px;">V&#38;P Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">VP771H</td>
			<td style="width:245px;">Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:192px;">Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td>
			<td style="width:107px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:104px;">ELx405 VSRM</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for automated plate washing.&#160; Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for samples needing centrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:192px;">MixMate plate mixer</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:104px;">22674200</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Used at room temperature or at 25 &#176;C If temperature control is available</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">EDTA-free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">4693132001</td>
			<td style="width:245px;">Only required for food or environmental testing.&#160; Protease inhibitors must be EDTA-free.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">BoNT/A&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for standardization and quantification purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Black, Flat-bottomed 96-well Plates</td>
			<td style="width:107px;">NUNC</td>
			<td style="width:104px;">237105</td>
			<td style="width:245px;">Plates should not be treated</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">96-well Plate Sealing Tape</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15036</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays

Détection précise et la quantification de la neurotoxine botulique (BoNT) dans des matrices complexes est nécessaire pour l&#39;industrie pharmaceutique, l&#39;environnement, et les essais de l&#39;échantillon de la nourriture. Les tests rapides BoNT des denrées alimentaires est nécessaire pendant la criminalistique épidémiologiques, le diagnostic du patient, et des tests de sécurité alimentaire lors des tests d&#39;activité précis est nécessaire pour la fabrication d&#39;un produit médicamenteux à base de BoNT et la sécurité des patients. Le bio-essai souris largement utilisé pour les tests BoNT est très sensible mais manque de précision et le débit nécessaire pour les tests BoNT rapide et la routine. En outre, l&#39;utilisation de l&#39;essai biologique des animaux a suscité des appels par les autorités de réglementation des produits de la drogue et les partisans des droits des animaux aux États-Unis et à l&#39;étranger pour remplacer le bio-essai sur souris pour les tests BoNT. Plusieurs essais in vitro de remplacement ont été développés qui fonctionnent bien avec purifiée BoNT dans des tampons simples, mais la plupart n&#39;ont pas été montré pour être applicable à l&#39;essai dans des matrices complexes. Ici, un protocole pour la détection d&#39;BoNT dans des matrices complexes en utilisant les BoTest matrice essais est présenté. Le test se compose de trois parties: La première partie comprend la préparation des échantillons pour essais, la deuxième partie est une étape d&#39;immunoprécipitation utilisant des anticorps anti-BoNT billes paramagnétiques recouvertes d&#39;anticorps pour purifier BoNT de la matrice, et la troisième partie quantifie la protéolytique de l&#39;isolement BoNT activité en utilisant un journaliste fluorogène. Le protocole est écrite pour le test à haut débit dans des plaques à 96 puits en utilisant des matrices à la fois liquides et solides et nécessite environ 2 heures de préparation manuelle avec le total des temps de dosage de 4-26 heures, selon le type d&#39;échantillon, la charge de la toxine, et la sensibilité souhaitée. Les données sont présentées pour BoNT / A l&#39;essai avec tampon phosphate salin, un médicament, un surnageant de culture, lait 2%, et les tomates fraîches et comprend la discussion des paramètres essentiels à la réussite du test.

Un diagramme résumant les étapes du protocole décrit est représenté sur la figure 2. Le dosage nécessite entre 4-26 heures à compléter en fonction du type d&#39;échantillon et la sensibilité du test désiré, mais seulement ~ 2 heures de temps de manipulation. Le dosage est réalisé dans des plaques à 96 puits et, en fonction du type de test en cours d&#39;exécution, permet de tester trois exemplaires de jusqu&#39;à 20 échantillons par plaque y compris les normes. <p class="jove_conte...

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Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

La neurotoxine botulique BoTest Matrix (BoNT) des tests de détection de purifier rapidement et quantifier BoNT d&#39;une gamme de matrices d&#39;échantillons. Ici, nous présentons un protocole pour la détection et la quantification de la BoNT de matrices solides et liquides et de démontrer l&#39;essai avec BOTOX, les tomates et le lait.

L&#39;isolement et la quantification de neurotoxine botulique de matrices complexes utilisant les BoTest matrice dosages

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K vues.  BioSentinel Inc., Madison, WI.  La neurotoxine botulique BoTest Matrix (BoNT) des tests de détection de purifier rapidement et quantifier BoNT d'une gamme de matrices d'échantillons. Ici, nous présentons un protocole pour la détection et la quantification de la BoNT de matrices solides et liquides et de démontrer l'essai avec BOTOX, les tomates et le lait. 

Vidéo: Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Recherche

Neurosciences

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

La production et l&#39;isolement des axones de neurones sensoriels de l&#39;analyse biochimique Utilisation des filtres poreux

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Une teneur élevée test d&#39;imagerie pour l&#39;identification des inhibiteurs de la neurotoxine botulique

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Externe Excitation Neurones Utilisation de champs électriques et magnétiques et des cultures dans One- à deux dimensions

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines utilisant le système PRIMO pour la micro-modélisation pour étudier les réponses cellulaires aux protéines de matrice extracellulaires

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...