نشكر الأستاذ ولف فرومر (معهد كارنيجي للعلوم في جامعة ستانفورد) لتوفير يرجى لنا مع الجلوكوز الحنق البلازميد والدكتور أوفه Ludewig (جامعة هوهنهايم) لتتكرم تزويد الجلوتامين الحنق بناء مصنع في pUTKan التعبير النواقل. ويتم تمويل AB بواسطة برنامج منح دراسية BBSRC الأولوية المستهدفة. دعم كلا CK وKP بواسطة RCUK الزمالات في المستحضرات الصيدلانية البيولوجية المعالجة. ويود أيضا أن أشكر CK ونزا الحيوية للحصول على الدعم المالي. ويدعم مركز البيولوجيا الاصطناعية والابتكار بسخاء من قبل EPSRC.

1. خلية الخط إحياء وصيانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إحياء الخلايا CHO في 9 مل CD-CHO المتوسطة تستكمل مع 8 مم L-الجلوتامين و 10 مل / L 100X هيبوزانتين / ثيميدين ملحق (كاملة متوسطة النمو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 10 مل من الطازجة المتوسطة النمو الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينة 1 مل وتحديد تركيز خلية قابلة للحياة بواسطة المجهر الضوئي باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد طريقة الصبغة في عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الثقافة في مناطق ذات كثافة البذر من 3 × 10 5 خلية / مل في 125 مل يهز القوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، جو مرطب من 5٪ CO 2، على منصة تهتز المدارية الدورية عند 120 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية كل 3-4 أيام في المتوسط ​​النمو الكامل في مناطق ذات كثافة البذر من 2 × 10 5 خلية / مل. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن من الخط الخليوي مع البلازميد Containing وجهاز الاستشعار البيولوجي الجيني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحمض النووي البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد على نطاق واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الخلايا في الظروف الملائمة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) 12-24 ساعة قبل ترنسفكأيشن لضمان تقسيم الخلايا بنشاط في وقت ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد طريقة صباغة، ثم إعداد حجم العمل من 20 مل من خلية ثقافة في 125 مل قارورة يهز بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدة ترنسفكأيشن مناسبة للخط الخلوي في الاستخدام. سوف الحمض النووي البلازميد نسبة الكواشف ترنسفكأيشن أن تعتمد على خط الخلية والنواقل. فمن المستحسن أن هذا هو الأمثل من خلال اختبار مجموعة من النسب داخل النطاق المحدد من قبل الشركة المصنعة قبل إجراء transfections النهائي. أيضا الحفاظ على ثقافة واحدة على الأقل السيطرة السلبية التي تحتوي على الخلايا ولكن لا الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 4 أيام في وضع ثابت ثم نقل إلى SHAKIمنصة نانوغرام الدورية عند 125 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البلازميد إلى تركيز مناسب وفقا لما يحدده منحنى القتل. في هذه الدراسة، تم إضافة zeocin إلى تركيز النهائي من 400 ميكروغرام / مل للاختيار من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام في الفترة الفاصلة الوقت المناسب للخط الخلوي، إضافة المضادات الحيوية في كل مرة، إلى أن توفي الخلايا في السيطرة بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الآبار معظم متموجة من التقدم إلى اهتزاز الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بنك للخلايا من خلال تجميد الخلايا في قارورة المبردة التي تحتوي على 10 7 خلايا قابلة للحياة في 1 مل من مزيج التجميد. في هذا العمل، وهذا يتكون من 92.5٪ متوسط ​​النمو 7.5٪ وثنائي ميثيل سلفوكسيد. </li></ol> 3. دفعة وبنك الاحتياطي الفيدرالي على دفعات المنحنى نمو الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع التعليمات لصيانة الخلية أعلاه لإنشاء مزارع الخلايا ثلاث نسخ من الخلايا CHO transfected في 250 مل يهز قوارير مع حجم العمل من 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على cultuالدقة في حاضنة ترطيب الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، على منصة تهتز المدارية الدورية عند 125 دورة في الدقيقة، وإزالة 4.1 مل عينات من كل ثقافة ينمو بمعدل 24 ساعة فترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 100 ميكرولتر من العينة لتحديد تركيز خلية وخلية حيوية قابلة للحياة مع التريبان الأزرق طريقة صبغ الاستبعاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى يتم تقليل تركيز خلية قابلة للحياة إلى الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار لمزارع الخلايا فدان على دفعات المكمل مع كمية مناسبة من الجلوكوز أو الجلوتامين في يوم 6 إلى استعادة تركيزاتها إلى القيم الأولية من 36 ملم و 4 ملم على التوالي. فمن المستحسن أن الثقافات تحكم إضافية يتم الاحتفاظ أيضا، التي يجب أن تتغذى على نفس حجم (12 مل في هذه الحالة) من الماء النقي. </li></ol> 4. الحنق نسبة القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 2 مل من العينات يوميا بإزالتها في الخطوة 3.2 أعلاه وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspأنهى بيليه خلية في 2 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). نقل ذلك في لوحة 6 جيدا وإضافة عينة فارغة لا تحتوي على خلايا لواحد أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مستويات مضان الأزرق والأصفر على الفور في الطول الموجي الإثارة من 430/435 نانومتر، وانبعاث موجات من 465/435 نانومتر (الأزرق) و520/510 نانومتر (الصفراء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسب الحنق (نسبة مضان الصفراء الكشف عن أكثر من مضان الكشف الأزرق). </li></ol> 5. المستقلب فحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 2 مل من العينات يوميا بإزالتها في الخطوة 3.2 أعلاه وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 3 مل الجليد الباردة PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 100 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل PBS الباردة الجليد على النحو الوارد أعلاه. يصوتن العينة 5X لمدة 3 دقائق في كل نبضة من 15 ثانية على و15 ثانية قبالة. عند هذه النقطة، الخلية اضافيةقد يتم تجميد سنت اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدة فحص الجلوكوز المناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة على عينات من مستخلصات الخلية إلى تحديد تركيز الجلوكوز داخل الخلايا (انظر الجدول مواد). ملاحظة: استخدام المعايير المناسبة لبناء منحنى القياسية. في هذا العمل، تراوح تركيز المعايير بين 0-100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قراءات للمعايير، وبناء منحنى القياسية وإيجاد معادلة خطية من الأنسب (في هذه الحالة: ذ = 1310.51x - 723.43 حيث y هو القراءة الامتصاصية وx هو تركيز الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيزات الجلوكوز باستخدام منحنى القياسية واتخاذ التخفيف في الاعتبار. ومن ثم يمكن حساب تركيز الجلوكوز داخل الخلايا باستخدام هذه المعادلة: <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> لخلايا CHO، تم حساب حجم خلية واحدة باستخدام قطرها 12 ميكرومتر خلية من 12 </سوب&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدة الجلوتامين الفحص المناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة على عينات من مستخلصات الخلية إلى تحديد تركيز الجلوتامين داخل الخلايا (انظر الجدول مواد). ملاحظة: استخدام المعايير المناسبة لبناء منحنى القياسية. في هذا العمل، وتركيز المعايير تراوحت بين 0-2 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو الحال في 5.5 أعلاه، وبناء منحنى المعايرة (في هذه الحالة ذ = 203.1x 17.1 + حيث y هو القراءة الامتصاصية وx هو تركيز الجلوكوز) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام منحنى القياسية، وحساب تركيز الجلوتامين من العينات، مع التخفيف في الاعتبار. ويمكن حساب تركيز الجلوتامين داخل الخلايا باستخدام المعادلة (1) أعلاه. </li></ol>

<ol>
	<li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose,+lactate,+glutamate,+and+glutamine.">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li><li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection.">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li><li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein.">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li><li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system.">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels&#8212;the+Holy+Grail+in+muTAS.">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels&#8212;the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li><li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells.">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li><li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors.">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li><li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips.">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors.">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li><li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors.">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li><li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors.">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures.">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li><li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture.">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+binding+proteins:+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering.">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وأكذوبة تمكين في الجسم الحي والكميات الموضع من الجزيئات الرئيسية في، في هذه الحالة المغذيات منظم النمو، وإزالة الشكوك الناجمة عن التبريد وأساليب الاستخراج. تشير النتائج أن هناك علاقة جيدة بين إشارة أكذوبة وتركيزات داخل الخلايا في نطاق 1-5 ملم للجلوكوز...

رصد المستقلب لها تطبيقات مختلفة في التجهيز البيولوجي، بما في ذلك عملية التنمية، وسائل الإعلام وتصميم الأعلاف، والهندسة الأيضية. تتوفر لقياسات تركيز أساليب مختلفة من خلال استخدام الأنزيمية 1، 2 الكيميائية، أو المقايسات ملزمة 3. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين من تركيز الخلايا الأيض الأساسية القائمة على البروتين. في المقايسات حجم منخفضة للغاية، مضان هو أداة مريحة كما التصغير يحسن فعلا نسبة 4،5 إشارة إلى الضوضاء وأجهزة الاستشعار القائم على البروتين المشفرة وراثيا يمكن أن لا معنى الكواشف الخارجية ضرورية لتحليل المستقلب. تتكون نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) أجهزة الاستشعار من اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق هو نقل nonradiative الطاقة من المانحين الصورة متحمس لمتقبل الفلورسنت جزيء المستخدمان<html> إد على مقربة (&lt;100). انشقاق يجند أو ملزم يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي في أجهزة الاستشعار، والتي، بدورها، يؤدي الى تغيير في القرب من fluorophores، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق يقاس التغير في طيف الانبعاث. ويتم إنتاج أجهزة الاستشعار البيولوجية الحنق المتكاملة (أكذوبة) جوهري في خط الخلية وتتغير خصائصها الطيفية استنادا إلى تركيز المستقلب داخل الخلية. أكذوبة ديهم أوقات الاستجابة السريعة مما يجعلها مثالية لأخذ القياسات لنماذج ديناميكية 6. وتشمل التطبيقات السابقة رصد احدة 7-9 ومتعددة 10 الأيض وتوفير بيانات عن توزيع 11 الزمانية المكانية. يمكن إنشاء أكذوبة في طرازين: آبو ماكس، حيث يجند ملزمة يعطل القرب من fluorophores خفض نقل الطاقة وآبو مين، حيث يجند ملزمة يجلب fluorophores اثنين في اتصال أوثق (الشكل 1). _content &quot;&gt; في هذا العمل، ويرد على بروتوكول لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة لأيض الجلوكوز أو الجلوتامين. يتم تأسيس منهجية لمعايرة أجهزة الاستشعار في الجسم الحي لتمكين الكمي المستقبل قياسات تركيز المستقلب داخل الخلايا، كما وردت في الشكل 2. وبناء على هذا، فإن تركيز الجلوكوز داخل الخلايا أو الجلوتامين يمكن تحديد في تغذية على دفعات CHO الثقافات الخلية، التي تمت إضافتها المغذيات اثنين في تركيزات عالية في العملية. النتائج إثبات أن استخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، التنبؤ بدقة من تركيز الخلايا هو ممكن، على نحو ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة. يوفر هذا الأسلوب مزايا كبيرة على التقنيات التحليلية الحالية لأنه موسع ومنخفضة التكلفة وبسرعة، وإعطاء إشارة في الوقت الحقيقي من الأكاذيب التي يمكن أن تكون الاثنينitored في جميع أنحاء الثقافة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="936">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">CHO-S Cells</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;">11619-012</td>
			<td style="width:459px;">Cell line will vary depending on the goals of the study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">pCDNA4/TO vector&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">TransIT-PRO Transfection Reagent</td>
			<td style="width:120px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:120px;">MIR 5700</td>
			<td style="width:459px;">Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Zeocin</td>
			<td style="width:120px;">Invivogen</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">CD-CHO medium</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10743-011</td>
			<td style="width:459px;">Cell growth medium is dependent upon the cells under study</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">100X HT Supplement</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11067-030</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">25030032</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">InfinitePRO 200 plate reader</td>
			<td style="width:120px;">Tecan</td>
			<td style="width:120px;">FLx800TBI</td>
			<td style="width:459px;">Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="190" rowspan="6" style="height:190px;width:239px;">Filters for plate reader</td>
			<td rowspan="6" style="width:120px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:120px;">30000463</td>
			<td rowspan="6" style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(520NM BW 10NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(430NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022787</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">(465NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Maxiprep Plasmid Purification Kit</td>
			<td style="width:120px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">12163</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">A22189</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">EnzyChrom&#160; Glutamine Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">BioAssay systems</td>
			<td style="width:120px;">EOAC-100</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Improved Neubauer haemocytometer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">MNK-420-010N</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Nuaire</td>
			<td style="width:120px;">NU-5510E</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibs-enabled noninvasive metabolic profiling

في عصر البيولوجيا الحاسوبية، ونظم تجريبية جديدة عالية الإنتاجية اللازمة من أجل تعبئة وصقل النماذج بحيث يمكن التحقق من صحة لأغراض التنبؤية. مثالي مثل هذه الأنظمة سيكون حجم منخفضة، ما يحول دون أخذ العينات والتحليلات المدمرة عندما تكون البيانات بالطبع الوقت التي يمكن الحصول عليها. ما هو مطلوب هو في أداة رصد الوضع الطبيعي الذي يمكن إبلاغ المعلومات اللازمة في الوقت الحقيقي وnoninvasively. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين تركيزات داخل الخلايا القائم على البروتين. ويستند واحد من فئة معينة في الجسم الحي أجهزة الاستشعار التي وجدت تطبيقات في المستقلب الكمي على نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) بين اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) ويتم إنتاج جوهري في خط الخلية، لديهم أوقات الاستجابة السريعة وتشا بهم الطيفيةracteristics تغيير على أساس تركيز المستقلب داخل الخلية. في هذه الورقة، وصفت طريقة لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة للالجلوكوز والجلوتامين ومعايرة أكذوبة في الجسم الحي في الثقافة خلية دفعة من أجل تمكين الكمي مستقبل تركيز المستقلب داخل الخلايا. يوضح البيانات من تغذيها دفعة CHO الثقافات الخلية أن أكذوبة كان قادرا في كل حالة للكشف عن التغير الناتج في تركيز داخل الخلايا. باستخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، تم تحديد تركيز الخلايا بدقة ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة.

ويقدم لمحة عامة عن منهجية في الشكل 2. في العمل الواردة في هذه الوثيقة، و transfected الخلايا CHO مع ناقلات أكذوبة وخطوط الخلايا مستقرة وتم اختيار عند ضغط المضادات الحيوية من 400 ميكروغرام / مل zeocin. لذا تم إنشاء اثنين من خطوط الخلايا مستقرة منفصلة معربا جوهري الجلوكوز ?...

Watch this Scientific Journal Video about FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling at JoVE.com

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

ويرد وصف لكيفية معايرة نقل الطاقة الرنين فورستر أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) لالتنميط الأيضية في الموقع. وأكذوبة يمكن أن تستخدم لقياس مستويات الخلايا الأيض مساعدة noninvasively في تطوير نماذج التمثيل الغذائي والإنتاجية العالية فحص ظروف العمليات الحيوية.

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Views.  Imperial College London.  ويرد وصف لكيفية معايرة نقل الطاقة الرنين فورستر أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) لالتنميط الأيضية في الموقع. وأكذوبة يمكن أن تستخدم لقياس مستويات الخلايا الأيض مساعدة noninvasively في تطوير نماذج التمثيل الغذائي والإنتاجية ا?...

Video: FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

في الموقع تحميل ضاغطة والتصوير موسع الارتباطي من العظم اللثة الرباط الأسنان الليفية المشتركة

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have witnessed a tremendous increase in interest in EVs. EVs have been shown to play important roles in various physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer. In addition, EVs have potential as therapeutic agents, for instance as drug delivery vehicles or as regenerative medicine. Because of their small size (50 to 1,000 nm) accurate quantification and size profiling of EVs is technically challenging.
This protocol describes how tunable resistive pulse sensing (tRPS) technology, using the qNano system, can be used to determine the concentration and size of EVs. The method, which relies on the detection of EVs upon their transfer through a nano sized pore, is relatively fast, suffices the use of small sample volumes and does not require the purification and concentration of EVs. Next to the regular operation protocol an alternative approach is described using samples spiked with polystyrene beads of known size and concentration. This real-time calibration technique can be used to overcome technical hurdles encountered when measuring EVs directly in biological fluids.

Extracellular vesicles play important roles in physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer or as potential therapeutic agents in drug delivery or regenerative medicine. This protocol presents methods for the quantification and size characterization of isolated and non-isolated extracellular vesicles in various fluids using tunable resistive pulse sensing.

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

دعم الأيضية اقتطعت، أنسجة المخ الحية أثناء الرنين المغناطيسي المجهري اقتناء

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors للكشف عن حوزتي النشاط في فيفو لتشخيص موسع

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...