ADH و FAD هي جزيئات داخلية المنشأ تظهر التألق الذاتي بأطوال موجية مختلفة للإثارة والانبعاثات. بسبب استخدامها كإنزيمات مشتركة للتفاعلات الأيضية ، يمكن للمجهر الفلوري الذاتي تقييم التمثيل الغذائي الخلوي. لا يتطلب التصوير الفلوري الذاتي ل NADH و FAD تسميات خارجية المنشأ وهو طريقة غير مدمرة ذات دقة دون الخلايا.
يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري الذاتي على العينات الحية ودراسات الدورة الزمنية. يمكن تطبيق التصوير الفلوري الذاتي على نطاق واسع على أي خلايا أو أنسجة حية. تم استخدام التصوير الفلوري الذاتي على الخلايا العصبية والخلايا السرطانية والورم والجسم الحي والخلايا الجذعية والخلايا المناعية.
سيوضح الإجراء لينغهاو هو ، وهو طالب دراسات عليا من مختبر التصوير البصري الكمي في جامعة تكساس إيه آند إم. ابدأ التجربة عن طريق تشغيل جميع مكونات المجهر الفلوري متعدد الفوتونات ، بما في ذلك مصدر الليزر وأجهزة الكشف. قبل وضع العينة، قم بتشغيل مصباح الحقل الساطع وتأكد من دخول الضوء إلى النظارة.
ثم اختر هدفا لتصوير الخلية. إذا لم تكن تستخدم هدفا جويا ، فقم بتطبيق قطرة واحدة من وسط الغمر المناسب فوق الهدف. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي على حامل العينة على مرحلة المجهر.
بعد ذلك ، قم بتوسيط العينة بهدف استخدام عنصر التحكم في المرحلة X / Y تأكد من أن العينة مؤمنة ولن تتحرك أثناء التصوير. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انظر إلى العدسة وحرك الهدف لأعلى للتركيز على الخلايا. إذا كان المجهر داخل حاوية ، فأغلق باب صندوق الضوء.
بعد ذلك ، افتح برنامج الحصول على الصور وانقر فوق علامة التبويب التصوير متعدد الفوتونات لتعيين معلمات التصوير متعدد الفوتون كما هو موضح في المخطوطة. اضبط كسب الكاشف إلى القيمة المثلى للتصوير الفلوري مدى الحياة ، أو FILM. ثم قم بتغيير وقت الإقامة للإنفاق بالليزر في كل بكسل من العينة إلى القيمة المطلوبة.
بالنسبة لثنائي نيوكليوتيد فوسفات الأدينين النيكوتيناميد ، أو NADPH ، اضبط الليزر متعدد الفوتون على 750 نانومتر. بعد ذلك ، تأكد من ضبط التحكم في الطاقة لليزر على الصفر بحيث لا تتلف الخلايا عند فتح الغالق على الليزر. اضبط مرشح الانبعاثات على 400 إلى 500 نانومتر.
عند تعيين المعلمات، ابدأ التصوير بطريقة التركيز البؤري أو العرض المباشر لتحسين إعدادات الصورة. قم بزيادة طاقة الليزر ببطء من ثلاثة إلى ثمانية مللي واط مع التأكد من أن الخلايا في بؤرة التركيز. بمجرد ضبطه ، سجل الحد الأقصى للطاقة المستخدمة.
استخدم إعداد الطاقة القصوى المسجل للتصوير على أجزاء أخرى من طبق بيتري. اجمع صورة NADPH-FILM مع وقت تكامل الصورة البالغ 60 ثانية وتحقق من أن الصورة تحتوي على عدد كاف من الفوتونات ، مثل ذروة 100 فوتون لبكسل السيتوبلازم داخل منحنى الاضمحلال الفلوري مدى الحياة. إذا كان عدد الفوتونات منخفضا جدا ، فقم بزيادة طاقة الليزر أو مدة الحصول على الصورة.
بالنسبة لثنائي نيوكليوتيد الأدينين الفلافين ، أو FAD ، التصوير ، اضبط الليزر متعدد الفوتون على 890 نانومتر وانتظر حتى يتم قفل الليزر عند الطول الموجي الجديد. تأكد من ضبط التحكم في الطاقة لليزر عند الصفر في البداية. اضبط مرشح الانبعاثات على 500 إلى 600 نانومتر.
لتحسين إعدادات الصورة، ابدأ التصوير بطريقة التركيز البؤري أو العرض المباشر عن طريق زيادة طاقة الليزر إلى 5 إلى 10 مللي واط وتسجيل الطاقة القصوى المستخدمة. استخدم نفس إعداد الطاقة لتصوير FAD لمجالات الرؤية اللاحقة. اجمع صورة FAD-FILM مع وقت تكامل الصورة البالغ 60 ثانية وتحقق من أن الصورة تحتوي على فوتونات كافية داخل منحنى الاضمحلال الفلوري مدى الحياة.
إذا كان عدد الفوتونات منخفضا جدا، فقم بزيادة طاقة الليزر أو مدة الحصول على الصورة وكرر التصوير للحصول على أربعة إلى خمسة مجالات رؤية إضافية، أو FOVs، مع تباعد كل صورة على بعد اثنين من FOVs. لصنع محلول سيانيد الصوديوم 80 ملليمول ، قم بإذابة 130.24 ملليغرام من سيانيد الصوديوم في 25 ملليلتر من PBS. من طبق الاستزراع ، استطلع 100 ميكرولتر من وسط الثقافة ليحل محله 100 ميكرولتر من محلول سيانيد الصوديوم للحصول على تركيز أربعة ملليمولات من السيانيد في الطبق.
ضع الخلايا في حاضنة لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالتفاعل مع محلول السيانيد. بعد التعرض للسيانيد ، احصل على صور NADPH و FAD للخلايا كما هو موضح سابقا. حسبت الدراسة معلمات عمر التألق باستخدام دالة استجابة الأداة المقاسة ، أو IRF ، من اليوريا.
تم حساب متوسط المعلمات عبر وحدات بكسل السيتوبلازم لكل خلية تستخدم للتقسيم. تم تحديد الخلايا الفردية وإخفائها للقضاء على ضوضاء الخلفية. بعد ذلك ، تم تحديد النواة وإسقاطها على قناع الخلية.
علاوة على ذلك ، تمت تصفية الخلايا لإزالة المناطق المقنعة التي لا تتناسب مع حجم الخلايا النموذجية. سمح التصوير الفلوري متعدد الفوتونات مدى الحياة ل NADPH و FAD بتصور مورفولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي قبل وبعد معالجة السيانيد. لوحظ أن عمر NADPH ينخفض مع معالجة السيانيد ، في حين أن عمر FAD يزداد بعد معالجة السيانيد.
وأشار مخطط الصندوق التمثيلي إلى أن نسبة الأكسدة والاختزال البصرية لخلايا MCF7 انخفضت بعد معالجة السيانيد. أدى التعرض للسيانيد إلى تقليل عمر NADPH المرجح بالسعة لخلايا MCF7. انخفضت الأعمار القصيرة والطويلة ل NADPH ، ولكنها زادت بالنسبة ل NADPH alpha one.
بالنسبة ل FAD ، زاد العمر المرجح للسعة لخلايا MCF7 بعد التعرض للسيانيد. زاد كل من العمر القصير والطويل ل FAD ، ولكنه انخفض ل FAD alpha one. من المهم أن يكون لديك ما يكفي من طاقة الليزر التي تذهب إلى العينات ، ولكن تذكر أن الكثير من الطاقة يمكن أن يسبب تلفا للخلايا.
نظرا لأن التصوير بالتألق الذاتي لا يضر بالخلايا ، يمكن استخدام الفحوصات الكيميائية الحيوية اللاحقة على نفس العينات.
