Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. الضامة التثقيف والإستقطاب نخاع العظم المشتقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 0: عظم الفخذ والساق عزل العظام 6-10 اسبوع الفئران القديمة من الفائدة (C57BL / 6 في هذا الاختبار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة العضلية من عظام ووضع العظام في 9 سم بتري طبق مليئة PBS الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العظام إلى صحن 9 سم بيتري مليئة 70٪ من الإيثانول ويهز بلطف لوحة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العظام إلى الطازج 9 سم طبق بتري مليئة PBS العقيمة الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع عظم الفخذ والساق في كلا طرفي مع مقص العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح العظام مع 10 مل PBS العقيمة الجليد الباردة باستخدام حقنة 10 مل و إبرة 25 G. جمع نخاع العظم في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل خلايا نخاع العظم لأنبوب جديد 50 مل باستخدام إبرة 23 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوة مع إبرة 25 G. ملاحظة: هناك حاجة لهذه الخطوات لإزالة كتل الخلايا وبقايا العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل سوبernatant و resuspend الخلايا في 40 مل خلية متوسطة الثقافة (RPMI-1640 زائد 2 مم L-الجلوتامين، و 10٪ FCS والبنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) و 15٪ تصفيتها L-929 خلية ( ATCC، CCL-1) المتوسطة -conditioned تحتوي M-CSF (أو بدلا من 10 نانوغرام / مل المؤتلف M-CSF بدلا من L-929 متوسطة مكيفة الخلية). ملاحظة: جيل من L-929 متوسطة مكيفة الخلية كانت مفصلة في هذه المجلة في وقت سابق من عام 2013. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا من الماوس واحد في اثنين 15 سم أطباق بتري (لا تستخدم لوحات المعالجة ثقافة الخلية منذ سوف بلعم لا فصل من هذا البلاستيك) في 20 مل الثقافة المتوسطة في لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل الطازجة مستنبت الخلية في اليوم 3، دون إزالة 20 مل السن مستنبت الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال متوسطة العمر من كل لوحة مع 20 مل المتوسطة ثقافة جديدة في يوم 6. القيام بذلك، كما سيتم إزالة الخلايا غير ملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 8: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا التي يحتضنها منهم 5 مفي في 37 ° C في 10 مل المالحة السيترات (135 ملي كلوريد البوتاسيوم بالإضافة إلى 15 ملي سيترات الصوديوم في H 2 O، تعقيمها) وتغسل مع 10 مل PBS. عد الضامة العظام ناضجة المستمدة من نخاع (BMDM) في يوم 8 باستخدام عداد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من تشكيل ناضجة (CD11b + F4 / 80 +) BMDM عن طريق التفتيش البصري أو عن طريق التدفق الخلوي. بلوك 10 5 الخلايا مع 1/100 مكافحة CD16 / CD32 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في 100 ميكرولتر PBS، احتضان مع 1/200 المضادة للCD11b-FITC بالإضافة 1/200 مكافحة F4 / 80-APC-Cy7 في RT، ويغسل وتحليل التدفق الخلوي. ملاحظة: تم نشر الضامة المشتقة من نخاع العظام زراعة الماوس بالتفصيل في هذه المجلة في وقت سابق يينغ وآخرون 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 50000 الخلايا (عدد الخلايا الأمثل تحتاج إلى أن يكون الأمثل) لكل بئر في صفيحة ميكروسكوبية زراعة الخلايا في 100 ميكرولتر الثقافة المتوسطة. لا البذور الخلايا في الآبار تصحيح الخلفية (A1، A12، H1، H12) ووضع المتوسطة فقط (وليس الخلايا) في هذه الآبار تلميح: امسك ماصة في زاوية لنوبة منتصف الطريق إلى أسفل الجانب من الآبار للطبقة الخلايا الأكثر تجانسا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ليستقر على مستوى RT في غطاء الثقافة خلية لمدة 1 ساعة. وسيعزز هذا التوزيع حتى الخلية والحد من آثار الحافة. رصد الالتزام باستخدام المجهر والثقافة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثلاثة ساعة بعد الطلاء، وتحفيز الخلايا لمدة 24 ساعة مع 10 نانوغرام / مل LPS، أو 20 نانوغرام / الماوس المؤتلف IL-4 لتوليد M1 M2 أو الضامة، على التوالي مل. تشمل غير المعالجة ساذجة (M0) الضامة كمجموعة تحكم. تقييم السليم M1 و M2 بلعم الاستقطاب عن طريق قياس إفراز الناجمة عن LPS من IL-6، IL-12، TNF (ELISA) وIL-4 التي يسببها أرجيناز-1 النشاط و / أو MMR (CD206) وMGL (CD301) التعبير السطحي (التدفق الخلوي) كما هو موضح سابقا 3،11. ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن تكون خلايا (قبل) المعالجة بالإثير مع المركبات الدوائية من الفائدة أو الضامة يمكن حفز مع عوامل أخرى. منذ ذلك الحين، الاختلاف بين آبار منفصلة قد تكون الغواصاتtantial، فمن المستحسن استخدام ما لا يقل عن 4 ومثالي 6 آبار في الشرط. </li></ol> 2. إعداد مقايسة خارج الخلية الجريان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات خرطوشة الاستشعار يوم واحد قبل تشغيل الفحص: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خرطوشة استشعار رأسا على عقب بجانب لوحة فائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة فائدة مع 200 ميكرولتر من محلول calibrant وخفض خرطوشة استشعار على لوحة فائدة غمر أجهزة الاستشعار في حل calibrant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من مستوى حل calibrant مرتفع بما يكفي للحفاظ على أجهزة استشعار المغمورة والمكان في غير CO-2 37 درجة مئوية الحاضنة O / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة المتوسطة في يوم الفحص على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتوسط ​​الدافئة 50 مل XF قاعدة إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر 200 ملي L-الجلوتامين للحصول على 2 ملي التركيز النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم مع فلتر 0.2 ميكرومتر والحفاظ على وسيلة فحص عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة مستنبت الخلية من الضامة الاستقطاب وتخزينه في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (مثل ELISA لفحص الاستقطاب بلعم السليم). غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر مقايسة المتوسطة، إضافة 180 ميكرولتر المتوسطة فحص لكل بئر والتحقق تحت المجهر أن الخلايا لم جرفت. وضع لوحة زراعة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية دون CO 2 لمدة 1 ساعة قبل تشغيل الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 × حقن مركب خليط من A حتى D كما هو موضح في الجدول رقم 1، الحارة إلى 37 درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وفلتر تعقيم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل جميع المركبات في هذه الخلائط في 10X تركيز النهائي في الآبار زراعة الخلايا وتحسين هذه التركيزات لكل نوع من الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خرطوشة الاستشعار باستخدام أدلة التحميل المقدمة مع وحدات التخزين المشار إليها (الجدول 1) من استعداد 10X خليط من مجمع حقن في الموانئ A، B، C و D، respectively. </li></ol><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> خليط / حقن </td><td> مجمعات سكنية </td><td> وأضاف حجم للحصول على خليط 10X (ميكرولتر) </td><td> حجم الفحص المتوسطة (مل) </td><td> حجم حقن خلال المدى (ميكرولتر) </td><td> التركيز النهائي في مقايسة </td></tr><tr><td> ا </td><td> 2.5 M (45٪) الجلوكوز </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 ملي </td></tr><tr><td> ب </td><td> 5 ملي أوليغوميسين A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1.5 ميكرومتر </td></tr><tr><td> C </td><td> 5 ملي FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1.5 ميكرومتر </td></tr><tr><td></td><td> حل 100 ملي الصوديوم البيروفات </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> د </td><td> 5 ملي antimycin A (AA) </tد&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2.5 ميكرومتر </td></tr><tr><td></td><td> 5 ملي روتينون (العفن) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1.25 ميكرومتر </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مخاليط الحقن. 3. توصيف الطاقة البيولوجية من الاستقطاب M1 و M2 BMDM باستخدام الجريان محلل خارج الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء قالب الفحص مع المعالج مقايسة مع MIX 2 دقيقة و 3 مرات التدبير دقيقة و(على الأقل) 3 المزيج ومعدل القياسات حلقات قبل كل من 4 حقن (الجدول 1) وبعد حقن الماضي. ملاحظة: هذه التركيزات صالحة للالضامة المشتقة من نخاع العظام وRaw264.7 خطوط الخلايا بلعم، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. وهناك حاجة مضيفا البيروفات في خليط FCCP لتغذية التنفس القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل عن طريق دفع أسفل البداية واتبع التعليمات من الجهاز. أول شحنة السيارةلوحة tridge مع تحقيقات المائية للسماح للمعايرة من قبل أجهزة والحمل القادم لوحة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفحص، تجاهل بعناية كل المتوسطة فحص وتخزين تحليلها خلية ثقافة صفيحة ميكروسكوبية -20 ° C للتطبيع خلية في المستقبل باستخدام فحص عدة تكاثر الخلايا كما هو موضح بالتفصيل من قبل المورد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وإعداد 1X العازلة خلية تحلل عن طريق تمييع العنصر B 20 أضعاف في الماء المقطر وتمييع مجمع A-400 أضعاف في 1X العازلة خلية تحلل. إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر، واحتضان 5 دقائق على RT وقياس مضان مع ~ 180 نانومتر الإثارة و~ 520 ماكسيما الانبعاثات نانومتر. ملاحظة: عند العمل مع الخلايا غير ملتصقة أو إذا ضعف الالتزام هو مصدر قلق، ومجموعة مباشرة تكاثر الخلايا يمكن استخدامها كبديل منذ هذا البروتوكول لا يتطلب نبذ كل المتوسطة الفحص. ومع ذلك، وهذا البروتوكول المباشر هو قليلا أقل حساسية بالمقارنة مع البروتوكول المستخدم في هذا المختبر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قياس مضان، وتطبيععدد خلايا في كل بئر كنسبة التي يتم فيها تعيين متوسط ​​عدد خلايا من جميع الآبار بلعم ساذجة في 1. ملاحظة: الكمي البروتين (على سبيل المثال باستخدام مقايسة BCA) يمكن أن تستخدم كوسيلة بديلة لتطبيع خلايا التهم الموجهة إليه. ومع ذلك، وبين أيدينا كان هذا الاختبار أقل حساسية بالمقارنة مع فحص عدة تكاثر الخلايا. </li></ol>

<ol>
	<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. L., Pearce, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+immune+cell+activation+and+quiescence.">Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence.</a> Immunity. 38, 633-643 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKM2+regulates+the+Warburg+effect+and+promotes+HMGB1+release+in+sepsis.">PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis.</a> Nature communications. 5, 4436 (2014).</li><li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+macrophages+glucose+transporter+1+(GLUT1)+mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype.">Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).</li><li>Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiles+diverge+during+macrophage+polarization+implications+for+the+interpretation+of+18F+FDG+PET+imaging+of+atherosclerosis.">Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis.</a> J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).</li><li>Vats, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+PGC+1beta+attenuate+macrophage+mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation.</a> Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Huang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+intrinsic+lysosomal+lipolysis+is+essential+for+alternative+activation+of+macrophages.">Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages.</a> Nature immunology. 15, 846-855 (2014).</li><li>Tannahill, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+is+an+inflammatory+signal+that+induces+IL+1beta+through+HIF+1alpha.">Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha.</a> Nature. 496, 238-242 (2013).</li><li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+Histone+deacetylase+3+stabilizes+atherosclerotic+lesions.">Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions.</a> EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+engage+in+homotypic+and+heterotypic+interactions+through+IL+4+and+polyamine+induced+E+cadherin+catenin+complexes.">Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes.</a> Blood. 114, 4664-4674 (2009).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+epigenetic+enzymes+to+improve+atherogenic+macrophage+functions.">Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).</li><li>Galvan Pena, S., O Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprograming+in+macrophage+polarization.">Metabolic reprograming in macrophage polarization.</a> Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).</li><li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization.">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li></ol>

وترعى حرية الوصول إلى هذه المادة من قبل فرس البحر العلوم البيولوجية.

والهدف من المختبر لدينا هو أن نفهم كيف يمكن أن يتأثر الاستقطاب بلعم وظيفة مع الهدف النهائي لتحسين نتائج تصلب الشرايين وحالات الالتهابات الأخرى 12. لتقييم البلاعم الاستقطاب، واحد عادة ما يقيس LPS (+ IFNγ) يسببها وIL-4-الناجم عن التعبير الجيني من M1 و M2 الجينات علامة (QPCR)، ويحدد IL-6، IL-12، TNF وNO إفراز (بواسطة ELISA وGriess رد فعل) ويدرس IL-4 التي يسببها CD71، CD206، CD273 CD301 والتعبير السطحية (التدفق الخلوي) وأرجيناز النشاط 3،13. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات موت الخلايا المبرمج (عن طريق Annexin-V / PI تلطيخ)، المقايسات البلعمة (مع حبات الفلورسنت اللاتكس و / أو pHrodo كولاي) وفحوصات تشكيل خلية الرغوة (عن طريق الجاذبة-oxLDL امتصاص، LipidTOX محايد الدهون تلطيخ) لا يمكن أن يؤديها ل تقييم وظائف بلعم 14. بالإضافة إلى ذلك، تحليل التدفق خارج الخلية لا يمكن أن يؤديها لقياس الطاقة الحيوية لمحات من لجنة الهدنة العسكرية المستقطبةrophages كما قراءات وظيفية جديدة وبديلة. وتظهر هذه المخطوطة أن الاستقطاب بلعم يدفع إعادة برمجة التمثيل الغذائي مع الضامة LPS الناجم عن التحول إلى زيادة تحلل كمصدر للطاقة. على العكس من ذلك، الضامة M2 IL-4 التي يسببها استخدام الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا كمصدر رئيسي للاعبي التنس المحترفين. الأهم من ذلك، إعادة برمجة التمثيل الغذائي لا يوفر فقط طاقة لمتطلبات معينة من M1 و M2 الضامة الاستقطاب. في الواقع، والتغيرات الأيضية تؤثر تركيزات المستقلب التي هي المنظمين مباشرة من النمط الظاهري بلعم 10،15،16. وبالتالي، والتمثيل الغذائي بلعم ليس فقط صفة (كما هو موضح هنا في الشكل 2)، ولكن أيضا سائق متميزة الدول الاستقطاب بلعم ويدعم هذه المعرفة الجديدة والنمو السريع للمنطقة البحث immunometabolism خلال العامين الماضيين. ومع ذلك، والقياسات قوية لمحات التمثيل الغذائي في ماكروظلت فاجات صعبة وكان محدوديتها. في هذه الدراسة، يتم تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لقياس بقوة تحلل، احتياطي حال السكر، والقدرة حال السكر القصوى، وتحمض غير حال السكر، القاعدية والتنفس القصوى، إنتاج ATP، والقدرة التنفسية الغيار، تسرب بروتون والتنفس غير الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي في الحد الأدنى من الضامة. ولذلك، فإننا تعديل وتحسين بروتوكولات الشركة المصنعة على النحو التالي. معيار اختبار الإجهاد ميتو (# 103015-100) يوحي باستخدام المتوسطة مع الجلوكوز والبيروفات وبروتوكولا مع 3 حقن (OM، FCCP، AA / العفن). اخترنا لبدء الفحص مع الجلوكوز / خالية من البيروفات المتوسطة، إضافة الجلوكوز باعتباره الحقنة الأولى في ميناء A (كما هو الحال في تحلل السكر اختبار الإجهاد # 103020-100) وإضافة البيروفات جنبا إلى جنب مع uncoupler FCCP في ميناء C. وبهذه الطريقة ، تستمد جميع المعلمات تحلل ذات الصلة من القياسات ECAR 1-9 وجميع المعلومات ذات الصلة حول mitochondriوظيفة القاعدة من القياسات OCR 15/04. لاحظ أنه من الأهمية بمكان لحقن البيروفات جنبا إلى جنب مع FCCP لتغذية التنفس القصوى على فك ربط. قبل استخدام هذا البروتوكول المشترك، ينبغي للمرء أيضا التحقق من أن 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (2-DG) يخفض مستويات ECAR بعد الفحص إلى القيم القاعدية (1-3) وأن معدلات ECAR سجلت 4-6 هي في الواقع يرجع إلى تحلل. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء أن يفهم أن تركيز مركب وأرقام الهواتف المحمولة المستخدمة في هذه المخطوطة هي صالحة للالضامة المشتقة من نخاع العظام وRaw264.7 خطوط الخلايا بلعم وينبغي أن يكون الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. وعلاوة على ذلك، ينبغي للمرء أن يلاحظ أن M-CSF الذي يستخدم لتوليد الضامة المشتقة من نخاع العظام يعزز النمط الظاهري المضادة للالتهابات مثل M2. لذا قد تكون النتائج المقدمة من الضامة المستمدة من نخاع العظم غير قابلة للمقارنة تماما لقياسات مع الضامة المقيمين الأنسجة الضامة الأولية أو خطوط الخلايا التي لا تتطلب M-CSF خلال culturi الخليةنانوغرام. بالمقارنة مع الطرق القائمة، هذا البروتوكول يتطلب كميات ضئيلة من الضامة ويوفر بسرعة تقريبا جميع خصائص الخلية الأيض الأساسية. هذا ينتج في الخلايا فائض كافية لتنفيذ المقايسات المناعية الأخرى، وحتى الخلايا المستخدمة في الطاقة الحيوية التنميط لا يزال من الممكن استخدامها لأغراض أخرى قصد بعد الفحص. وعلاوة على ذلك، وبشكل خاص 96 شكل لوحة جيد يسمح تقييم ظروف متعددة في الوقت الحقيقي في نفس الوقت. ومع ذلك، فإن الاختلاف بين الآبار الفردية يمكن أن تكون كبيرة، وبالتالي غالبا ما هو المطلوب استخدام ما لا يقل عن 4 آبار في الشرط. اتخذت هذا القيد في الاعتبار، وتحليل تدفق خارج الخلية وصفها لا يزال يسمح لتشغيل أكثر من 10 الظروف التجريبية (ن = 6) في وقت واحد، والتي هي أكثر بكثير من التقنيات التقليدية. عموما، توفر هذه المقالة مقايسة وظيفية سهلة وقابلة للتكرار الذي يسمح بقياس جميع تحلل ذات الصلة والمعلمة الميتوكوندرياeters في مجموعات فرعية بلعم الاستقطاب. هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة تطبيقها في المستقبل لتقييم وظيفة البلاعم وتقييم أثر التلاعب متميزة (مثل الجينات نهدم والأدوية الجديدة، وما إلى ذلك) في (التمثيل الغذائي) النمط الظاهري والبلاعم و. على هذا النحو، وبيانات التدفق خارج الخلية يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى للسماح توصيف متعمق لحالة تنشيط البلاعم.

في حين الضامة تلعب دورا محوريا في الأمراض تقريبا كل شيء، والآليات الجزيئية التي تنظم ملامحهم لا تزال غير تهاوت تماما. عرض الضامة التجانس عالية وردا على المكروية تعتمد الظواهر المختلفة 1. LPS (+ IFNγ) يسببها تنشيط كلاسيكي M1 أو M (LPS) الضامة تعزز الالتهابات وحماية المضيف ضد أنواع مختلفة من التهديدات الجرثومية 2. ويستخدم آخرون IFNγ وحدها أو بالاشتراك مع TNF كما المحفزات للحصول M1 الاستقطاب. IL-4 و / أو IL-13 يدفع تنشيط البلاعم البديل وهذه M2 أو M (IL-4) الخلايا هي المكثفات قوية والتحكم والاستجابات المناعية الجارية 3. عرض الضامة الاستقطاب لائحة متميزة من الأيض الخلوي مع الضامة M1 LPS تنشيط تمر التحول الأيضي لتعزيز تحلل 4-6. الأكسدة على العكس، وتعزيز الأحماض الدهنية (FAO) وoxidativ الميتوكوندرياالبريد الفسفرة (OXPHOS) توفر الطاقة المستدامة في IL-4 التي يسببها الضامة M2 7-9. وهكذا، والتمثيل الغذائي تغيير ليس فقط سمة من سمات فرعية بلعم الاستقطاب، بل هو أيضا شرط أساسي لاستقطاب والتنظيم السليم للالتهابات. الأهم من ذلك، تثبيط تحلل أو OXPHOS / وقد تجلى منظمة الأغذية والزراعة لتنال M1 M2 أو التنشيط، على التوالي 8،10. على هذا النحو، وتحديد التغيرات الأيضية في الضامة يمكن تطبيقها كأداة لتقييم حالة الاستقطاب وإمكاناتهم التهابات. ولذلك يمكن أن تستخدم فحص ثابت الذي يقيس الأيض بلعم التنبؤ بما إذا كانت المخدرات، والجينات بهدم أو يؤثر العلاج الأخرى الاستقطاب البلاعم وظيفة. في هذا الفيديو، يتم استخدام محلل تدفق خارج الخلية لتوصيف ملامح الطاقة الحيوية من السذاجة، M1 و M2 الضامة. هذه المخطوطة تفاصيل بروتوكول الأمثل الذي يسمح للقياسجميع المعلمات ذات الصلة تحلل (تحلل، تحلل القصوى واحتياطي حال السكر) وخصائص وظيفة الميتوكوندريا (التنفس الكلي، والتنفس الميتوكوندريا القاعدية، إنتاج ATP، تسرب بروتون، التنفس القصوى والقدرة التنفسية الغيار) في فحص واحد. باستخدام هذا الإعداد التجريبية، يمكن مقارنة بين الطاقة الحيوية والسيطرة &quot;تغيير&quot; (مثل الجينات نهدم، overexpression المعدلة وراثيا أو العلاج الدوائي) الخلايا.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

بعد الانتهاء من خارج الخلية تدفق فحص والخلية الكمي للبيانات التي يمكن تطبيع لعدد الخلايا وتحليلها. هذا وسوف تسفر عادة ECAR وOCR المؤامرات كما هو مبين في الشكل 1A و 1B الشكل. بعد حقن الجلوكوز (A)، والزيادة في ECAR تمثل معدل تحلل. أما الزيادة الإضافية في ECAR بعد ATP سينسيز تثبيط مع أوليغوميسين (B) معلومات عن احتياطي حال السكر وقدرة (الشكل 1A). عند تحليل القيم OCR، أوليغوميسين الحقن (B) يسمح حساب استهلاك الأوكسجين تستخدم لتخليق ATP الميتوكوندريا. FCCP (C) uncouples التنفس الميتوكوندريا والقياسات OCR المقابلة تسفر عن بيانات حول القصوى والقدرة التنفسية الغيار. وأخيرا، حقن روتينون (العفن) وantimycin A (AA) كتلة الميتوكوندريا I معقدة والثالث وOCR المتبقي يمثل سلبيات الأكسجين غير الميتوكوندرياumption (الشكل 1B). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> الشكل 1: معلمات الاستقلابية مستمدة من تدفق فحص XF خارج الخلية. (A) وتحسب المعلمات بعد تحلل الخلايا من القيم ECAR (في ميلا في الساعة / دقيقة): تحلل، السعة القصوى حال السكر والاحتياطي حال السكر. وتستخدم القياسات (B) OCR (في pMoles / دقيقة) لحساب الثوابت الأساسية القادمة من وظيفة الميتوكوندريا: التنفس القاعدية، إنتاج ATP، تسرب بروتون، والحد الأقصى التنفس والقدرة التنفسية الغيار. Gluc = الجلوكوز؛ OM = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل السيانيد 4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. AA = antimycin A؛ تعفن = روتنون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بعد تشغيل، ECAR وOCR القياسات 1 سمسمل 15 لكل بئر يمكن تصديرها إلى إكسل ويمكن حساب المعلمات حال السكر التالية من القياسات ECAR على النحو التالي: تحمض غير حال السكر = متوسط. ECAR (1،2،3) تحلل = متوسط. ECAR (4،5،6) - متوسط. ECAR (1،2،3) القدرة القصوى حال السكر = متوسط. ECAR (7،8،9) - متوسط. ECAR (1،2،3) احتياطي حال السكر = متوسط. ECAR (7،8،9) - متوسط. ECAR (4،5،6) من معدلات OCR، وخصائص التمثيل الغذائي المقبلة يمكن تحديد: تنفس غير الميتوكوندريا = متوسط. OCR (13،14،15) التنفس القاعدية = متوسط. OCR (4،5،6) - متوسط. OCR (13،14،15) إنتاج ATP = متوسط. OCR (4،5،6) - متوسط. OCR (7،8،9) بروتون تسرب =متوسط. OCR (7،8،9) - متوسط. OCR (13،14،15) التنفس الأقصى = متوسط. OCR (10،11،12) - متوسط. OCR (13،14،15) قدرة الجهاز التنفسي الغيار (SRC) = متوسط. OCR (10،11،12) - متوسط. OCR (4،5،6) <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> وتقدم خصائص التمثيل الغذائي من السذاجة (M0)، LPS- (M1) وIL-4- (M2) الضامة الاستقطاب لكل قياس، المتوسط ​​والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) من 8 الآبار الفردية: الرقم 2. يتم قياس (A) معدلات تحمض خارج الخلية (ECAR، في ميلا في الساعة / دقيقة) و (B) معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR، في pMoles / دقيقة) عن الاستقطاب تفاضلي (M1 و M2) والضامة ساذجة (M0). وتم تطبيع جميع القياسات لعدد خلايا (مقاسا مع CyQUANT) وكان من المقرر أن متوسط ​​عدد الخلايا الضامة من السذاجة في 1. فيjection A = الجلوكوز؛ B = أوليغوميسين. C = FCCP. D = antimycin A + روتنون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> كما هو مبين في الشكل 2A، وتفعيل بلعم مع LPS تحرض على زيادة التمثيل الغذائي حال السكر. الاختلافات بين LPS والضامة IL-4 المعاملة، بل هي أكثر وضوحا عند النظر في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) في الشكل 2B. في الواقع، في حين قمعت بشدة الأيض المؤكسدة القصوى في M (LPS)، IL-4 الحث التنفس القاعدية والأقصى خاصة في الضامة M2. ينبغي للمرء أن يلاحظ أن زيادة حال السكر هي فريدة من نوعها وليس لM (LPS) الضامة، وليس بالضرورة أن يكون سمة من سمات الضامة M1 منذ M (IFNγ) الضامة لا تعرض تعزيز تحلل. عموما، يوضح هذا التحليل تدفق خارج الخلية ثار IL-4 التي يسببها تتميز الضامة M2 خلال تعزيز الأيض المؤكسدة وخاصة قدرة عالية في الجهاز التنفسي الغيار (SRC)، في حين عرض تفعيلها LPS-الضامة تعزيز الأيض حال السكر ولا يملكون أي قدرة الجهاز التنفسي الغيار.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Views.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Video: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

التوكسوبلازما جدار الكيس الغوندية تشكيل المنشط تقوم البلاعم في نخاع العظام والمستمدة من الشروط المتباطئة

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

استقطاب M1 و M2 الإنسان الخلايا المشتقة من Monocyte وتحليل مع تدفق قياس الخلايا على عدوى السل المتفطرة

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

عزل البلاعم المشتقة من نخاع العظم واستزراعها في المختبر لدراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...