وأيد هذا العمل من قبل مركز فراونهوفر الولايات المتحدة الأمريكية للتكنولوجيا الحيوية الجزيئية، iBio، وشركة وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (منحة # HDTRA1-07-C-0054). والكتاب يعترف الهدايا السخية من قبل الدكاترة. ستانتون Gelvin من قسم علوم البيولوجية، جامعة بوردو (الأجرعية المورمة سلالات) وواين فيتزموريس على نطاق واسع الأحياء كورب (بذور excelsiana N.)، وكذلك جينيفر نيكلسون من الولايات المتحدة نيكوتيانا جمع وجامعة ولاية نورث كارولينا (N. بذور نجارة ). المؤلفين أشكر مارغريت Shillingford وكريستوفر هال لتوفير النباتات والمساعدة التقنية الممتازة. أشكر الكتاب أيضا الدكاترة. ستيفن Streatfield وناتاشا كوشنير للمساعدة التحرير.

1. زراعة النباتات لagroinfiltration اللاحقة قمنا بتقييم اثنين من النوع البري الأنواع نيكوتيانا (N. benthamiana N. ونجارة) وهجين (N. excelsiana) نمت المائي على الصوف الصخري في المرافق الداخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع ألواح الصوف الصخري في حل الأسمدة النباتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع البذور البرية من نوع N. benthamiana، N. نجارة وN. excelsiana (هجين من N. benthamiana N. × نجارة) على سطح المواد الغذائية غارقة الصوف الصخري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو النباتات من البذور تحت ظروف خاضعة للرقابة (24 درجة مئوية والرطوبة النسبية 40-65٪) والإضاءة يوم طويل (14 ساعة ضوء و 10 ساعة ظلام، مع إضاءة من 130-150 م -2 μE ثانية -1) ل 4-5 أسابيع لN. وbenthamiana N. excelsiana، و5-6 أسابيع لN. نجارة. </li></ol> 2. بناء ناقلات للAgroinfiltratأيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الجينات الاصطناعية مراسل (الفلورية الخضراء البروتين [GFP])، كامل طول راصة دموية (HA) من سلالة A/California/04/2009 من فيروس الانفلونزا (HAC1)، وإعادة هندستها lichenase انزيم (LicKM) 18 بشكل منفصل في ناقلات إطلاق pBID4 18 (ناقل القائمة TMV) للحصول على pBID4-GFP، pBID4-HAC1 وpBID4-LicKM، على التوالي 18،32،41،47. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض 10-50 نانوغرام من pBID4 تحمل GFP أو HAC1 إلى خلايا electrocompetent من A. المورمة GV3101 سلالة وLicKM إلى خلايا electrocompetent من A. المورمة سلالات GV3101، C58C1، GLA4404، At06، AT10، At77 وA4 مع electroporator MicroPulser الجينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Agrobacteria تحولت للتجارب تسلل ما لم يذكر خلاف ذلك. </li></ol> 3. فراغ تسلل الأجرعية في النباتات نيكوتيانا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو A. المورمة سلالات بين عشية وضحاها (O / N) في LB المتوسطة، ميد YEBالبوتاسيوم أو AB المتوسطة تستكمل مع 50 ملغ / لتر من كاناميسين عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Agrobacteria في المياه الملة، س إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (A 600) 0.5 أو أجهزة الطرد المركزي الأجرعية الخلايا المزروعة في LB أو YEB أو AB في 4،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإعادة تعليق في الحث المتوسطة (1X MS الملح، و 10 ملي زارة التربية والعلم، و 200 ميكرومتر acetosyringone، 2٪ سكروز [MMA]) الى 600 من 0.5، ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 ، ما لم يذكر خلاف ذلك ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل النباتات في غرفة الفراغ الذي غمر الأنسجة النباتية الجوي نيكوتيانا في الأجرعية التعليق وتطبيق فراغ 50-400 م بار لمدة 30 أو 60 ثانية. يتم تطبيق التسلل بشكل روتيني الأمثل في 50-100 م بار لمدة 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تقسيم الفراغ، وإزالة النباتات من فراغ الغرفة، وشطف في الماء، وتنمو لمدة 5-7 أيام وفقا للشروط النمو نفسها التي استخدمت للنمو ما قبل التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار فعاليةالمواد الكيميائية المحفزة الأجرعية فير الجينات، وتركيزات مختلفة من acetosyringone (0، 100، 200 أو 400 ميكرومتر) تمت إضافتها إلى Agrobacteria علقت في المخزن تسلل (1X MS، 10 ملي زارة التربية والعلم، 2٪ الجلوكوز). للتأثير أحادي السكاريد على تحريض الجينات فير، نسب مختلفة من الجلوكوز (0، 1، 2 أو 4٪) تمت إضافتها إلى Agrobacteria علقت في المخزن المؤقت تسلل (1X MS، 10 ملي زارة التربية والعلم، 200 ميكرومتر acetosyringone). N. وقد تسلل النباتات benthamiana على النحو المذكور أعلاه في خطوات 3.3 و 3.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختبر الأجرعية سلالات GV3101، C58C1 وLBA4404 والبرية من نوع السلالات A4، At06، AT10، وAt77 إيواء ناقلات pBID4-LicKM كانت مخففة في الماء ملي-Q لA 600 0.5. N. وقد تسلل النباتات benthamiana مع كل سلالة معينة على النحو المذكور أعلاه في خطوات 3.3 و 3.4. </li></ol> 4. إجراء المشارك agroinfiltration لإسكات الفيروسي المكثف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mالتاسع من الملة-Q-المخفف بالماء الثقافات الأجرعية GV3101 تحمل الجين GFP وإسكات الفيروسي القامع P19 من الطماطم حيلة خطها فيروس (TBSV) في 1:1، 2:1، 3:01 و 4:1 النسب. التسلل N. النباتات benthamiana كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل N. النباتات benthamiana مع مزيج من اثنين ملي-Q-المخفف بالماء الأجرعية GV3101 الثقافات: الأولى تحمل البلازميد pBID4-HAC1 والثانية تحمل واحدة من المكثفات إسكات - P19 من TBSV أو P23 الحمضيات فيروس tristeza، في البلازميد pCassp ( pCassp19) وفي البلازميد ثنائي الموارد الوراثية النباتية تحت المروج 35S (PGR-P23)، على التوالي، في نسبة 4:1. </li></ol> 5. تحليل لطخة غربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات عشوائية من أوراق N. benthamiana، N. نجارة أو N. النباتات excelsiana في 4-7 نقطة في البوصة ويطحنون في النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ثلاثة مجلدات من 1X العازلة PBS تحتوي على 0.5٪ تريتونX-100 على كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف يهز العينات المستخرجة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور استخراج لمدة 5 دقائق وجمع البروتين الكلي للذوبان في أنبوب إيبندورف نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من مقتطفات لتخفيف المناسبة (1:50 1:100) في برنامج تلفزيوني 1X العازلة الاستخراج، وإضافة 5 × عينة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [6.8 درجة الحموضة]، و 10٪ SDS، 0.5٪ برموفينول الأزرق، 50٪ الجلسرين ت / ت، و 500 ملي DTT) إلى النهائي 1 × التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات يغلي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات منفصلة بنسبة 10٪ SDS-PAGE، ونقل على غشاء نقل Immobilon-P، ومنع مع 0.5٪ I-كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف GFP باستخدام الأرنب بولكلونل مكافحة GFP مصل في 1:5،000 وHAC1 باستخدام الماوس المضادة للبولي الحامض الاميني الأضداد وحيدة النسيلة في 1:1،000 في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع العلامات الأجسام المضادة الأولية، وغسل الأغشية ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منها 1 × PBST-20 واحتضان مع البيروكسيداز الفجل (HRP)، مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في 1:5،000 أو HRP-المتقارنةد الأضداد المضادة للماوس في 1:10،000 لمدة 1 ساعة، والكشف عن GFP HAC1، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة البقع الغربية باستخدام الركيزة SuperSignal الغربية بيكو Chemiluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج لتحليل شدة GeneTools الفرقة من البروتين والحصول على الفرقة كمية معايرة. </li></ol> إنتاج البروتين: (معايرة كمية X التخفيف من العينة) / كمية العينة تحميل) × 4 = ملغم / كغم. المعادلة: إنتاج البروتين (P)، وكمية معايرة (C)، التخفيف من العينة (D) و (S) كمية عينة تحميلها. 6. Zymogram الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> N. جمع pBID4-LicKM تسللت- benthamiana أنسجة عشوائية العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتينات باستخدام نفس الأساليب المذكورة أعلاه لتحليل لطخة غربية ثم تحليل بنسبة 10٪ SDS-PAGE مع 0.1٪ lichenan المدرجة في المواد الهلامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الكهربائي، وغسل المواد الهلامية مرتين لمدة 10 دقيقة في كل من غسل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0] و 0.1٪ تريتون X-100)، ثم احتضان في غسل العازلة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وتجاهل غسل العازلة وصمة عار المواد الهلامية مع 0.5٪ الكونغو الأحمر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المواد الهلامية في المياه الملة، س ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما، وإضافة 1 M كلوريد الصوديوم لتصور النشاط lichenase. تم استخدام البروتين المنقى lichenase البكتيرية كعنصر تحكم إيجابية لنشاط انزيم. </li></ol> 7. التصوير GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الكشف البصرية مضان GFP كليا النباتات تتحول عابر باستخدام الطول الموجي الطويل مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة تتحول عابر النباتات مع الكاميرا الرقمية من خلال صفراء 8، ES 52 فلتر (زمن التعرض، 15 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور من لطخة غربية يحلل باستخدام برنامج GeneSnap على GeneGnome وتحديد النتائج باستخدام برنامج GeneTools، مع منحنى المعايرة على أساس معيار تنقية GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس البروتين HAC1 باستخدام منحنى المعايرة على أساس purifiإد HAC القياسية البروتين من سلالة A/Indonesia/05/05 من فيروس الانفلونزا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​القيم 3-4 يعيد لجميع التجارب. </li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

في هذه الدراسة، وقد وضعنا بروتوكولا agroinfiltration بسيطة لإنتاج البروتين روتينية عابرة في الأنواع نيكوتيانا المحدد باستخدام سلالات الأجرعية تحمل ناقلات الاطلاق. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الظروف المثلى لتحقيق أعلى مستوى إنتاج البروتين المؤتلف في نظام التعبير عابرة لدينا مصنع. فراغ تسلل من المخفف A. المورمة سلالة GV3101 إيواء pBID4 متجه إلى إطلاق N. benthamiana، N. أدى excelsiana وN. نجارة في مستويات أعلى من إنتاج البروتين الهدف في 7 نقطة في البوصة بالمقارنة مع الأنواع النباتية الأخرى، مثل بيسوم ساتيفوم تسللت مع GV3101 إيواء البرسيم فيروس موزاييك - موزاييك الخيار أو ناقلات القائم على فيروس التعبير عن الجينات مراسل GFP تحت المروج 35S 41، أو خس ساتيفا، مغد lycopersicum ونبات الأرابيدوبسيس thaliana تسللت مع سلالة C58C1 من A. المورمة تحمل بيتا غلوكورونيداز مراسل الجين 57. N. وbenthamiana N. كان من السهل التسلل إلى فراغ في 50 م بار لمدة 30-60 ثانية، مع 90-95٪ كفاءة تسلل excelsiana. لم يكن تسلل المتبقية 5-10٪ من مساحة الورقة العائمة بسبب بعض الأوراق على سطح تعليق الأجرعية خلال تطبيق فراغ. منذ إطلاق ناقلات لديه القدرة على الخلية الى خلية حركة 18، يحدث تراكم البروتين عابرة في الأوراق بأكملها وكذلك أعناق في 7 نقطة في البوصة. في 10 نقطة في البوصة، وكان إنتاج GFP يقدر أقل قليلا لأن pBID4 التعبير ناقلات قادرة على الانتقال من خلية إلى أخرى ولكن ليس بشكل منتظم لنقل 18؛ لذلك، يترك نمت حديثا لا تحتوي على النواقل ولا تسهم في إنتاج الهدف. بالإضافة إلى ذلك، تدهور البروتين المؤتلف مع مرور الوقت مالمنعم يوسف تسهم في خفض مستوى البروتين في 10 نقطة في البوصة. أظهرت نتائجنا أن تسلل من A. مستويات عالية المورمة سلالة GV3101 بوساطة من إنتاج البروتين عابرة في N. benthamiana. وعلاوة على ذلك، والبروتين المستهدف يمكن هندستها كما N-المحطة، اندماج C-محطة أو داخلية لlichenase (LicKM)، β-1 ،3-1 ،4-glucanase، وهو انزيم بالحرارة من كلوستريديوم thermocellum ويمنح صمود للحرارة لهدف العديد من انصهار بروتين 18. تسلل N. benthamiana مع أ. المورمة من نوع البرية سلالات (AT6، AT10 وat77) بايواء الجينات في المصالح أثارت خفيفة أو شديدة الأعراض: الشباك ورقة، سويقات استطالة، والشباك. لم يلاحظ أي أعراض مرضية في N. تسللت benthamiana مع GV3101 سلالة المختبر إيواء فارغة pBID4 ناقلات، في حين أن بعض الجينات إدراجها في pBID4 وتحويلها إلى المختبر سلالات GV3101، C58C1 أو LBA4404 أثارت ردود نخرية خفيفة ورقةالاخضرار / اصفرار الأعراض في المناطق تسللوا من الأوراق. وقد تم الإبلاغ عن الأعراض التي تسببها نخرية من نوع البرية سلالات الأجرعية أو نزع سلاحها في النباتات باذنجاني سابقا 56،57. استجابة نخرية يمكن أن تنجم عن عوامل الفوعة للنظام إفراز النوع الثالث، والبروتينات البكتيرية نقلها إلى الخلية النباتية من قبل النظام إفراز النوع الرابع، و / أو حساسية لفلاجيلين 58-60. لقد وجدنا أن إنتاج عابرة للبروتينات مغاير يمكن أيضا انتزاع الإمراضية واستجابة شديدة الحساسية في مصنع تسلل يترك. وذكرت العديد من الباحثين أن agroinfiltration من الأنواع النباتية المختلفة مع ناقلات مصنع ثنائي تنتج ما يصل الى مستويات أعلى 5-20 مرات من إنتاج البروتين عابرة بالمقارنة مع محطات تحويل ثابت 28،57. بياناتنا تظهر أن N. تسللت benthamiana مع GV3101 إيواء pBID4-GFP مستويات عالية أعرب عابر من GFP، الذي يشبه إلى العائد GFP ذكرت لN. benthamiana تسللت مع Agrobacteria تحمل ناقلات فيروسية بيش-GFPSYS (ما يصل الى 80٪ من البروتين الكلي للذوبان) 44. أدى Agroinfiltration باستخدام ناقلات إطلاقنا في إنتاج عالية من البروتين LicKM بالحرارة، و 50 أضعاف أعلى من تلك التي لوحظت باستخدام البلازميد ثنائي معيار 18. لاختبار العدوى من A. المورمة واستقرار ناقلات إطلاق، ونحن تسلل شقة واحدة من N. benthamiana كل ساعة لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام نفس الملة-Q ثقافة المخفف بالماء من GV3101 بايواء البلازميد pBID4-GFP. وأظهرت البيانات المتوفرة لدينا أن سلالة GV3101 يصبح معديا بكفاءة لا يقل عن 8 ساعة وpBID4 (ناقلات الإطلاق) مستقرة جدا خلال لمدة ساعة تسلل 8. وقد تبين الأسهم الجلسرين من سلالة GV3101 إيواء إطلاق النواقل pBID4-HAC1 (بنك الخلايا) تخزينها في -80 درجة مئوية إلى أن تكون مستقرة جدا لمدة ثلاث سنوات من دون تغيير في المتواجد عابرةفي الإنتاج في مصانع تسلل. كانت النباتات benthamiana N. نمت في ظل ظروف مثلى وبين 35 و 42 يوما بعد البذر الأمثل للفراغ بوساطة تسلل عابرة التعبير الجيني 40. النباتات الأصغر سنا (3-4 أسابيع من العمر) لا يمكن أن تسلل كليا بسبب أوراق تطفو على السطح تعليق خلية وتلف الأنسجة من آثار الميكانيكية تطبيق فراغ. في النباتات يزيد عمرها عن 45 يوما، N. benthamiana انشقاقه المرحلة، في ظل ظروف الإضاءة الأمثل المستخدمة، ومستوى التعبير عابرة منخفضة. ومن المعروف أن مركبات الفينول منخفضة الوزن الجزيئي (acetosyringone) وmonosaccharaides (الجلوكوز) للحث على جينات فير في A. المورمة 55،61. علاوة على ذلك، تسلل N. عرضت benthamiana مع ناقلات pCAMBIA ثنائي (GFP) في وجود acetosyringone في تركيزات 50-600 ميكرومتر إلى زيادة طفيفة عابرة<html> التعبير الجيني 40. درسنا تأثير تركيزات مختلفة من acetosyringone والجلوكوز في نظامنا بإضافة هذه المركبات على الثقافات GV3101 إيواء pBID4-GFP في مجلس العمل المتحد لمدة 3 ساعة، ويوجد فرق في GFP التعبير. ومن المثير للاهتمام، والثقافات GV3101 إيواء pBID4-GFP والمخفف في الماء الملة، س إلى 600 ألف من 0.5 وتسللوا من دون تحريض فير الجينات وأعرب نفس الكميات من GFP مثل تلك تسللت مع الثقافات التي يسببها. ألف المورمة فير الجين (ق) من المحتمل أن يسببها المركبات النباتية الفينول (حامض acetosyringone وsinapinic) وmonosaccharaides النبات (الجلوكوز والفركتوز) موجودة في الأنسجة ورقة. لذلك، نحن التكهن بأن مستويات مماثلة من التعبير GFP في وجود أو عدم وجود محرضات خارجية فير الجينات قد يكون نتيجة لتأثير حشوية فير محرضات الجينات موجودة أثناء النسخ المتماثل للتعبير عن GFP إطلاق النواقل في الخلايا النباتية. = &quot;jove_content&quot;&gt; من نوع البرية N. وقد استخدم benthamiana كمضيف نموذج لإنتاج البروتين عابر 49. ومع ذلك، منخفضة نسبيا العائد الكتلة الحيوية N. benthamiana &#39;ق يعيق تطبيقها لإنتاج على نطاق واسع من البروتينات المؤتلف. المضيف الأمثل ينبغي أن تجمع بين مستوى عال من التعبير عابرة، والنمو سهلة في الاحتباس الحراري، وتكون عرضة للالأجرعية تسلل 2. لتحديد مضيف البديلة، ونحن تسلل اثنين من مختلف الأنواع البرية من نوع من نيكوتيانا (N. benthamiana N. ونجارة) وN. الهجين excelsiana (N. benthamiana N. × نجارة) مع أ. المورمة سلالة GV3101 بايواء البلازميد pBID4-GFP. من بين هذه الأنواع الثلاثة، كان مستوى التعبير GFP أعلى قليلا في N. benthamiana. N. أظهرت النباتات نجارة صعوبة في فراغ agroinfiltration بسبب أوراقها مصنوع من الجلد، وN. excelsianaأنتجت ما يقرب من شقين أكثر الكتلة الحيوية تحت ظروف النمو نفسه. إنتاج عابرة من GFP في 7 نقطة في البوصة مشابه نسبيا في N. وbenthamiana N. excelsiana. لذا، N. excelsiana قد يكون المضيف أكثر ملاءمة لإنتاج البروتين المؤتلف. إنتاج البروتين عابرة بوساطة الأجرعية محدودة بسبب PTGS 26، والتي يمكن التغلب عليها من خلال المشاركة في التعبير عن الجينات إسكات المكثفات من أصل 62 محطة الفيروس. وقد تم إنتاج البروتين عابرة أظهرت في وقت سابق إلى أن يتعزز 50 أضعاف في وجود البروتين P19 من TBSV، الذي يثبط PTGS في الأنسجة تسلل 34. في دراستنا، قمنا بتقييم تأثير اثنين من المكثفات إسكات الفيروسي (P19 P23 و) بشكل منفصل شارك تسللت مع إطلاق النواقل pBID4-HAC1. يبدو للتسلل المشارك لهذه المكثفات إسكات أن يكون لها تأثير يذكر على التعبير عابرة من HAC1، مع زيادة طفيفة فقط في HAC1تراكم البروتين (15-25٪) في وجود P23 المشارك تسلل أو P19. أن تؤثر بشكل إيجابي إنتاج البروتين، قد تحتاج المكثفات إسكات التي سيتم اختيارها خصيصا لتكون فعالة لأنواع النباتات المستهدفة وناقلات فيروسية 63. TMV helicase ديه القامع للنشاط الحمض النووي الريبي إسكات 64،65. تؤكد البيانات المتوفرة لدينا هذه الملاحظة كما أسفر التعاون تسلل P23 أو P19 مع pBID4-HAC1 في أي زيادة في GFP أو زيادة طفيفة في إنتاج البروتين HAC1 عابرة. في الختام، قمنا بتعديل وتحسين النبات وظروف النمو الأجرعية وتحسين كفاءة فراغ تسلل. مكنتنا هذه التكنولوجيا في النمو واختراق مئات الكيلوغرامات من المواد النباتية في غضون ساعات قليلة. نحن الآلي بنجاح المصنع تقنية التعبير عابرة لإنتاج لقاح الإنتاجية العالية على المستويات الصناعية تحت ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) الظروف. لمزيد من المعلومات ابوالتحرير التشغيل الآلي والاستفادة من نظام الإنتاج عابرة البروتينات النباتية لإنتاج البروتينات المؤتلف، بما في ذلك اللقاحات المرشحة الوحيدات، في ظل ظروف المركب، ويشار إلى القراء لموقع <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

يتم التعرف على النباتات الآن كمنصة آمنة وموثوقة وقابلة للتطوير وغير مكلفة لإنتاج المستحضرات الصيدلانية البيولوجية المؤتلف مغاير والبروتينات الصناعية 1-3 ولها مزايا مهمة على الميكروبية والحيوانية أنظمة التعبير الخلية 4. النباتات هي قادرة على التعبير عن البروتينات مطوية بشكل صحيح مع بعض التعديلات بعد متعدية، بما في ذلك الأجسام المضادة multimeric تجميعها 5-7. العديد من البروتينات المؤتلف الصيدلانية المشتقة من النباتات تشهد التقييم السريري 8. وتشمل هذه اللقاحات المريض محددة المؤتلف نمط ذاتي (scFv) لعلاج سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكين 9، باء على أساس راصة دموية والمرشحين لقاح الأنفلونزا الموسمية 10،11 (كامينغز وآخرون، قدمت إلى اللقاحات)، ومكافحة العقدية المستضد السطحي أنا / الضد الثاني لعلاج تسوس الأسنان 12، والأنسولين البشري لعلاج مرض السكري 13. علاوة على ذلك، ريكو الإنسانتمت الموافقة glucocerebrosidase mbinant لاستبدال العلاج الانزيم في المرضى الذين يعانون من مرض غوشيه في إسرائيل والولايات المتحدة ويتم توفير إطار برنامج الوصول الموسع خارج الولايات المتحدة 14،15. يمكن أن تنتج البروتينات مغاير في تحويل ثابت (المعدلة وراثيا أو transplastomic) أو النباتات تتحول عابر. يقدم إنتاج البروتين عابرة العديد من المزايا أكثر من الإنتاج في النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الإطار الزمني القصير لتحقيق التعبير وتراكم 16، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إدخال ناقلات ثنائي البكتيرية أو الفيروسية النباتية ناقلات المؤتلف في الأنسجة النباتية 4. ويستند نظام التعبير عابرة الأكثر تقدما على استخدام &quot;نواقل إطلاق &#39;التي تجمع بين عناصر من الفيروسات النباتية والبلازميدات ثنائي، ويتم تسليمها من قبل agroinfiltration 17،18. وقد تم تطبيق Agroinfiltration من ناقلات إطلاق يعتمد على التبغ فسيفساء فيروس (TMV) بنجاح في المختبرالنطاق لإنتاج مستضدات قاح ضد مسببات الأمراض مثل فيروس الورم الحليمي البشري 19، الطاعون يرسينيا 20، فيروسات الأنفلونزا A 21،22، 23 عصيات الجمرة الخبيثة، والفيروسات الجدري في 24 N. benthamiana يترك. بوساطة الأجرعية التعبير عابر هو أيضا وسيلة واعدة لإنتاج بروتينات متعددة في وقت واحد 2،25-27. على سبيل المثال، تم استخدام نظم التعبير عابرة مصنع لإنتاج ورم محددة الأجسام المضادة المؤتلف 28،29، الأجسام المضادة المؤتلف الغليكوزيلاتي ضد مستقبلات عامل نمو البشرة 30، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة لمرض الجمرة الخبيثة مستضد واقية 31،32. شارك في تسلل النباتات benthamiana نيكوتيانا مع الجينات المستهدفة والقامع النتائج إسكات الجينات في تعزيز البروتين المستهدف التعبير 33،34. Agroinfiltration هو طريقة شائعة لintrodu موحدالوراثة البكتيريا ايواء الجين من الفائدة في مصنع الأنسجة 35-37. فراغ تسلل الأجرعية عن التعبير الجيني عابرة في محطة سليمة يترك هو وسيلة سريعة وقابلة للتطوير، ومفيد لإنتاج البروتينات الخارجية دون الحاجة إلى توليد النباتات المعدلة وراثيا 38-41. خلال فراغ agroinfiltration، وانقلبت رأسا على عقب النباتات والأجزاء الهوائية المغمورة في الأجرعية التعليق. ثم يتم تطبيق فراغ تسبب الغازات لإخلاء مساحات من ورقة بين الخلايا من خلال الثغور. الإفراج السريع إعادة الضغط التالية من نتائج الفراغ في ضخ تعليق الأجرعية في ورقة. بعد فراغ تسلل Agrobacteria، وكذلك النباتات المزروعة ويتم رصد التعبير الهدف. عادة ما لوحظ أعلى مستويات التعبير الهدف 2-3 أيام بعد تسلل (نقطة في البوصة) مع ناقل ثنائي و4-7 نقطة في البوصة مع ناقلات إطلاق، وبعد ذلك على مستوى التعبير عادة decreaسيس 17،18،42-45. الأجرعية المورمة هو الوسيلة الأكثر استخداما على نطاق واسع لإيصال الجينات في المصالح في مصنع لإنتاج البروتين. Agroinfiltration يعمل بشكل جيد للغاية في N. benthamiana ولكن سيئة نسبيا في معظم النباتات الأخرى، بما في ذلك نبات الأرابيدوبسيس thaliana 46. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة واقتصادية لإنتاج البروتين عابرة في 5-6 أسابيع من العمر N. benthamiana باستخدام A. المورمة التسلل. العيب الرئيسي من التوسع الصناعي للتقنية agroinfiltration هو الطرد المركزي من البكتيريا حصادها وإعادة تعليق بيليه البكتيرية في المتوسط ​​تحتوي 4&#39;هيدروكسي-3 &#39;، 5&#39;-dimethoxyacetophenone (acetosyringone)، السكريات الأحادية، و 2 - (N-morpholino) -ethanesulfonic حمض (MES) العازلة لتحريض جينات فير. كنا قادرين على التغلب على هذه المشاكل عن طريق تحسين الأجرعية </م&gt; النمو في AB المتوسطة (الحد الأدنى من المتوسط)، يليه تمييع مباشرة في الماء ملي-Q وعن طريق التحكم في مدة التسلل والظروف. ونحن أيضا مقارنة إنتاج البروتين الهدف في N. البرية من نوع الأنواع المضيفة التبغ وbenthamiana N. نجارة، وكذلك في الهجين N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

إنتاج البروتين عابرة بوساطة الأجرعية في النباتات هو نهج واعدة لإنتاج مستضدات اللقاح والبروتينات العلاجية في غضون فترة قصيرة من الزمن. ومع ذلك، وهذه التكنولوجيا ليست سوى مجرد بداية ليتم تطبيقها على إنتاج العديد من العقبات التكنولوجية على نطاق واسع لزيادة ويجري حاليا التغلب عليها. هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإنتاج البروتين عابرة على نطاق صناعي يعتمد على فراغ تسلل النباتات نيكوتيانا مع Agrobacteria تحمل ناقلات الاطلاق. الاستفادة المثلى من زراعة الأجرعية في AB المتوسطة يسمح التخفيف المباشر للثقافة البكتيرية في المياه الملة، س، وتبسيط عملية التسلل. بين ثلاثة أنواع من اختبار نيكوتيانا، N. وقد تم اختيار excelsiana (N. benthamiana N. × نجارة) بوصفها البلد المضيف الواعدة نظرا لسهولة التسلل، ومستوى عال من إنتاج البروتين المراسل، وحوالي اثنين وإنتاج الكتلة الحيوية القديمة أعلى في ظل الظروف البيئية التي تسيطر عليها. كان تحريض الأجرعية إيواء pBID4-GFP (فسيفساء التبغ القائم على الفيروس) استخدام المواد الكيميائية مثل acetosyringone وأحادي السكاريد أي تأثير على مستوى إنتاج البروتين. أدى التسلل النبات تحت 50-100 م بار لمدة 30 أو 60 ثانية في حوالي 95٪ تسلل الأنسجة ورقة النبات. أظهرت تسلل مع سلالة المختبر الأجرعية GV3101 أعلى إنتاج البروتين مقارنة سلالات مختبر Agrobacteria LBA4404 وC58C1 والبرية من نوع Agrobacteria سلالات AT6، AT10، at77 وA4. شارك في التعبير عن الفيروسي RNA إسكات القامع، P23 أو P19، في N. أدى تراكم benthamiana في وقت سابق، وزيادة الإنتاج (15-25٪) من البروتين الهدف (راصة دموية فيروس الأنفلونزا).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

إنتاج البروتين عابرة في النباتات نيكوتيانا استنادا فراغ تسلل مع Agrobacteria تحمل ناقلات إطلاق (فسيفساء التبغ القائم على الفيروس) هو نهج سريع والاقتصادية لإنتاج مستضدات اللقاح والبروتينات العلاجية. نحن تبسيط الإجراءات وتحسين تراكم الهدف عن طريق تحسين ظروف زراعة البكتيريا، واختيار الأنواع المضيفة، وشارك في تقديمه-RNA إسكات المكثفات.

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.0K Views.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  إنتاج البروتين عابرة في النباتات نيكوتيانا استنادا فراغ تسلل مع Agrobacteria تحمل ناقلات إطلاق (فسيفساء التبغ القائم على الفيروس) هو نهج سريع والاقتصادية لإنتاج مستضدات اللقاح والبروتينات العلاجية. نحن تبسيط الإجراءات وتحس?...

Video: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

الترشيح الزراعي والإصابة بالزراعة PVX في البطاطا ونيكوتيانا بنثاميانا

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

البكتريا الزراعية-بوساطة تحويل الجنين غير الناضج من خطوط الذرة المستعبدة المستنعين باستخدام الجينات المورجينية

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

إنتاج بروتينات IgG فيوجن أعرب عنها بشكل عابر في نيكوتيانا بنثاميانا

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...