نود أن نشكر يورغن سول لإجراء مناقشات مفيدة وكريس كاري لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وDFG فون دير chemischen اندستري (أرقام المنح SFB 1035 A04 مشروع لSS وهل 187/22 إلى RS).

1. التحول من يبني BiFC في Agrobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ يبني BiFC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الجين من الفائدة من القالب المناسب باستخدام أليغنوكليوتيد] تحتوي المرافقة مواقع attB. إجراء PCR باستخدام البلمرة تصحيح التجارب المطبعية. التكيف مع طول الخطوة الصلب لمزيج التمهيدي تصميم وطول الخطوة استطالة وفقا لحجم جزء. التحقق من المنتج PCR بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وتطهيره باستخدام PCR تنظيف كيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء رد فعل BP مع جزء حصلت وناقلات الدخول باستخدام recombinase BP. مزج 15-150 نانوغرام من المنتج attB-PCR مع 150 نانوغرام من ناقلات الدخول، إضافة 2 ميكرولتر من recombinase BP وتملأ مع TE العازلة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 8 ميكرولتر. احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة على RT ووقف رد الفعل بإضافة 2 ميكرولتر K بروتين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل رد فعل بأكمله إلى E. المختصة القولونية DH5α؛ الخلايا وفحص المستعمرات التي حصلت عليها مستعمرة PCR لالإدراج الصحيح للجزء الحمض النووي في ناقلات. يتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي من البلازميدات إيجابية للتحقق من عدم وجود الطفرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام استنساخ الدخول التي حصل عليها لLR إعادة التركيب مع ناقلات الوجهة المناسبة باستخدام recombinase LR. مزج 50-150 نانوغرام من ناقلات دخول مع 150 نانوغرام من ناقلات الوجهة، إضافة 1 ميكرولتر LR recombinase وتملأ مع TE العازلة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 5 ميكرولتر. احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة على RT ووقف رد فعل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر K بروتين لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل رد فعل كامل في خلايا الإشريكية القولونية DH5α المختصة والشاشة التي تم الحصول عليها عن طريق المستعمرات مستعمرة PCR لالإدراج الصحيح للجزء الحمض النووي في ناقلات. تسلسل الحمض النووي ليس من الضروري في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي البلازميد مع مجموعة البلازميد البسيطة لضمان درجة عالية من النقاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Agrobacteria المختصة كيميائيا (سلالة AGL1، ريفامبيسين والمقاومة كربنيسيلين) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط من agrobacteria من ثقافة الأسهم وتنمو لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 5 مل LB المتوسطة مع مستعمرة واحدة واحتضان بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 50 مل LB المتوسطة مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها وتنمو لحوالي 4 ساعة عند 28 درجة مئوية إلى OD 600 من 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 3،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend بيليه في 1 مل تعقيمها الجليد الباردة و CaCl 2 (10 ملم). تبقي الخلايا على الجليد بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مأخوذة (100 ميكرولتر) من الخلايا، وتجميد فورا في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحول المختصة كيميائيا Agrobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة واحدة من الخلايا AGL1 المختصة على الجليد. إضافة 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد، 5 دقائق في النيتروجين السائل و 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة 600 ميكرولتر LB المتوسطة إلى الخلايا وقنازلي في 650 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة عند 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 8،000 XG وتجاهل طاف. resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من LB المتوسطة المتبقية وعلى لوحات لوحة LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. ختم لوحات واحتضان لمدة 2 أيام في 28 درجة مئوية. المستعمرات الشاشة عن وجود البلازميد من قبل مستعمرة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم مستعمرة إيجابية واحدة في 5 مل LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة واحتضان عند 28 درجة مئوية خلال الليل. مزيج 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها مع 500 ميكرولتر 50٪ الجلسرين تعقيمها وتجميدها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح agrobacteria في LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مباشرة من المخزون الجلسرين للتحول عابرة من أوراق التبغ. </li></ol></li></ol> 2. التحول عابرة من أوراق التبغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agrobacteria النمو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم التالية: Acetosyringone (150 ملي، ويحل في 70ETOH٪)، المخزن كما aliquots في -20 درجة مئوية. MES / KOH (0.1 M) درجة الحموضة 5.7، تخزينها في 4 درجة مئوية (تصفية العقيمة من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر لمنع نمو البكتيريا أثناء التخزين الطويل)، MgCl 2 (1 M) الأوراق المالية، وتخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 10 مل LB متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 50 ميكرولتر من الجلسرين AGL1 الثقافة الأسهم التي تحتوي على البلازميد من الاهتمام في العقيمة 50 مل أنبوب واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة تهتز في 190 دورة في الدقيقة حتى يتم OD 600 بين 1.0 يتم التوصل إلى -2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البكتيريا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة. resuspend الكرية في تقدم طازجة المتوسطة تسلل [MgCl 2 (10 ملم)، MES / KOH (10 ملم) ودرجة الحموضة 5.7، Acetosyringone (150 ميكرومتر)] وضبط التعليق إلى OD 600 من 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في agrobacteria شاكر النفقات العامة لمدة 2 ساعة في الظلام. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم الخلايا للتسلل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلل من أوراق التبغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ثلاثةالأسبوع التبغ القديمة (نيكوتيانا benthamiana) النباتات. اختيار العديد من الأوراق القديمة للتسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط كميات متساوية من agrobacteria تحمل يبني الفائدة (3 مل لكل منهما). أخذ حقنة 5 مل بدون إبرة للتسلل. التسلل تعليق خلية بعناية في أوراق التبغ عن طريق الضغط على حقنة على الجانب السفلي من الأوراق في العديد من الأماكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المياه والنباتات وتركهم في الظلام لمدة يومين. </li></ol></li></ol> 3. إعداد البروتوبلازم وقد تم تكييف إعداد البروتوبلازم من أوراق التبغ من كوب وآخرون 16 ومعدلة بشكل طفيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد F-بكن المتوسطة:-أملاح ماكرو [كنو 3 (1012 ميكروغرام / مل)، و CaCl 2 • 2H 2 O (440 ميكروغرام / مل)، MgSO 4 • 7H 2 O (370 ميكروغرام / مل)، KH 2 PO 4 ( 170 ميكروغرام / مل)، NH-4 سوسينات [(20 ملم؛ إعداد 2 M الأسهم سولution (سكسينات (236 ميكروغرام / مل) وNH 4 الكلورين (106 ميكروغرام / مل)، وضبط درجة الحموضة إلى 5.8 حل)]، الصغرى، أملاح [EDTA الحديد (III) × نا الملح (40 ميكروغرام / مل)، KJ (0.75 ميكروغرام / مل)، H 3 BO 3 (3 ميكروغرام / مل)، MnSO 4 • H 2 O (10 ميكروغرام / مل)، ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ميكروغرام / مل)، وزارة النفط نا 2 4 • 7H 2 O (0.25 ميكروغرام / مل)، كبريتات النحاس 4 • 5H 2 O (0.025 ميكروغرام / مل)، كوكلي 2 • 6H 2 O (0.025 ميكروغرام / مل)]، MES (390 ميكروغرام / مل)، والجلوكوز (حوالي 80 ميكروغرام / مل) الأسمولية 550 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.8 (KOH). متجر في aliquots في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة F-PIN: جميع المكونات كما F-بكن ولكن بدلا من استخدام الجلوكوز والسكروز (حوالي 110 ميكروغرام / مل)، الأسمولية 550 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.8 (KOH). متجر في aliquots في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد W5 المتوسطة: 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 125 مم CaCl 2، 5 ملي بوكل، 2 ملي زارة التربية والعلم، الأسمولية 550-580 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 5.7 (KOH). تخزينها في 4 درجات؛ C (تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون فلتر لمنع نمو البكتيريا أثناء التخزين الطويل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل انزيم جديدة لعزل البروتوبلازم (0.1 غ سلولاز، 0.03 غ في 10 مل macerozym F-PIN). احتضان الحل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبارد لRT. إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ إلى 10 مل BSA الحل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد ورقة تسللت إلى طبق بتري وإضافة محلول أنزيم الطازجة. استخدام razorblade جديدة لخفض ورقة في ما يقرب من 0.5 سم 2 قطعة الحجم. نقل أوراق القطع مع الحل الانزيم في قارورة فراغ فراغ تسلل والتسلل لحوالي 20 ثانية حتى تظهر فقاعات الهواء من أوراق (نشرة فراغ بعناية جدا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هز القارورة لمدة 90 دقيقة في 40 دورة في الدقيقة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق سراح protoplasts التي تهز لمدة 1 دقيقة في 90 دورة في الدقيقة. تحديد الحل من خلال الشاش (100 ميكرومتر) إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي (القاع وإيابا). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب الحل البروتوبلازم مع 2 مل F-بكن العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 70 x ج (تسارع بطيء والتباطؤ) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> protoplasts سليمة تتراكم في واجهة من حل الانزيم وF-بكن. تأخذ واسعة الفوهة 1 مل ماصة لنقل protoplasts سليمة في أنبوب الطرد المركزي الطازجة وتملأ مع العازلة W5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 x ج (تسارع بطيء والتباطؤ) لتكوير protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بعناية باستخدام ماصة و resuspend بيليه في ما يقرب من 200 ميكرولتر العازلة W5، اعتمادا على كمية من protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دائما استخدام نصائح فوهة واسعة لمنع تمزق من protoplasts سليمة. </li></ol></li></ol> 4. الليزر الضوئي المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصق قطعتين صغيرة من تسرب حول شريحة المجهر (2 سم بعيدا). وضع 20 ميكرولتر من الحل البروتوبلازم بين شرائح ووضع بعناية غطاء زجاجيعلى القمة. شرائط تسرب تأكد من أن protoplasts لا ممرود من الزجاج غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمجموع العينات ورقة قطع 1 سم قطعة من ورقة ووضعها على شريحة المجهر مع الجانب السفلي من ورقة متجهة لأعلى. إضافة حوالي 30 ميكرولتر H 2 O، ووضع غطاء زجاجي على رأس واصلاحها بإحكام بشريط لاصق على الجانبين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادات التصوير ومتحد البؤر المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء التصوير مع متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهر من ايكا، النوع: TCS SP5. لاستخدام التكبير عدسة الهدف (HCX PL APO CS) بلغت قوته 63X مع الجلسرين كوسط التصوير. تعيين الفتحة العددية إلى 1.3. استخدام البرنامج لايكا التطبيق جناح / الإسفار المتقدم للتقييم (انظر التكميلي البيانات S1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ليزر أرغون إلى 30٪ وقوة الليزر على 488 نانومتر إلى 18٪ من كثافة لرصد إشارة BiFC أعيد تشكيلها في 515 نانومتر، ومجموعة واحدة PMT للكشف عن عرض النطاق الترددي الانبعاثات 495-550. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد الكلوروفيل تألق ذاتي تعيين كاشف PMT عرض النطاق الترددي الانبعاثات الثانية 650-705. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد إشارة mCherry استخدام الليزر HeNe 561، تعيين شدة الليزر 561-18٪ وعرض النطاق الترددي انبعاث كاشف PMT الثالث 587-610. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن يتم التقاط الصور من جميع القنوات كاشف PMT مع الإعدادات كسب نفسه (يجب أن يكون بين 800-900 مكسب لاستبعاد الإشارات الخلفية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور في شكل عرض / ارتفاع 1024 x 1024 بكسل مع سرعة المسح الضوئي 100 هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لZ-stackings استخدام مسافة أقصاها 0.5 ميكرون بين كل كومة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

عند التخطيط لتجربة BiFC ينبغي النظر في عدة نقاط. على الرغم من أن ليس لديه معلومات حول هيكلية البروتينات ذات الاهتمام المطلوب، طوبولوجيا أن يكون معروفا عند العمل مع غشاء تمتد البروتينات. البروتينات الفلورية يجب أن تتواجد في نفس المكان التحت خلوية أو مواجهة نفس الجانب م?...

دراسة تشكيل مجمعات البروتين والتعريب في الخلايا النباتية في الجسم الحي لا بد من التحقيق في الشبكات الخلوية، مما يشير إلى والعمليات الأيضية. BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات في البيئة الطبيعية مباشرة داخل الخلية النباتية الحية 1-5. في BiFC الاقتراب من تكامل اثنين من شظايا وN-C-محطة nonfluorescent من الرصاص بروتين فلوري إلى بروتين فلوري المعاد. وقد استخدمت أجزاء من العديد من البروتينات الفلورية مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وحامل اللون من الذي يتكون كيميائيا من قبل ثلاثة بقايا متميزة 6. يمكن النصف البروتينات الفلورية ضمن حلقة أو حبلا ß أن ينتج في اثنين من شظايا nonfluorescent التي يمكن تنصهر إلى كل من البروتينات في المصالح. الفحص يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات في أي compartme التحت خلويةNT في أي كائن حي ينمو هوائيا أو الخلايا التي يمكن تعديلها وراثيا في التعبير عن البروتينات الانصهار. إذا كانت البروتينات اثنين حيز مقربة داخل الخلية، وأعيد مضان ويمكن رصدها بواسطة المجهر بدون إضافة fluorophores الخارجية أو الأصباغ 3. وقد ثبت التبغ (نيكوتيانا benthamiana) ليكون نموذج كائن مريحة لتصور تفاعل البروتينات النباتية، منذ البروتينات يمكن بسهولة أن أعرب عن طريق استخدام بوساطة الأجرعية تحول يترك التبغ مع بنيات ولدت. Agrobacteria استخدام ما يسمى البلازميد تي (الورم حمل) الترميز للأنزيمات التي تتوسط تنبيغ من الجينات في المصالح في الخلايا النباتية. BiFC ينطبق بشكل جيد للذوبان فضلا عن بروتينات الغشاء في جميع المقصورات الخلوية واستخدمت بنجاح خلال السنوات الماضية لتحديد التفاعل البروتينات في الجسم الحي وكذلك لتحليل مواقع التفاعلداخل البروتينات 7-9. على التعبير عن الجينات المدخلة، تفاعل البروتينات الفلورية يمكن تصور مباشرة في الأوراق، والتي هي مناسبة لهياكل الخلوية أكبر، مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER)، غشاء البلازما أو البلاستيدات الخضراء. ومع ذلك، لرصد توطين في هياكل أكثر دقة، على سبيل المثال، المغلف بلاستيدات الخضراء، فإنه من المستحسن لتصور مضان في protoplasts معزولة من أوراق التبغ تحول. وهناك مجموعة من ناقلات BiFC يحتوي إما C-محطة أو علامة فلوري N-محطة لابد من استخدامها للنهج BiFC في النباتات 10. تم استخدام بروتوكول المشار إليه فيما بعد لدراسة التفاعل بين البروتين عصاري خلوي الصدمة الحرارية 90 (HSP90) مع تكرار tetratricopeptide (نظام الحماية المؤقت) التي تحتوي على البروتينات مجال الالتحام Toc64 وAtTPR7 المقيمين في المغلف الخارجي بلاستيدات الخضراء والشبكة الإندوبلازمية، على التوالي 11-13. لهذا الغرض، وتنصهر HSP90 إلى طجزء من erminal SCFP (SCFP C). كان العلامة N-عضال تنصهر إلى كوصي لضمان سهولة الوصول للMEEVD عزر ملزم C-محطة من HSP90 لكبح من نوع المجالات نظام الحماية المؤقت. في موازاة ذلك، كانت تنصهر الجزء N-محطة لكوكب الزهرة (فينوس N) إلى المجالات عصاري خلوي من المجال TPR تحتوي على بروتينات الالتحام Toc64 وAtTPR7، على التوالي. كعنصر تحكم السلبية علينا استنساخ-C محطة للذوبان جزء من SCFP C فقط الذي يتواجد في العصارة الخلوية وبالتالي فهي عنصر تحكم المناسبة. علامات الفلورسنت من البروتينات درس يجب أن تواجه نفس المقصورة الخلوية للسماح مقربة وإعادة تشكيل إشارة الفلورسنت بذلك. لتحديد توطين إشارة الفلورسنت المعاد بروتين تنصهر علامة إلى علامة فلوري مختلفة يمكن cotransformed للتدليل على توطين التحت خلوية من التفاعل. تحولت بروتين ER علامة تنصهر لmCherrry في وقت واحد فيحالة ER تقع AtTPR7 14. وتألق ذاتي الكلوروفيل بمثابة علامة بلاستيدات الخضراء في حالة Toc64. هذا ليس فقط من خلال التفاعل في الجسم الحي من Toc64 وAtTPR7، على التوالي، مع HSP90 كوصي عصاري خلوي يمكن رصدها مباشرة في أوراق التبغ ولكن يمكن أيضا أن يتم التحقيق توطين التحت خلوية من التفاعل. BiFC يناسب كذلك اتباع نهج متكامل لأساليب أخرى دراسة التفاعلات البروتين البروتين. مقارنة coimmunoprecipitation أو في المختبر التجارب المنسدلة، على سبيل المثال، لا أجسام مضادة محددة يجب أن تكون متاحة للبروتينات من الفائدة، والبروتينات لا يجب أن يتم التعبير recombinantly في المختبر، والتي يمكن أن يكون تحديا، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء. وعلاوة على ذلك، وأيضا التفاعلات عابرة يمكن رصدها باستخدام BiFC، حيث يتم القبض على البروتينات عن طريق التفاعل من علامات الفلورسنت تنصهر 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

العديد من البروتينات تتفاعل مع بروتينات أخرى عابر أو يتم دمجها في المجمعات متعددة البروتين لأداء الوظيفة البيولوجية الخاصة بهم. تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) هو أسلوب في الجسم الحي لرصد هذه التفاعلات في الخلايا النباتية. في بروتوكول المعروضة وتنصهر البروتينات مرشح التحقيق إلى نصفين التكميلية من البروتينات الفلورية وقدم يبني منها في الخلايا النباتية عن طريق التحول بوساطة الأجرعية. بعد ذلك، يتم التعبير عن البروتينات عابر في أوراق التبغ، ويمكن أن يتم الكشف عن إشارات الفلورسنت استعادة مع متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر في خلايا سليمة. وهذا يسمح التصور ليس فقط من التفاعل في حد ذاته، ولكن أيضا توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين يمكن تحديده. لهذا الغرض، تحتوي على جينات علامة علامة فلوري يمكن coexpressed جنبا إلى جنب مع ثوابت BiFC، وبالتالي تصور الهياكل الخلوية مثل رانه هيولي باطني شبكية، الميتوكوندريا، جهاز جولجي أو غشاء البلازما. يمكن رصد إشارة الفلورسنت إما مباشرة في خلايا البشرة ورقة أو في protoplasts واحد، والتي يمكن عزلها من أوراق التبغ تحول. هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة BiFC البروتين البروتين التفاعلات في بيئاتها الطبيعية داخل الخلية الحية. ومع ذلك، فإنه لابد من النظر إلى أن التعبير يجب أن تكون مدفوعة من قبل المروجين قوية والتي يتم تعديلها الشركاء التفاعل بسبب الانصهار من علامات مضان كبيرة نسبيا، والتي قد تتداخل مع آلية التفاعل. ومع ذلك، BiFC هو نهج تكميلية ممتازة لتطبيق أساليب أخرى عادة التحقيق البروتين البروتين التفاعلات، مثل coimmunoprecipitation، في المختبر فحوصات المنسدلة أو التجارب الخميرة اثنين والهجين.

في هذا المثال استخدمنا طريقة BiFC لرصد التفاعل بين عصاري خلوي الجزيئية HSP90 كوصي مع غشاء بروتينات الالتحام AtTPR7 وToc64. AtTPR7 هو جزء من translocon ثانية ويتفاعل مع المحرمين عصاري خلوي، والتي ربما تقديم preproteins إفرازية لإزفاء آخر متعدية إلى غشاء ER. وبالمثل، Toc64 في المغلف الخارجي بلاس...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين. ...

Video: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...