تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 323267، من كهرباء فرنسا (EDF) وL&#39;من الوكالة الوطنية دي لا بحوث - سانتيه-للبيئة وآخرون سانتي-العناء (ANR-SEST، Neurorad).

1. الإجراءات الحيوان وقد تم تصميم هذا البروتوكول وفقا لتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية من 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC) وتمت الموافقة من قبل لجنة مؤسسية لدينا على الرفق بالحيوان (CETEA-CEA DSV جيش الدفاع الإسرائيلي). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقن مع EDU / BrdU وتشعيع E14.5 الفئران الحوامل (الشكل 2A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل EDU في 1 ملغ / مل وBrdU في 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني. إجراء حقن داخل الصفاق (IP) من 100 ميكرولتر من الحل EDU باستخدام إبرة 25 G في الفئران الحوامل. في وقت لاحق 1.5 ساعة، أشرق الفئران (مجموع تشعيع الجسم) في غراي 0 أو 2 غراي (0.6 جراى / دقيقة). على الفور بعد، وضخ (IP) 200 ميكرولتر من الحل BrdU باستخدام 25 G الإبرة في الفئران الحوامل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شرائح الاكليلية من العقول الجنينية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1 ساعة أو 4 ساعات بعد التشعيع، الموت ببطء الفئران الحوامل بواسطة ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح جوف البطنتاي أكثر من ثلاثة سنتيمترات باستخدام المقص. فصل قرني الرحم عن بقية الرحم بواسطة باجتزاء كلا الأطراف من القرون. نقل قرون الرحم في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني 0.6٪ الجلوكوز. فتح قرون الرحم مع ملقط من أجل عزل الأجنة. إزالة الكيس الذي يحيط بالجنين من كل جنين باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح رؤساء الجنينية مع ملقط واصلاحها عن طريق الغمر في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، ودرجة الحموضة = 7.4) O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف رؤساء الجنينية في برنامج تلفزيوني لمدة ليلة واحدة على الأقل في 4 درجات مئوية. يمكن أن تظل رؤساء في برنامج تلفزيوني لعدة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رؤساء تغرس في البارافين باستخدام معالج فراغ تسلل كما هو مبين في الجدول رقم 1. رؤساء التضمين يمكن أيضا أن تتم تحت غطاء الكيميائية لإنتاج الإيثانول والحمامات xylen، ومن ثم في الفرن 65 درجة مئوية لمدة حمامات البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 ميكرون المقاطع الاكليلية سميكة مع مشراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على الشرائح المجهر المغلفة متعدد الليزين. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تبقى الشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أشهر. </li></ol></li></ol> 2. EDU / BrdU تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinization وفضح مستضد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize أقسام الدماغ جزءا لا يتجزأ من البارافين عن طريق الغمر من الشرائح في 3 حمامات التولوين لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب لمدة 3 دقائق في 2 حمامات كل الحلول لخفض تركيز الإيثانول على النحو التالي: الإيثانول بنسبة 100٪، والإيثانول 95٪، والإيثانول 70٪، و 5 دقائق في H 2 O. يمكن أن تبقى الشرائح في الماء منزوع الأيونات لعدة ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غلي شرائح لمدة 10 دقيقة في محلول سيترات (10 ملي، ودرجة الحموضة 6)، ثم احتضان في الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EDU تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الكشف EDU وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني ل 10min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X العازلة EDU المضافة عن طريق تمييع الحل 10X في الماء منزوع الأيونات. هذا الحل يجب أن تقدم طازجة وتستخدم في نفس داذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد EDU رد فعل الكوكتيل، بما في ذلك EDU اليكسا فلور 488 أزيد. فمن المهم لإضافة المكونات التالية النظام المدرجة في الجدول 2، وإلا فإن رد الفعل لا المضي قدما على النحو الأمثل. استخدام رد فعل كوكتيل EDU في غضون 15 دقيقة من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المخزن المؤقت permeabilization (الخطوة 2.1.1)، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من رد فعل EDU الكوكتيل، وضع ساترة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رد فعل كوكتيل EDU، ثم يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BrdU تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة التشبع مع 7.5٪ مصل الماعز و 7.5٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيوني. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة التشبع على شرائح الدماغ، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة. إضافة 150 ميكرولتر من الماوس مكافحة BrdU الأجسام المضادة الأولية مخففة في 1/300 العازلة التشبع، ووضع ساترة واحتضان O /N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس-Alexa594 الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 1/400 في المخزن التشبع، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة، ثم يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ النووية: إضافة 150 ميكرولتر من 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، ووضع ساترة واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح في تصاعد المتوسط. </li></ol></li></ol> 3. تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة أقسام الدماغ تحت المجهر مضان مع الهدف 20X أو المجهر متحد البؤر والحصول على صور في ثلاث قنوات (488 نانومتر، 594 نانومتر، والأشعة فوق البنفسجية) كما يفصل الملفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كومة الصور مع برنامج فوتوشوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل أقسام الدماغ في قطاع القياسية الجدار الدماغي ظهراني إنسي. هذا القطاع هو 100 ميكرون في بعدها الإنسي الأطراف، وينقسم إلى 18 صناديق (أو أكثر) من 10 μارتفاع متر في بعدها شعاعي باستخدام شبكة متراكبة على الصور (الشكل 1) كما هو موضح سابقا 31. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة الشبكة مثل بن الأول هو على السطح البطيني، بما لديها المحاذي للحدود طويلة البطين. ثم ترقيم EDU المسمى، BrdU و / أو نوى تغلظي (الموافق نوى أفكارك) في كل حاوية. عددهم نواة تقع على الحدود اثنين من صناديق في سلة المهملات والذي يحتوي على الجزء الأكبر منها، أو في أقل بن، عندما تحتل نواة مساحات متساوية داخل صناديق اثنين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحليل الإحصائي. </li></ol> تحليل اثنين على الأقل من شرائح القشرية في الجنين. تكرار التجارب على الأجنة لا يقل عن 3 من الفضلات المختلفة. وينبغي إيلاء النتائج على النحو الخطأ يعني ± المعياري للمتوسط ​​(SEM). وتجرى التحليلات الإحصائية مع Graphpad بريزم باستخدام اتجاهين أنوفا وBonferroni متعددة اختبارات المقارنة posthoc.

<ol>
	<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cerebral+cortical+areas.">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+he+neural+tube.">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li><li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+nuclei+IN+motion.">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li><li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+vertebrate+central+nervous+system:+revised+terminology.">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li><li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells.">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li><li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon:+a+major+site+of+neurogenesis.">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li><li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex.">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development.">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li><li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus.">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li><li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+p53+and+Fas/CD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation.">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li><li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice.">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li><li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development.">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li><li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+kinetics+and+radiation+biology.">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li><li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints:+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events.">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246, 629-634 (1989).</li><li>Weinert, T. A., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RAD9+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+evidence+that+its+function+acts+posttranslationally+in+cell+cycle+arrest+after+DNA+damage.">Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).</li><li>Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis.">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li><li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia:+a+new+explanation.">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li><li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain.">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li><li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+p21waf1/cip+-dependent+G1/S+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo.">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li><li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells.">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+(EdU)+and+5-bromo-2'-deoxyuridine+(BrdU)+in+flow+cytometry.">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li><li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint.">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li><li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-iT+EdU+Imaging+Kit.">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , (2011).</li><li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early,+middle,+and+late+S+phase.">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li><li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states.">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li><li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin.">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

التصميم التجريبي وصفها هنا على أساس إدماج EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وإدماج BrdU مباشرة بعد التشعيع يسمح التظاهرة التي NSPCs قادرون على تفعيل S ونقاط التفتيش G2 / M ولكن لا حاجز G1 / S خلال شارع في ساعة 1 بعد الإجهاد سمية جينية في الدماغ الماوس الجنين. أجرينا التجارب الأخرى الت...

أثناء نمو المخ الجنينية، يتم إنشاء الخلايا العصبية الإسقاط من قشرة الدماغ في منطقة البطين، وهي تتألف من ظهارة مطبقة كاذبة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC) أن خطوط البطينين الوحشي. بين NSPC، والخلايا الدبقية شعاعي (RGC)، والتي تكون بمثابة الخلايا الجذعية العصبية، والخضوع الهجرة النووية interkinetic (الحركة الوطنية العراقية): أنها تؤدي الانقسام على سطح البطين وS-المرحلة في حد القاعدية من منطقة البطين (VZ) 1، 2،3. يمكن يتقاسمونها إما بشكل متناظر لتوليد اثنين RGC أو غير متماثلة لتوليد RGC واحد والخلايا العصبية واحد أو خلية متوسطة السلف (IPC) 4، 5. IPC الهجرة إلى طبقة الفوقية المتكاثرة تسمى منطقة subventricular (SVZ)، حيث بعد تقسيم متماثل مشاركة واحدة أنها تولد اثنين من الخلايا العصبية الإسقاط غير ناضجة 6-8. خلافا للRGC، IPC لا تخضع الحركة الوطنية العراقية (مراجعة في 9). الخلايا العصبية ولدت حديثا migrأكلت شعاعيا على طول الألياف شعاعي من خلال منطقة وسطى (IZ) للوصول إلى وجهتهم النهائية في لوحة القشرية (CP) 10، 8. توقيت مثالي من كل هذه الأحداث أمر ضروري لتطوير القشرية الصحيح. على سبيل المثال يتم التحكم في التحول من الانتشار إلى التفريق بين السكان السلف العصبية قبل مدة المرحلة G1 11، 12. إطالة المرحلة G1 يرتبط بالتالي مع تمايز الخلايا. الإجهاد السمية، مثل الإشعاع المؤين، نمو الدماغ يضعف بشدة (إعادة النظر في 13). نحن وآخرون أظهرت أن NSPC عرضة للغاية لالإشعاع الناجم عن موت الخلايا المبرمج 14، 15،16. الإشعاعات المؤينة لحث على الحمض النووي المزدوج فواصل حبلا التي هي أشد ضررا على الخلايا المتكاثرة. أحد المكونات الأساسية لاستجابة الحمض النووي من التلف (DDR) في الخلايا ركوب الدراجات هو تفعيل نقاط التفتيش في دورة الخلية G1 / S أو G2 / M التحولات أو أثناء Sالمرحلة (نقطة تفتيش داخل S) 17-21. انهم منع تطور دورة الخلية لتوفير الوقت لإصلاح التلف في الحمض النووي أو التخلص من الخلايا التالفة أيضا. بالتالي، موت الخلايا وكذلك تأخير تقدم دورة الخلية قد يغير نمو الدماغ ردا على التعرض للإشعاعات المؤينة 22-24. ولذا كان من المثير للاهتمام أن وضع طريقة لتقييم تفعيل نقاط التفتيش دورة الخلية في NSPC في مخ الفأر الجنينية المشع. ويتبع تطور دورة الخلية بشكل روتيني باستخدام إدماج التناظرية ثيميدين، 5-برومو-2&#39;-deoxyUridine (BrdU). أدرج BrdU خلال المرحلة S من دورة الخلية، عندما يتم تكرار الحمض النووي. استخدام الأجسام المضادة ضد BrdU يسمح بعد ذلك للكشف عن الخلايا التي كانت في المرحلة S خلال نبض BrdU. يتم الكشف عن التناظرية ثيميدين الرواية، 5-إيثينيل-2&#39;-deoxyUridine (EDU) من قبل أزيد الفلورسنت. الطرق المختلفة للكشف عن وباء EDU<html> RDU لا تتفاعل عبر 25، وتمكن من الكشف في وقت واحد من كل من النظير ثيميدين، وهو أمر مفيد لدراسة تقدم دورة الخلية. وعادة ما تكون الخلايا الأولى مع نابض EDU ثم نابض مع BrdU، حيث الفترة الزمنية بين كل من المعلومات المدرجة تستمر بضع ساعات 25 و 26. إضافة BrdU في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على EDU النتائج في تفضيلي إدماج BrdU في الحمض النووي مع استبعاد كل من ايدو، بينما في وقت واحد بالإضافة EDU 25 مع BrdU متساوي المولية أو نصف متساوي المولية لنتائج سائل الإعلام إلا في BrdU التأسيس 27. هذا يبسط بروتوكول وضع العلامات المزدوجة من خلال القضاء على خطوات غسل التي تكون مطلوبة عادة لإزالة التسمية الأولى من وسائل الإعلام الثقافة قبل إضافة التسمية الثانية. وهذا هو أيضا من اهتمام خاص لفي الجسم الحي الدراسة، حيث الخطوات الغسيل ليست ممكنة، لتحديد التوقيت الدقيق لدخول مرحلة S أو الخروج من سكان الخلية. ر &quot;&gt; في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير وسيلة لوضع العلامات المزدوجة نبض في الدماغ الجنينية الماوس باستخدام EDU وBrdU 23، 24،22 لتحليل تطور دورة الخلية والحركة الوطنية العراقية من NSPC في الرحم بعد التشعيع. وعلاوة على ذلك فقد ثبت أنه، خلال المرحلة S، خلايا فأر تكرار أول المناطق كروماتين حقيقي ثم المغاير pericentric 28،29،30. ومن المثير للاهتمام، المغاير pericentric من الكروموسومات مختلفة تتجمع في نواة لتشكيل بؤر interphasic heterochromatic المعروف أيضا باسم chromocenters وكشفها بسهولة عن طريق تلطيخ دابي كما بؤر مشرق. لذلك، والفرق EDU وBrdU stainings من كروماتين حقيقي وchromocenters ساعدتنا على تحليل أكثر تحديدا المرحلة S تطور NSPC. يسمح هذا الأسلوب المظاهرة من النقص الواضح في نقطة تفتيش G1 / S في دعم البلاغات الوطنية 22-24، والذي يثير الدهشة تماما منذ يفترض هذا الحاجز أن تكون حاسمة للاستقرار الجينوم. عدة إكسبوقد استخدمت تصاميم erimental يعتمد على تركيبات مختلفة من ايدو BrdU والبقول لتحليل تقدم دورة الخلية في الدماغ الانتهائي بطني وظهري. هنا، نعطي مثالا على بروتوكولات السماح دراسة الحمض النووي من التلف الحاد في NSPC ضمن أول 4 ساعة التالية في الرحم تشعيع الأجنة E14.5 الماوس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

تتولد الخلايا العصبية في القشرة الدماغية أثناء نمو المخ من أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC)، والتي تشكل ظهارة مطبقة كاذبة بطانة البطينات الجانبية من الدماغ الجنينية. الضغوط السمية، مثل الإشعاع المؤين، يكون لها آثار ضارة للغاية على الدماغ النامية فيما يتعلق حساسية عالية من NSPC. توضيح الآليات الخلوية والجزيئية تشارك يعتمد على توصيف استجابة الحمض النووي من التلف من هذه أنواع معينة من الخلايا، الأمر الذي يتطلب وسيلة دقيقة لتحديد NSPC التقدم من خلال دورة الخلية في الأنسجة التالفة. هنا يظهر أسلوب يستند على حقن داخل الصفاق المتعاقبة من ايدو وBrdU في الفئران الحوامل وكذلك الكشف عن هذه نظائرها ثيميدين اثنين في أقسام الاكليلية من الدماغ الجنينية. على حد سواء أدرجت ايدو وBrdU في الحمض النووي للخلايا تكرار خلال المرحلة S ويتم الكشف عنها من قبل اثنين من تقنيات مختلفة (أو أزيدالأجسام المضادة المحددة، على التوالي)، التي تسهل الكشف عنها في وقت واحد. EDU وBrdU تلطيخ ثم يتم تحديدها لكل نواة NSPC في وظيفة من المسافة التي تفصله عن الهامش البطين في المنطقة مستوى لل telencephalon الظهرية. وبالتالي هذه التقنية وضع العلامات مزدوج يسمح تمييز الخلايا التي تقدم من خلال دورة الخلية من تلك التي تم تنشيطها نقطة تفتيش دورة الخلية مما يؤدي إلى اعتقال دورة الخلية ردا على الحمض النووي من التلف. ويرد مثال على التجربة، التي تم حقن EDU قبل التشعيع وBrdU مباشرة بعد وتحليلات أجريت داخل ساعة 4 التالية التشعيع. يوفر هذا البروتوكول تحليلا دقيقا للاستجابة حادة من الحمض النووي من التلف NSPC في وظيفة من مرحلة من مراحل دورة الخلية التي كانت قد تعرضت للإشعاع. هذه الطريقة بسهولة القابلة للنقل لكثير من النظم الأخرى من أجل تحديد أثر علاج خاص على تقدم دورة الخلية في الأنسجة الحية.

في التجربة وصفها في الشكل 2، كانت تدار EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وبعد التشعيع BrdU. أربعة أنواع من الخلايا ثم تميزوا في شرائح القشرية التي أعدت في 1 أو 4 ساعات بعد التشعيع، وفقا لإدماج إما EDU أو BrdU، على حد سواء أو لا شيء (أرقام 2A و 2B). الأهم من ذلك، لا ED...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress at JoVE.com

تقييم تطور دورة الخلية للخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية في دماغ الفأر النامي بعد الإجهاد السمي الجيني | علم الأعصاب | فيديو

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

إدارة اثنين من النظير ثيميدين، ايدو وBrdU، في الفئران الحوامل يسمح للتحليل تطور دورة الخلية العصبية في والخلايا الاصلية في مخ الفأر الجنينية. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد آثار الإجهاد السمية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، أثناء نمو المخ.

تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

assessing-cell-cycle-progression-neural-stem-progenitor-cells-mouse

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Views.  CEA DSV iRCM SCSR.  إدارة اثنين من النظير ثيميدين، ايدو وBrdU، في الفئران الحوامل يسمح للتحليل تطور دورة الخلية العصبية في والخلايا الاصلية في مخ الفأر الجنينية. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد آثار الإجهاد السمية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، أثناء نمو المخ. 

Video: Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

العصبية تشكيل مستعمرة الفحص الخلوي : إن الفحص تميز بحسن نية الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا العصبية السلف

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.