상테 - 환경 회사 - 이러한 결과로 이어지는 연구는 프랑스 전력 (EDF)에서 그리고 난 직원은 국립 드 라 공들인보기에서, 323,267을 부여 계약에 따라 유럽 연합의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)로부터 자금을받은 N °있다 등 상테 - 진통 (ANR-SEST, Neurorad).

1. 동물 절차 이 프로토콜은 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침, 1986 (86/609/EEC)에 따른 설계되어 동물 복지 (CETEA-CEA DSV IDF)에 대한 우리의 기관위원회에 의해 승인되었습니다. <ol><li> 에듀 / BrdU의 및 E14.5 임신 한 생쥐의 조사 (그림 2A)로 주입. <ol><li> PBS에서 5 ㎎ / ㎖에서 ML과 BrdU의 1 ㎎ /에 EDU의 솔루션을 준비합니다. 임신 한 생쥐에 25 G 바늘을 사용하여 에듀 용액 100 μL의 복강 내 주사 (IP)을 수행합니다. 1.5 시간 후, 0 Gy를 2 Gy의 (0.6 Gy를 / 분)에서 마우스 (전신 방사선 조사)를 조사. 직후, 임신 한 생쥐에 25 G 바늘을 사용하여 BrdU의 솔루션 (IP) 200 μl를 주입. </li></ol></li><li> 배아 뇌의 관상 조각의 준비. <ol><li> 조사 후 1 시간 또는 4 시간에서 이산화탄소에 의해 임신 한 쥐를 안락사. </li><li> 복부 CAVI를 엽니 다가위를 사용 삼cm에 타이. 뿔의 양극을 구획하여 자궁의 나머지 부분에서 두 개의 자궁 뿔을 분리합니다. PBS 0.6 %의 포도당이 포함 된 배양 접시에 자궁 뿔을 전송합니다. 배아를 분리하기 위해 집게로 자궁 뿔을 엽니 다. 집게를 사용하여 각 태아의 양막을 제거합니다. </li><li> 집게와 배아의 머리를 해부하고 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 산도 = 7.4) O / N에 침지하여이를 수정 </li><li> 4 ℃에서 적어도 하룻밤 PBS에서 배아의 머리를 씻어 헤드는 며칠 동안 PBS에 보관 될 수있다. </li><li> 표 1에 나타낸 바와 같이 진공 침윤 프로세서를 사용하여 파라핀에 포함 헤드. 매립 헤즈 또한 에탄올과 xylen 욕탕 화학 후드 하에서 수행 한 후 파라핀 욕탕 65 ° C의 오븐에서 할 수있다. </li><li> 마이크로톰으로 5 μm의 두께 코로나 섹션을 준비합니다. </li><li> 폴리 라이신 코팅 현미경 슬라이드에 장착합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 슬라이드 수개월 동안 실온 (RT)에서 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 에듀 / BrdU의 얼룩 <ol><li> 탈 파라핀과 항원 마스크 해제 <ol><li> 5 분 동안 톨루엔 3 화장실에 슬라이드 침지하여 파라핀 뇌 부분을 Deparaffinize. </li><li> 에탄올 100 %, 에탄올 95 %, 에탄올 70 %, 5 분 H 2 O에서 : 다음과 같은 에탄올의 농도가 감소하는 각 솔루션의 2 화장실에서 3 분 동안 재수 슬라이드는 몇 시간 동안 탈 이온수에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 구연산 용액 (10 mM의, 산도 6)에서 10 분 동안 조각을 삶아 한 다음 5 분 동안 탈 이온수에 품어. </li></ol></li><li> 에듀 염색 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 에듀 감지를 수행합니다. 10 분간 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과. </li><li> 탈 이온수의 10 배 솔루션을 희석하여 1X 에듀 버퍼 첨가제를 준비합니다. 이 솔루션은 갓과 같은 다 사용해야합니다예. </li><li> 에듀 알렉사 플 루어 488 아 지드를 포함, 에듀 반응 칵테일을 준비합니다. 이것은, 그렇지 않으면 반응이 최적으로 진행되지 않으며, 표 2에 나열된 순서로 다음의 성분을 추가하는 것이 중요하다. 준비 15 분 이내에 에듀 반응 칵테일을 사용합니다. </li><li> permeabilization 버퍼 (단계 2.1.1)를 제거하고 PBS로 두 번 세척한다. </li><li> 에듀 반응 칵테일의 150 μl를 추가, 커버 슬립을 넣어 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 에듀 반응 칵테일을 제거한 다음 PBS로 한번 세척한다. </li></ol></li><li> BrdU의 염색 <ol><li> 7.5 % 염소 혈청과 PBS에 7.5 % 소 태아 혈청 포화 버퍼를 준비합니다. , 뇌 조각에 포화 버퍼 150 μl를 추가 coverslip에 넣어 구속력이 특정 항체를 차단하기 위해 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 커버 슬립을 제거합니다. 포화 버퍼 1 /는 300 희석 마우스 방지 BrdU의 차 항체 150 μl를 추가, / 커버 슬립을 넣고 O를 품다4 ℃에서 N </li><li> 커버 슬립을 제거한 다음 PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 포화 버퍼에 1 / 400으로 희석 한 염소 항 - 마우스 Alexa594 차 항체 150 μl를 추가, 커버 슬립을 넣어 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 커버 슬립을 제거한 다음 PBS에 한 번 씻는다. </li><li> 핵 염색 : 4의 150 μL &#39;PBS에 1 ㎍ / ml로 -1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)를 추가, 커버 슬립을 넣고 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> 매체를 장착에 슬라이드를 장착합니다. </li></ol></li></ol> 3. 분석 <ol><li> 20X 목적 또는 공 초점 현미경과 형광 현미경으로 뇌의 부분을 검사하고 파일을 분리 등 세 개의 채널 (488 nm의, 594 nm의 UV)에서 이미지를 수집. </li><li> 포토샵 소프트웨어를 사용하여 이미지를 스택. </li><li> dorsomedial 대뇌 벽의 표준 분야에서 뇌 부분을 분석합니다. 이 분야는 중간 자적 차원에서 100 μM과 10 μ의 18 쓰레기통 (또는 그 이상)으로 나누어 져 있습니다로 이미지를 중첩 그리드 (그림 1)를 사용하여 반경 차원에서 m 높이 이전에 31을 설명했다. <ol><li> 상기 제 1 빈으로 그리드 정렬은 심실 국경의 긴 축과 평행, 심실 표면에 있습니다. 그런 다음 각 bin에 표시된 에듀, BrdU의 및 / 또는 pyknotic 핵 (세포 사멸 핵에 대응)의 번호. 핵이 두 개의 쓰레기통에서 동일한 영역을 점유 할 때 그것의 큰 부분, 또는 하단 용지함에를 포함 함 두 쓰레기통의 경계에 위치한 핵을 수. </li></ol></li><li> 통계 분석. </li></ol> 배아 당 최소 두 개의 대뇌 피질의 조각을 분석합니다. 다른 새끼에서 최소 3 배아에 대한 실험을 반복합니다. 결과는 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 제공해야한다. 통계 분석은 양방향 ANOVA와 Bonferroni 다중 비교 posthoc 테스트를 사용을 Graphpad 프리즘으로 실시하고 있습니다.

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저자는 이익에 대한 갈등이 없습니다.

에듀 1.5 시간의 정관에 따라 여기에 설명 된 실험 설계하기 전에 조사가 허용 된 후 즉시 조사 및 BrdU의 정관 NSPCs이 후 S 및 G2 / M의 체크 포인트를 활성화 할 수 있지만, 1 차 시간 동안 G1 / S 체크 포인트 수 없습니다 시위 태아 쥐의 뇌에서 유전자 독성 스트레스. 우리는 우리가 구체적으로 S 상 항목의 비율을 감상 할 수 있도록, 에듀 단지 1 시간 마우스를 희생하기 전에, 조사 및 BrdU의 후 ?...

배아 두뇌 개발하는 동안 대뇌 피질의 투사 신경 세포는 신경 줄기 및 전구 세포 (NSPC)의 다른 유형으로 구성 pseudostratified 상피는 라인 측면 심실, 심실 영역에 생성됩니다. NSPC 중, 신경 줄기 세포의 역할을 방사 아교 세포 (RGC)가,, (INM) interkinetic 핵 마이그레이션을 받아야 : 그들은 심실 영역의 기저 한계에서 뇌실과 S 상의 표면에 유사 분열을 수행 (VZ) 1,2,3. 그들은 나눌 수 있습니다 대칭으로 두 RGC를 생성하거나 불균형 한 RGC 하나의 신경 세포 또는 중간 전구 세포 (IPC) 4, 5를 생성합니다. IPC는 마지막으로 대칭 분할 후 그들은 두 개의 미성숙 투사 뉴런 6-8을 생성 subventricular 영역라는 상부의 확산 층 (SVZ)로 이동한다. RGC는 달리, IPC (9 검토) INM를 받아야하지 않습니다. 새로 생성 된 신경 세포는 백분율대뇌 피질의 플레이트 (CP) 10, 8 최종 목적지에 도달하기 위해 중간 영역 (IZ)를 통해 방사 섬유를 따라 방사형으로 먹었다. 모든 이벤트의 완벽한 타이밍은 정확한 대뇌 피질의 발달에 필수적이다. 예를 들어 신경 전구 인구의 분화 증식에서 스위치는 G1 단계 지속 기간 (11), (12)에 의해 제어된다. G1 단계의 연장은 세포 분화에 따라서 상관 관계. 등 (13에서 검토) 이온화 방사선, 심각하게 손상 뇌의 발달로 유전자 독성 스트레스. 우리와 다른 NSPC 방사선에 의한 세포 사멸 14, 15, 16에 대한 높은 경향이있는 것으로 나타났습니다. 전리 방사선은 세포 증식에​​ 가장 심각하게 손상되어 DNA 이중 가닥의 휴식을 유도한다. 자전거 세포의 DNA 손상 반응 (DDR)의 하나의 필수 구성 요소는 G1 / S 또는 G2 / M 전환이나 S시 세포주기 체크 포인트의 활성화입니다상 (내 S 체크 포인트) 17-21. 이들은 DNA 손상 보수 또는 너무 손상 세포의 제거를위한 시간을 제공하는 세포주기 진행을 차단. 따라서, 세포 사멸뿐만 아니라 지연 세포주기 진행은 방사선 노출 22-24 이온화에 응답 뇌 발달을 변경할 수있다. 이것은 조사 된 마우스 태아 뇌 NSPC에서 세포주기 체크 포인트의 활성화를 평가하는 방법을 개발하는 것이 흥미 있었다. 세포주기의 진행을 일상적 티미 딘 유사체, 5 - 브로 모-2&#39;-데 옥시 우리 딘 (BrdU의)의 혼입을 사용하여 이어진다. BrdU의은 DNA가 복제되어 세포주기의 S 단계에서 통합된다. BrdU의에 대한 항체의 사용은 BrdU의 펄스 동안의 S 단계에서 세포의되었습니다 이후 검출을 허용한다. 신규 티미 딘 유사체, 5 -에 티닐-2&#39;-데 옥시 우리 딘 (EDU)는 형광 지드에 의해 검출된다. 듀와 B를 검출하는 다른 방법<html> RDU는 세포주기 진행의 연구에 유용 모두 티미 딘 아날로그의 동시 검출을 가능하게 25을 교차 반응하지 않는다. 보통 세포는 처음 EDU와 펄스와 다음 모두 포함 과정 사이의 시간이 시간 (25, 26)의 커플을 지속 BrdU의와 펄스된다. 에듀을 포함하는 배지에서 BrdU의 첨가 EDU의 배제와 DNA에 BrdU의의를 우선적으로 편입 결과, 동안 만 BrdU의 내장 27 미디어 결과에 몰 또는 반 몰의 BrdU와 EDU (25)의 동시뿐만 아니라. 이것은 일반적으로 이전의 두 번째 레이블의 첨가 배양 배지에서 첫 번째 레이블을 제거하는 데 필요한 세척 단계를 제거하여 이중 라벨 프로토콜을 단순화합니다. 이것은 또한 S 상 항목 또는 세포 인구의 출구의 정확한 타이밍을 결정하는 세척 단계는 할 수 없습니다 생체 내 연구에 대한 특별한 관심입니다. t &quot;&gt; 최근, 에듀와 BrdU의 23, 24 및 22을 사용하여 배아 마우스 뇌의 듀얼 펄스 표시하는 방법은 자궁 조사에 후 세포주기의 진행과 NSPC의 INM을 분석하기 위해 개발되었습니다. 또한이 입증되었습니다 동안, 그 S 단계는, 마우스 세포는 먼저 euchromatin 영역 다음 근심 이질 염색질 28,29,30를 복제합니다. 흥미롭게도, interphasic 핵으로 클러스터 된 다른 염색체의 근심 이질 염색질도 chromocenters로 알려진 밝은 초점으로 DAPI 염색에 의해 쉽게 감지 염색질 초점을 형성한다. 따라서, euchromatin과 chromocenters의 차이 에듀와 BrdU의 염색에보다 정확하게 NSPC의 S 단계의 진행을 분석하는 것을 도왔다. 이 메서드는이 체크 포인트는 게놈의 안정성을 위해 중요한 것으로되어 있기 때문에 매우 놀라운 일이다 NSCP 22-24에서 G1 / S 체크 포인트의 명백한 부족의 데모를 허용했다. 여러 특급듀 및 BrdU의 펄스의 다양한 조합에 기초 erimental 디자인은 복부와 등쪽 telencephalon에서 세포주기의 진행을 분석하기 위해 사용되어왔다. 여기, 우리는 E14.5 마우스 배아의 자궁 조사에서 다음과 같은 제 4 시간 내 NSPC의 급성 DNA 손상의 연구를 허용하는 프로토콜의 예를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

대뇌 피질의 신경 세포는 배아 뇌의 좌우 심실을 안감 pseudostratified 상피 세포를 형성하는 신경 줄기 및 전구 세포의 다른 유형 (NSPC)에서 뇌를 개발하는 동안 생성됩니다. 같은 이온화 방사선으로 유전 독성 스트레스는 NSPC의 높은 감도와 관련된 뇌의 발달에 매우 해로운 영향이있다. 관련된 세포 및 분자 메커니즘의 해명은 손상된 조직에서 세포주기를 통해 NSPC 진행 상황을 확인하는 정확한 방법을 필요로 세포의 이러한 특정 유형의 DNA 손상 반응의 특성에 의존한다. 여기에 임신 한 쥐와 태아 뇌의 관상 섹션이 두 티미 딘 유사체의 추가 검출 에듀와 BrdU의 연속 복강 내 주사에 근거하는 방법을 보여줍니다. 에듀와 BrdU의 양쪽 S 단계에서 복제 세포의 DNA에 통합되어 두 개의 서로 다른 기술 (아 지드 또는에 의해 감지자신의 동시 검출을 용이하게 특정 항체, 각각). 에듀와 BrdU의 염색은 다음 지느러미 telencephalon의 표준 영역에서 심실 마진으로부터의 거리의 함수의 각 NSPC 핵에 대해 결정된다. 따라서이 이중 라벨 기술은 DNA 손상에 반응하여 세포주기 정지로 이어지는 세포주기 체크 포인트를 활성화 한 것과에서 세포주기의 진행을 통해 세포를 구별 할 수 있습니다. 실험의 예는 듀가 직후 조사 및 BrdU의 전에 주입 및 사출 다음 4 시간 이내에 실시하는 분석에서 제시된다. 이 프로토콜들이 조사되었다하는 세포주기의 위상의 함수 NSPC의 급성 DNA 손상 반응의 정확한 분석을 제공한다. 이 방법은 생체 조직의 세포주기 진행에 대한 특정 치료의 효과를 결정하기 위해 쉽게 transposable 많은 다른 시스템이다.

도 2에 설명 된 실험에서, EDU 단지 조사 후의 조사 및 BrdU의 1.5 시간 전에 투여 하였다. 세포의 네 가지 유형은 다음 에듀 또는 BrdU의 모두 또는 없음 중 하나의 결합에 따라 1 또는 4 시간의 사후 조사에서 준비 대뇌 피질의 조각 구별되었다 (그림 2A와 2B). 중요한 사실은, 듀 이용 BrdU의 내장 둘다 방사선 유도 아폽토시스 (데이터 미도시)의 레벨을 변화. 또한, 염색 방법은 EDU...

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Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress | Neuroscience | Video

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

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15.2K 조회수.  CEA DSV iRCM SCSR.  티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다. 

비디오: Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.