وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك (KMD، BD، AWM، السل، TBB، DJM، وWK)، الكتلة التميز فرانكفورت &quot;المجمعات ضخم الجزيئات&quot; بتمويل من جمعية الألمانية للبحوث (WK) وما بعد الدكتوراه EMBO طويل الأجل الزمالة (VAMG).

1. إعداد الميتوكوندريا من الخلايا أو الأنسجة التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي يصف هذا القسم إجراء عام لعزل الميتوكوندريا سليمة من الكائنات حقيقية النواة المختلفة. المكونات العازلة وسرعة الطرد المركزي دقة تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الأنسجة / دراسة الأنواع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر الخلايا في عازلة متساوي التوتر (على سبيل المثال، 250 ملي السكروز، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4)، وذلك باستخدام مطحنة الزجاج حبة (أفطورة الفطرية) 28، الهضم الأنزيمي من جدار الخلية (خميرة الخباز) 29، والحاملة للكرة الخالط (واحد -cell حقيقيات النوى / الثقافة خلية / الديدان الخيطية) 30، أو الخلاط (الأنسجة الحيوانية أو النباتية) 31. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحطام الخلية عن طريق الترشيح من خلال الشاش تليها منخفضة السرعة الطرد المركزي (2،000 x ج، 4 ° C و 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وطاف بيليه الميتوكوندريا بواسطة عالية السرعة الطرد المركزي (9،000 x ج، 4 ° C، 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الضرورة، استخدم متساوي التوتر خطوة متدرجة الكثافة لتنقية إضافية للجزء الميتوكوندريا 32. </li></ol> 2. إعداد الميتوكوندريا للالكترون البرد المقطعي يصف القسم التالي كيفية الحصول على العينات المجمدة-رطب لالبرد ET. ملاحظة: الأسلوب ينطوي على استخدام النيتروجين السائل شديد البرودة والإيثان، الذي يمكن أن يسبب حروقا جلدية شديدة. يجب ارتداء نظارات واقية وقفازات السلامة البرد الحماية. الإيثان السائل، الذي هو أيضا قابلة للاشتعال، يجب أن يتم التعامل معها في غطاء الدخان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend مكعبات الميتوكوندريا في 250 ملي طرهالوز، 10 ملي HEPES عازلة في درجة الحموضة 7.4 إلى تركيز حوالي 5 ملغ / مل البروتين الكلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توهج التفريغ شبكات EM الكربون هولي، جنبا الكربون تصل، في جهاز الفراغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسييل بعض ملليلتر من الإيثان عن طريق توجيه تيار من غاز الإيثان على الجانب الداخلي من بارد النيتروجين السائلإد حاوية الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من البروتين A-مترافق الذهب إيمانية تعليق 1: 1 مع تعليق الميتوكوندريا وتطبيق فورا 3 ميكرولتر إلى شبكة EM توهج التفريغ الذي عقد في ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ملاقط في جهاز التزجيج، على سبيل المثال، مقصلة محلية الصنع. وصمة عار من السائل الزائد مع إسفين من ورق الترشيح (~ 5 ثانية أو حتى يتوقف السائل نشر) والغطس على الفور إلى شبكة الإيثان السائل عن طريق الإفراج عن الزناد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكة من الإيثان السائل في النيتروجين السائل. أثناء النقل، وإزالة الزائد من الإيثان الشبكة مع ورق الترشيح. وضع غيض من قطعة على شكل وتد من ورق الترشيح في الإيثان السائل. كما تشرق الإيثان السائل، اسحب بلطف الشبكة تصل ورقة الترشيح ولكن يبقيه تحت الجبهة السائلة. تتم إزالة الإيثان السائل من الشبكة عن طريق عمل شعري مرة واحدة وتمت إزالة جميع الإيثان السائل، ونقل على الفور الشبكة في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشبكة المزجج في صندوق تخزين شبكة، والثانية تخزين تحت النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا عند الاقتضاء. </li></ol> 3. تسجيل من المقطعي الميل سلسلة يصف القسم التالي كيفية إعداد وجمع سلسلة الميل تصوير الشعاعي الطبقي من الحبيبات الخيطية مع المجهر Polara الإلكترون مجهزة مرشح الطاقة بعد العمود وكاميرا CCD. وتستخدم بروتوكولات مماثلة مع كل البرد الإلكترون المجاهر مجهزة CCD أو المباشرة الكاميرات كاشف الإلكترون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج اختبار عينة مثل الجرافيت والجزر الذهب على الفيلم الكربون هولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وضع البحث في نظام جرعة منخفضة من المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب عينة إلى ارتفاع eucentric. هذا هو الحد الأدنى من حركة نقطة س ص عند إمالة صاحب العينة. توسيط نقطة من الفائدة عند 0 درجة الميل، والميل المرحلة إلى 20 درجة وإعادة مركز نقطة عن طريق تغيير ض الارتفاع. العودة إلى 0 درجة وتكرار حتى يتم تصغير تعويض الوحشي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حددطريقة التعرض. اختيار التكبير المطلوب لتحصيل مقطعية (على سبيل المثال، 25،000X على كاشف ≈ 0.6 نانومتر حجم العينة بكسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار فتحة المكثف صغيرة (50-70 ملم) وتحديد حجم وكثافة بقعة شعاع بحيث الشعاع هو أوسع من مجرد جهاز التصوير ويعطي قراءة بكسل 60 ه - / بكسل (CCD) أو 14 ه - / بكسل / ثانية (كاشف الإلكترون المباشر، وطريقة العد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز فتحة المكثف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث جاوس التركيز على سبيل المثال، ونقاط الحد الأدنى من التباين. إعادة تعيين المجهر يزيل التباؤر القراءة الصحيحة والنقاط المحورية ومركز التناوب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال الهاتفي في يزيل التباؤر المطلوب لتسجيل مقطعية. ملاحظة: عالية يزيل التباؤر (8 ميكرومتر) يزيد النقيض ولكن يقلل القرار، في حين يزيل التباؤر منخفضة (2-4 ميكرون) يزيد قرار على حساب التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكثر من حفرة فارغة، وتوليد إشارة مكاسب جديدة ومواءمة مرشح الطاقة وفقا لالصانعالتعليمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة طرق البحث والتعرض. في وضع التعرض، وتوسيط نقطة الاهتمام والتحول إلى البحث عن واسطة. حدد التكبير من 1،500X (0.033 ميكرون / بكسل من العينة على كاشف) ويزيل التباؤر من 100 ميكرون (لزيادة النقيض). جلب نقطة اهتمام العودة إلى مركز باستخدام لفائف تحول الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وضع البحث، وضبط حجم وكثافة بقعة شعاع بحيث الشعاع هو أوسع من مجرد جهاز التصوير ويعطي قراءة بكسل ~ 20 ه - / بكسل (CCD) أو ~ 8 ه - / بكسل / ثانية (كاشف الإلكترون المباشر، عد واسطة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على عينة منطقة جيدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الشبكة مع الميتوكوندريا المجمدة-رطب في المجهر الإلكتروني في درجة حرارة النيتروجين السائل (يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة الصانعة EM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وضع البحث، البحث في الشبكة للمناطق المناسبة سمك الجليد ونوعية العينة. تأخذ 6 ثانية البحث عن الصور من المناطق الواعدة لتحديد مدى ملاءمتها لجمع مقطعية. بوتح ينبغي أن يكون غشاء الميتوكوندريا الداخلي والخارجي مرئية في هذا التكبير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل من الميل سلسلة المقطعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم العثور على منطقة عينة جيدة، وإمالة مرحلة ± 60 درجة لتحديد أقصى مدى الميل ما هو متاح من دون أي عرقلة أو التعرض مجال التركيز من شبكة القضبان أو كتل الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على حفرة مملوءة الجليد قريب من مظهر مماثل، تغيير إلى وضع التعرض وضبط شدة شعاع أو الحصول على الصور مرة لذلك كل الصورة المسجلة لديها جرعة الإلكترون من 30-50 ه - / بيكسل للأجهزة المتقارنة بواسطة الشحنات أو البريد 6-8 - / بكسل / ثانية كشف الإلكترون مباشرة، عد واسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة توزيع جرعة (I 0 / I 60) بقسمة متوسط ​​عدد الإلكترونات لصورة 1 ثانية المكتسبة في 0 درجة مع أن من 60 درجة صورة. توضح هذه نسبة الزيادة في وقت التعرض المطلوب للحفاظ على عدد الإلكترونات لكل صورة ثابتة مع زيادة زاوية الميل (التعرض الوقت = 1 / جنظام التشغيل (α) n حيث (I 0 / I 60) = 2 ن). يخدم النسبة أيضا باعتبارها مؤشرا جيدا لسمك الجليد. عادة يتم تسجيل tomograms جيدة من الميتوكوندريا مع I 0 / I 60 = 2،3-2،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكثر من حفرة فارغة، والحصول على صورة 1 ثانية في وضع التعرض ولاحظ عدد الإلكترونات في Å 2. مع مراعاة نسبة توزيع جرعة، وحساب إجمالي عدد الصور التي يمكن تسجيلها لجرعة الإلكترون الإجمالية محددة (على سبيل المثال، &lt;40 ه - / 2 لتحديد هيكل و~ 160 ه - / 2 لمورفولوجيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الفاصل الزمني المناسب الميل لجمع مقطعية بقسمة مجموع مجموعة الميل (على سبيل المثال، 120 درجة لل± 60 درجة) على العدد الكلي من الصور المحسوبة في 3.3.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتسجيل مقطعية مع المعايير المحددة أعلاه باستخدام برامج جمع البيانات التلقائي المناسب 33، 34. وعادة ما تكون بدأت سلسلة الميل في ± 20 درجة و تمر 0 درجة قبل الوصول يميل عالية من أجل تعظيم محتويات المعلومات من الصور الميل المنخفض الذي دمر خلال زيادة جرعة إلكترون. </li></ol> 4. إنشاء وتجزئة وحدات التخزين المقطعي يصف هذا القسم كيف يتم إنشاء مجلدات تصوير الشعاعي الطبقي من الميتوكوندريا من سلسلة الميل وكيف موجودة للعرض العام على وحدات التخزين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ سلسلة المقطعي الميل إلى الدليل المناسب. توليد كومة الصورة وتحويله إلى تنسيق الملف المناسب مع البرمجيات مفتوحة المصدر، مثل dm2mrc أو tif2mrc (حزمة IMOD) التي تحول .dm3، .dm4 أو ملفات .tif إلى أكوام لجنة نهر الميكونج. ويلزم مداخن MRC لإعادة الإعمار مقطعي مع IMOD 35. حزم أخرى تتطلب تنسيقات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة الصور وتوليد مقطعية باتباع الخطوات بالتفصيل في البرنامج التعليمي IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعزيز النقيض من مقطعية باستخدام غير الخطية مرشح متباين الخواص نشر توزيعها مع IMOD. هذا الفلتر يعمل بشكل جيد للأغشية والجسيمات المرتبطة غشاء مثل ATP سينسيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التصور، يدويا شريحة مقطعية من يستخدم البرامج المتاحة تجاريا مثل أميرة. تعيين voxels الموافق الغشاء الداخلي أو الخارجي وتوليد السطح. باستخدام الخيار الفرس في البرنامج المساعد EM-36 حزمة لAMIRA احتفال موقع ATP سينسيز الجسيمات. </li></ol> 5. Subtomogram المتوسطات من ATP سينسيز Dimers وتركيب الهياكل X-راي يصف القسم التالي كيف يمكن الحصول على المتوسطات subtomogram من ATP سينسيز dimers. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جزيئات علامة مداخل وحزمة البرامج المناسبة مثل &quot;الجزءتقدير ICLE لبرنامج الكترون المقطعي &quot;، وحساب متوسط ​​subtomogram. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستصدار قرار التقدير، المقارنة بين متوسطات subtomogram تحدد بشكل مستقل من قبل فورييه قذيفة ارتباط 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا المتاحة، قفص الاتهام المعروف الهياكل الأشعة السينية في المتوسط ​​subtomogram من قبل هيئة جامدة المناسب، إما يدويا أو باستخدام الآلية الروتينية لرسو السفن متتابعة مثل تلك الموجودة في برنامج الوهم 38. </li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

بروتوكول المعروضة هنا يوفر مقدمة لالبرد ET وsubtomogram المتوسط ​​من الميتوكوندريا، ولكن يمكن تطبيق نفس الإجراء أساسا لأي حجرة أو غشاء الخلية الأخرى. للحصول على أفضل البيانات الممكنة، الخطوات الحاسمة أثناء إجراء وإعداد العينات و الاستراتيجية يغرق عملية التجميد واكتساب البيانات. جودة العينة، وهو أمر حاسم لتحقيق النجاح، ويعتمد على بروتوكول تجميد الأمثل لضمان سماكة الجليد مناسب، وهو أمر ذو أهمية قصوى لصورة جيدة التباين. الاستراتيجية المثلى للحصول على البيانات تعتمد على الصك وعينة. تشمل المعلمات ليكون الأمثل جرعة الإلكترون لكل صورة، مخطط الميل ويزيل التباؤر. الحصول على صورة مقطعية جيد لعينة جيدة يجعل تجهيز جميع المزيد من الخطوات أسهل ويضمن النتيجة النهائية مرضية. البرد ET جنبا إلى جنب مع المتوسط ​​subtomogram والنموذج المناسب الذري تقدم تفاصيل عن كيفية ترتيب المجمعات البروتين في الالبيئة الخلوية المحلية سعر الفائدة الفعلي. هذه التقنية هي مناسبة بالتساوي للتحقيق في هيكل مجمعات البروتين غشاء الكبيرة، مثل سلسلة supercomplexes التنفسي (1.7 MDA)، dimers سينسيز ATP (2x500 كيلو دالتون)، أو مجمع المسام النووية (~ 120 MDA) 8، 9، 17. تنظيم بطولة dimers سينسيز في الصفوف لا يمكن ملاحظتها بواسطة تقنيات عالية الدقة مثل البلورات بالأشعة السينية، NMR أو واحد الجسيمات البرد EM، لأن تتعطل الصفوف ديمر عن طريق استخراج المنظفات، وهي خطوة ضرورية في العزلة وتنقية مجمعات البروتين الغشاء. ترتيب سينسيز ATP في صفوف من dimers على طول التلال أعراف هو مبدأ التنظيم العالمي الميتوكوندريا في جميع الأنواع. المجمعات البروتون ضخ سلسلة نقل الإلكترون، في مجمع معين الأول (NADH نازعة)، وتقع في المناطق غشاء جانبي الصفوف 8،9. هذا تنظيم السلسلة التنفسية لها تأثير عميق على الطاقة الحيوية الميتوكوندريا. إذا كانت الصفوف ديمر لا يمكن أن تشكل بسبب غياب مفارز البروتين ديمر محددة، الخلايا تظهر مرة جيل أطول وانخفاض اللياقة البدنية الخلوية، كما لوحظ في متحولة الخميرة هو مبين في الشكل (3) 41. مع الاهتمام المتزايد في أمراض الميتوكوندريا، وهي مفصلة فهم الأساس الجزيئي التركيب الدقيق الذي يحكم وظيفة الميتوكوندريا هو من أهمية قصوى. يوفر الإلكترون البرد المقطعي وجود صلة بين بنية البروتين الذي تحدده أساليب عالية الدقة، وتوزيع وترتيب هذه البروتينات في الغشاء على نطاق نانومتر. هذا يجعل البرد ET أداة أساسية لفهم بنية وظيفة الميتوكوندريا في الصحة والمرض. وتشمل التطورات التقنية ومزيد من التحسينات في البرد ET استراتيجيات بروتين وضع العلامات لتحديد موقف من البروتيناتن مفارز في المجمعات الجزيئات أو موقع البروتينات متميزة أصغر أو أقل (&lt;0.5 MDA) في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، أساليب المعالجة الهجين EM، التي تجمع بين subtomogram المتوسط ​​مع تحليل جسيم واحد أو إعادة الإعمار حلزونية قد قررت مؤخرا هياكل البروتين ل~ 8 42، 43. وتقتصر هذه الأساليب المعالجة حاليا لتنقية البروتينات، التي يتم فصلها جيدا في الجليد أو تشكيل الجمعيات حلزونية وحاليا لا تنطبق على البيئات الخلوية المزدحمة مثل الميتوكوندريا وأعراف الأغشية. لجمع البيانات، ويجري تطوير الحوسبة والأجهزة أدوات جديدة لتمكين اكتساب مقطعية الآلي، وزيادة تباين الصورة وتقليل الجرعة الإجمالية المطلوبة الإلكترون. الحد الأساسي الوحيد في البرد ET هو الضرر الإشعاعي للعينة بواسطة شعاع الالكترون. هذا يعني أن الإلكترون فقط جرعات منخفضة جدا يمكن استخدامها لتسجيل كل صورة من سلسلة الميل المقطعي، مما أدى إلى ضعف إشارة رنسبة يحد في نهاية المطاف القرار تحقيقه س الضوضاء. وكشف الإلكترون المباشر الجديدة، صدر قبل أقل من عام، ويتم حاليا ثورة مجال واحد الجسيمات البرد EM 44، 45. توفر هذه كاشفات جديدة النقيض أعلى وأفضل قرار في أقل جرعة الإلكترون. للإلكترون البرد التصوير المقطعي، وهذا يعني أن سلسلة الميل مع أحجام خطوة صغيرة أو حتى tomograms محور مزدوج يمكن جمعها دون المخاوف بشأن أضرار الإشعاع المفرط (اتفاقية مكافحة التصحر صورة واحدة تعادل في جرعة الإلكترون إلى 5 الصور مباشرة كاشف الإلكترون). على كميات هائلة من البيانات التي تنتجها هذه كاشفات تخلق التحديات الخاصة في التعامل مع البيانات ومعالجتها وتخزينها، والتي سيتعين التغلب عليها. وبالإضافة إلى ذلك، لوحات المرحلة، والتي تعمل على مبادئ مماثلة لتلك التي تستخدم بشكل روتيني في المجهر الضوئي لتعزيز المرحلة النقيض من ذلك، يجري حاليا تطويرها للانتقال المجهر الإلكتروني 46، 47. هذا يجب أن تسمح tomograms التي يتعين جمعها أقرب إلى التركيز وبالتالي على دقة أعلى، بينما في نفس الوقت الحفاظ على منخفضة الدقة الميزات الضرورية للمواءمة وتفسير أحجام تصوير الشعاعي الطبقي. أخذت معا، فإن هذه التطورات التكنولوجية بشكل كبير توسيع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن معالجتها من خلال البرد ET.

الميتوكوندريا هي السلطة منازل للخلية. عن طريق تحويل بروتون والتدرج الكهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا إلى طاقة الرابطة الكيميائية، وسينسيز ATP الميتوكوندريا تنتج معظم ATP التي تحرك العمليات الخلوية. من أجل فهم الآليات وراء تحويل الطاقة الميتوكوندريا، نحن بحاجة إلى تحديد هيكل سينسيز ATP في الموقع، ومعرفة كيف يتم ترتيب ذلك وزعت في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. على الرغم من أن الهياكل عالية الدقة لمعظم مكونات الميتوكوندريا سينسيز اعبي التنس المحترفين 1-3 والخرائط منخفضة الدقة من كله معقد 4 متاحة، فمن المهم وضع هيكل والتشكل من عمل انزيم في الغشاء. وقد افترض توزيع سينسيز ATP في غشاء الميتوكوندريا الداخلي على نطاق واسع أن يكون عشوائيا، ولكن في وقت مبكر إيجاد 5 والنتائج الأولية الخاصة بنا 6 إلي أن ذلك لا تانه حالة. وقد أكدت الدراسات اللاحقة من مجموعتنا وآخرون 7 أن يتم ترتيب سينسيز ATP في صفوف طويلة من dimers على طول التلال المنحنية بإحكام من الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أعراف 8، في حين تظهر مضخات البروتون من سلسلة نقل الإلكترون إلى أن يكون موجودا في أي من الجانبين من الصفوف 9. هذا الترتيب له انعكاسات هامة على آليات تحويل الطاقة الميتوكوندريا. هذه التقنية التي استخدمناها لتحديد هذا الترتيب هي الإلكترون البرد التصوير المقطعي (البرد ET). البرد ET حاليا الطريقة الوحيدة التي توفر دقة ثلاثي الأبعاد (3D) حجم الخلايا، ومقصورات الخلوية أو العضيات في قرار الجزيئي. البرد ET مناسبة خاصة لدراسة المجمعات الكبيرة في الأغشية البيولوجية، لأن الأغشية تظهر مع النقيض جيدة وسهلة لتتبع في حجم المقطعي 3D. أساليب أخرى لدراسة هيكل 3D من الخلايا أو organellوفاق لا توفر التفاصيل الجزيئية. سوبر ضوء قرار المجهري 10، 11 هو رائع في الكشف عن موقف أو المسافات بين الباعثة للضوء تسميات تعلق على البروتينات في المصالح مع دقة عشرات نانومتر، لكنه لا يكشف هيكل البروتين نفسه، حتى في دقة منخفضة . المجهر انتقال الإلكترون من أقسام التسلسلية 12 أو التصوير كتلة وجه عن طريق مسح الإلكترون المجهري 13 من العينات البيولوجية البلاستيكية جزءا لا يتجزأ من تقدم وجهات النظر منخفضة الدقة من وحدات التخزين الخلوية ولكن أيضا لا تكشف التفاصيل الجزيئية. يمكن أن قوة المجهر الذري 14 في مبدأ تقديم قرار الجزيئي أو حتى الذري، ولكن فقط على سطح الأشياء على، دعم قوي مسطح بالذرة. أخيرا، الأشعة السينية التصوير المقطعي 15 أو تناثر مكثفة نبضات الأشعة السينية وأشعة الليزر من الإلكترون الحر 16 من غير المرجح أن تكشف عن بنية معقدة كبيرة، والأشياء، لادوري مثل الخلايا بأكملها أو العضيات في مقرار olecular في المستقبل المنظور. وهكذا في الوقت الحاضر، لا يوجد بديل لالبرد ET للدراسات لهيكل 3D من الخلايا أو العضيات في قرار نانومتر. البرد ET هو الأسلوب المفضل لدراسة هيكل والتشكل المجالس البروتين المرتبط الغشاء بما في ذلك مجمع المسام النووية 17، وارتفاع أنفلونزا مجمعات 18، وسياط البروتينات السيارات 22، 23 ولكن أيضا تنظيم الخلايا البكتيرية كلها 19 ودخول الفيروسات المسببة للأمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية في الخلايا 20-23. البرد ET لا يقدر بثمن لتصور البروتينات الخيطية وتفاعلاتها في الخلية، بما في ذلك خيوط الأكتين 24 أو 25 axonemes. ويمكن تعزيز القرار إلى 2 نانومتر أو أفضل من المتوسط ​​subtomogram 26، حيث يتم قطع subvolumes المتكرر، وميزات العادية من حجم المقطعي وبلغ متوسط ​​بواسطة واحد الجسيمات الصورة المواليةتقنيات cessing. البرد ET ينطوي على اكتساب سلسلة من الصور الإسقاط من عينة رقيقة (&lt;التدوير 250Nm) التي اتخذت في زوايا الميل المختلفة في المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). يجب أن تكون العينة رقيقة بحيث الإلكترونات، التي تتفاعل بقوة مع المسألة، وتتناثر لا أكثر من مرة. نثر متعددة يجعل الصور الناتجة من الصعب تفسير ويقلل التباين. يتم محاذاة الصور للمنطقة العينة المختارة بالنسبة لبعضها البعض، ويتوقع في الفضاء 3D باستخدام برنامج كمبيوتر مناسب، وتوليد حجم 3D للعينة. وساعد محاذاة الصور عن طريق علامات إيمانية الذهب، والتي تختلط مع العينة قبل التجميد. يجب أن تكون علامات إيمانية مثالي 10 أو أكثر موزعة بالتساوي موجودة في كل صورة لتحقيق المواءمة جيدة. لمراقبة التفاصيل الجزيئية، العينات المجمدة-يغرق في الإيثان السائل، الذي يحفظ الدولة رطب الأصلية الخاصة بهم. في تجميد السائلالإيثان هو سريع جدا (5 ~ 10 درجة مئوية / ثانية) 27 لا تتبلور الماء ولكن لا يزال في، تشبه الزجاج الدولة المزجج. الكريستال الجليد الأضرار تشكيل الهياكل البيولوجية الحساسة. كما تعاني العينات البيولوجية من أضرار الإشعاع، هناك حد لعدد الكلي للنثر الأحداث يمكن أن يتسامح مع العينة. وهكذا اكتسب الصور في وضع جرعة منخفضة: تم تحديد مساحة الفائدة عند التكبير المنخفض (1،500X) مع جرعة أقل من 1 إلكترون ه - / 2 نانومتر (طريقة البحث). ثم يتم تركيز الصورة في التكبير العالي، قبالة منطقة (وضع التركيز) الفائدة. فقط عندما يتم الحصول على صورة، والمشع مجال الاهتمام مع جرعة الإلكترون أعلى (وضع التعرض). هنا، نقدم لمحة عامة عن كيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms، وذلك باستخدام ATP dimers سينسيز في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا كمثال. يصف بروتوكول التالي كيفية تحضير الميتوكوندريا لالبرد ET، كيفية إعدادوجمع سلسلة الميل بلغ إجمالي جرعة الإلكترون محددة، وكيفية معالجة سلسلة الميل للحصول على حجم 3D من مساحة الفائدة. ويتضح لمحة عامة عن الإجراء في الشكل 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

الإلكترون البرد المقطعي هو أداة قوية في علم الأحياء الهيكلي، قادرة على تصور هيكل ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية، مثل الخلايا، العضيات، غشاء الحويصلات، أو الفيروسات في التفاصيل الجزيئية. لتحقيق ذلك، والمزججة العينة المائية بسرعة في الإيثان السائل، الذي يحافظ عليه في دولة المجمدة-رطب مقرب لمواطن. في المجهر الإلكتروني، يتم تسجيل سلسلة الميل في درجة حرارة النيتروجين السائل، والتي يتم بناؤها tomograms 3D. نسبة الإشارة إلى الضوضاء من حجم المقطعي منخفضة بطبيعتها. يتم تحسين معترف بها، وميزات المتكررة التي subtomogram المتوسط، الذي يتم قطع subvolumes الفردية خارج، وبلغ متوسط ​​محاذاة للحد من الضوضاء. بهذه الطريقة، خرائط 3D مع قرار من 2 نانومتر أو أفضل يمكن الحصول عليها. A نوبة من الهياكل ذات الدقة العالية المتاحة للحجم 3D ثم تنتج النماذج الذرية المجمعات البروتين في بيئتها الأصلية. نحن هنا تظهر كيف نستخدم الإلكترون البرد tomograpHY دراسة في الموقع تنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الميتوكوندريا. نجد أن يتم تنظيم synthases ATP في صفوف من dimers على طول قمم عالية مقوسة من أعراف الغشاء الداخلي، في حين مجمع I يتم توزيع عشوائيا في المناطق غشاء على جانبي الصفوف. بواسطة subtomogram المتوسط ​​حصلنا على هيكل الميتوكوندريا ATP سينسيز ديمر داخل غشاء أعراف.

الإلكترون البرد tomograms من الميتوكوندريا تكشف بوضوح مورفولوجيا 3D من عضية (الشكل 2). تجزئة اليدوية للأغشية في حجم المقطعي توضح هيكل أعراف في الحبيبات الخيطية. بواسطة التصوير الميتوكوندريا من مختلف سلالات الخميرة خروج المغلوب التي تفتقر إلى بعض المكونات البروتين، وتأثير هذه البروتينات على أعراف التشكل يمكن من خلال تقييم الشكل 3 يظهر الحبيبات الخيطية من سلالة الخميرة التي تفتقر إلى ATP سينسيز فرعية الإلكترونية. مطلوب هذا المكون من مجمع سينسيز ATP لdimerization من سينسيز ATP الميتوكوندريا. الميتوكوندريا من هذه السلالة تفتقر إلى أعراف رقائقي طبيعي من الميتوكوندريا wildtype (الشكل 2) وبدلا تحتوي على عدد حجرات الأغشية الداخلية. هذه الأجزاء هي إما خالية من أعراف أو تحتوي على الانغلافات غشاء على شكل بالون صغيرة (الشكل 3). في توم<html> ograms مع تباين جيد والمجمعات الكبيرة البروتين الميتوكوندريا، في هذه الحالة ATP dimers سينسيز، يمكن رؤيتها بسهولة (الشكل 4، فيلم 1). يمكن تحديد هياكل المجمعات في 2-3 قرار نانومتر بواسطة subtomogram المتوسط ​​(الشكل 5. فيلم 2). ويمكن وضع متوسط ​​أحجام العودة الى مقطعية لتقييم تنظيم المجمعات الفردية بالنسبة لبعضها البعض وغيرها من المجمعات البروتين في غشاء (الشكل 6؛ فيلم 3). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. تدفق-بيانيا يبين مراحل الإلكترون البرد المقطعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> ogether.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. الصرف من الحبيبات الخيطية من wildtype S. الخباز. شريحة الوسطى من خلال حجم المقطعي من wildtype S. الحبيبات الخيطية الخباز (يسار) والحجم أصدرت سطح المقابلة (يمين). يظهر حجم مجزأة من الغشاء الخارجي باللون الرمادي ومجلدات من الحدود الداخلي وأعراف الأغشية باللون الأزرق الفاتح. مقتبس من ديفيز وآخرون 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. الخيطية Mitochondrion من S. سلالة الخباز تفتقر حدة فرعية اللازمة لATP سينسيز dimerization. شريحة من خلال حجم الشعاعي الطبقي (يسار) والمرافق الحجم المقدمة السطح (يمين) من الحبيبات الخيطية من S. سلالة الخباز تفتقر إلى البروتين البريد فرعية اللازمة لATP سينسيز dimerization. بالمقارنة مع الشكل 2، والحبيبات الخيطية من سلالة متحولة تفتقر إلى أعراف رقائقي طبيعي من الميتوكوندريا wildtype. بدلا من ذلك، الحبيبات الخيطية لديها العديد من المقصورات الغشاء الداخلي إما مع أي أعراف أو على شكل بالون أعراف. وبالتالي الإلكترون البرد المقطعي يبرز التغيرات في التشكل الغشاء بسبب الحذف الجين. مقتبس من ديفيز وآخرون 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> شملت رقمالبريد 4. الخيطية Mitochondrion من فطر P. الوزية. شريحة من خلال حجم الشعاعي الطبقي (يسار) والحجم جعل سطح المصاحب (يمين) من الحبيبات الخيطية من الفطريات الخيطية P. الوزية. في هذا مقطعية، الصفوف من 10 نانومتر الجسيمات (النصال الصفراء) وتقع فوق التلال غشاء منحنية للغاية في أعراف الغشاء الداخلي (انظر فيلم 1). وقد تم تحديد هذه الجسيمات كما dimers ATP سينسيز بواسطة subtomogram المتوسط. من ديفيز وآخرون 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. هيكل وتنظيم سينسيز ATP الميتوكوندريا. جانبية ومن أعلى تبين كثافة الإلكترونات من سينسيز ديمر ATP من S. ج<html> erevisiae على النحو الذي يحدده subtomogram المتوسط ​​مع نماذج الذرية المجهزة (يسار). الميتوكوندريا الداخلية غشاء الحويصلة تبين تنظيم ATP dimers سينسيز في الصفوف (يمين). تكونت الرقم عن طريق وضع المتوسط ​​subtomogram من سينسيز ديمر ATP في حجم مجزأة من حويصلة الغشاء، وذلك باستخدام الإحداثيات خلال حساب المتوسط. مقتبس من ديفيز وآخرون 8. نماذج الذرية: F 1 / الدوار الدائري [PDB: 2WPD] 39 (الأزرق والأرجواني). أوليغوميسين حساسة تمنح البروتين OSCP [PDB: 2BO5] 40 (الخضراء). الطرفية ساق جزء [PDB: 2CLY] (1) مع بقايا N-النهائية من [PDB: 2WSS] (2) (الأصفر والأحمر) (انظر فيلم 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الرقم 6. المعزولة عرف الحويصلة من P. الوزية الحبيبات الخيطية. شرائح من حجم المقطعي (يسار) والحجم أصدرت سطح المصاحب (يمين) من حويصلة عرف من P. الوزية. كثافة البروتين جاحظ من الغشاء مرئية بوضوح. كثافة المشار إليها النصال الصفراء هي dimers سينسيز اعبي التنس المحترفين، كما حددها subtomogram المتوسط. وتشير السهام الخضراء لكثافة الأجسام المضادة التي حددها وضع العلامات كما NADH نازعة (مجمع 1، لمزيد من التفاصيل انظر 9). تجزئة من كثافة البروتين يكشف منظمتهم في أعراف، مع dimers ATP سينسيز (الأحمر والأصفر) تشكيل الصفوف على طول التلال أعراف منحنية للغاية والمجمعات NADH نازعة (الأخضر) في المناطق غشاء على جانبي الصفوف (انظر فيلم 3). من ديفيز وآخرون 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. الفيلم 1. الكترون البرد مقطعية لP. الوزية الحبيبات الخيطية، ويظهر الفيلم شرائح متتالية من خلال حجم المقطعي التي اتخذت من الحبيبات الخيطية من الفطريات الخيطية P. الوزية. يشار إلى صفوف ATP سينسيز بواسطة النصال الصفراء. يظهر للسطح المقدمة، وحجم مجزأة موقع ATP سينسيز (المجالات الصفراء) فيما يتعلق بنية أعراف 3D. الغشاء الخارجي، والرمادي. غشاء الحدود الداخلي والأزرق الشفاف. أعراف الأغشية والأزرق مبهمة. من ديفيز وآخرون 9. انظر الشكل 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> فيلم 2. المتوسط ​​Subtomogram من الميتوكوندريا ATP سينسيز ديمر من S. الخباز مع نماذج الذرية المجهزة. كان المتوسطتحسب من 121 subvolumes. يتم عرض كثافة على ثلاثة مستويات كفاف: 1S - عيون، 2S - رمادي فاتح و3S - الرمادي الداكن. تم تركيب نماذج الذرية في كثافة استخدام روتين مناسبا متتابعة في الوهم. نماذج الذرية: F 1 / الدوار الدائري [PDB: 2WPD] 39 (الأزرق والأرجواني). أوليغوميسين حساسة تمنح البروتين OSCP [PDB: 2BO5] 40 (الخضراء). الطرفية ساق جزء [PDB: 2CLY] (1) مع بقايا N-النهائية من [PDB: 2WSS]. 2 (الأصفر والأحمر) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> مقتبس من ديفيز وآخرون 8. انظر الشكل 5. فيلم 3. المعزولة أعراف الحويصلة من P. وتظهر الحبيبات الخيطية الوز. شرائح متتالية من خلال حجم المقطعي، تليها الحجم أصدرت سطح مجزأة. كثافة البروتين جاحظ من membranه هي واضحة للعيان. كثافة الحمراء والصفراء هي dimers سينسيز اعبي التنس المحترفين. الكثافة الخضراء هي NADH نازعة (مجمع الأول) على النحو الذي يحدده وضع العلامات الأجسام المضادة. من ديفيز وآخرون 9. انظر أيضا الشكل 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

نقدم بروتوكول لكيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms الميتوكوندريا كله. توفر تقنية رؤى تفصيلية في هيكل، وظيفة، وتنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الأغشية البيولوجية الأصلية.

التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Views.  Max Planck Institute of Biophysics.  نقدم بروتوكول لكيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms الميتوكوندريا كله. توفر تقنية رؤى تفصيلية في هيكل، وظيفة، وتنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الأغشية البيولوجية الأصلية. 

Video: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...