Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Max Planck (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, e WK), o Cluster de Frankfurt &quot;complexos macromoleculares&quot; Excelência financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) e um pós-doutorado EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).

1: Preparação de mitocôndrias de células ou tecidos por centrifugação diferencial Esta secção descreve um processo geral para o isolamento de mitocôndrias intactas a partir de vários organismos eucariotas. A precisão componentes do tampão e velocidades de centrifugação devem ser otimizados para cada tecido / espécies estudadas. <ol><li> Romper as células em tampão isotónico (por exemplo, sacarose 250 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4), usando um moinho de vidro e de talão (micélio do fungo) 28, a digestão enzimática da parede celular (Saccharomyces cerevisiae), 29, de um homogeneizador de rolamento de esferas (única -cell eucariotos / cultura células / nematóides) 30, ou um liquidificador (tecidos animais ou vegetais) 31. </li><li> Remover os detritos celulares por filtração através de musselina seguido de centrifugação a baixa velocidade (2000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Recolhe sobrenadante e de sedimento mitocôndria por centrifugação a alta velocidade (9000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Quando necessário, utilizar um passo de gradiente de densidade isotónico para purificação adicional da fracção mitocondrial 32. </li></ol> 2 Preparação de mitocôndrias para Electron Cryo-tomografia A seção a seguir descreve como obter amostras congeladas hidratado para crio-ET. NOTA: O método envolve a utilização de azoto líquido extremamente frio e etano, que pode provocar queimaduras graves na pele. Óculos de segurança e luvas de proteção crio devem ser usados. Etano líquido, que também é inflamável, devem ser tratados de uma coifa. <ol><li> Ressuspender mitocôndrias peletizadas em 250 mM de trealose, tampão HEPES 10 mM a pH 7,4 a uma concentração de aproximadamente 5 mg / ml de proteína total. </li><li> Grids EM holey carbono Glow-descarga, laterais de carbono para cima, em um dispositivo de vácuo de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Liquefazer alguns mililitros de etano dirigindo uma corrente de gás de etano para o lado interior de um cool de azoto líquidorecipiente de alumínio ed. </li><li> Misture suspensão fiducial ouro proteína A conjugada 1: 1 com suspensão mitocondrial e aplicar imediatamente 3 mL de uma grade EM brilho de descarga realizada em pinça. </li><li> Coloque as pinças em um dispositivo de vitrificação, por exemplo, uma guilhotina caseira. Seque o excesso de líquido com uma fatia de papel de filtro (~ 5 segundos ou até que o líquido parar de espalhar) e mergulhar imediatamente a grade em etano líquido soltando o gatilho. </li><li> Transferir a rede a partir de etano líquido em azoto líquido. Durante a transferência, remover o excesso de etano a partir da grelha com papel de filtro. Colocar a ponta de um pedaço em forma de cunha de papel de filtro no etano líquido. Como o etano líquido sobe, arraste suavemente a grade se o papel de filtro, mas mantê-lo abaixo da frente líquido. Etano líquido é removido da rede por acção capilar e uma vez todo o etano líquido foi removido, transferir imediatamente a grade em azoto líquido. </li><li> Coloque a grade vitrificados em uma caixa de armazenamento de rede, umnd armazenar sob azoto líquido para posterior utilização como apropriado. </li></ol> 3 Gravação de Tomographic Tilt Series A seção a seguir descreve como configurar e coletar uma série de inclinação tomográfica de uma mitocôndria com um microscópio eletrônico de Polara equipado com um filtro de energia pós-coluna e câmera CCD. Protocolos similares são usados ​​com todos os crio microscópios eletrônicos equipados com câmeras CCD ou detectores de elétrons diretos. <ol><li> Alinhe o Microscópio <ol><li> Insira teste espécime por exemplo, grafite e as ilhas de ouro em filme de carbono holey. </li><li> Selecione o modo de pesquisa no sistema de baixa dose do microscópio. </li><li> Trazer amostra para a altura eucentric. Este é o ponto de movimento xy mínima ao inclinar o suporte de amostras. Centralize um ponto de interesse a 0 ° de inclinação, incline a fase de 20 ° e recentrar a ponto de alterar o z-altura. Retornar para 0 ° e repita até desvio lateral é minimizado. </li><li> Selecionemodo de exposição. Escolha ampliação desejada para a coleta de uma tomografia (por exemplo, 25,000X no detector ≈ 0,6 nm espécime tamanho do pixel). </li><li> Escolha a abertura do condensador pequeno (50-70 mm) e selecione um tamanho de ponto e intensidade do feixe de modo que o feixe é apenas mais largo que o dispositivo de imagem e dá uma leitura de pixel de 60 e - / pixel (CCD) ou 14 e - / pixel / seg (detector eletrônica direta, modo de contagem). </li><li> Centro de abertura do condensador. </li><li> Encontre Gaussian por exemplo foco, ponto de contraste mínimo. Redefinir leitura microscópio desfocar e pontos de articulação correta e centro de rotação de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Disque desfocar desejado para a gravação de tomografia. NOTA: alta desfocagem (8 mm) aumenta o contraste, mas reduz a resolução, enquanto que a partir de desfocagem (2-4 mm) aumenta a resolução à custa de contraste. </li><li> Ao longo de um buraco vazio, gerar uma nova referência de ganho e alinhar filtro de energia de acordo com o fabricante doinstruções. </li><li> Alinhe modos de pesquisa e de exposição. No modo de exposição, centralizar um ponto de interesse e alternar para o modo de pesquisa. Seleccionar ampliação de 1,500X (0,033 uM / pixel da amostra no detector) e de desfocagem de 100 mM (para o aumento de contraste). Traga ponto de interesse para o centro utilizando bobinas de deslocamento de imagem. </li><li> No modo de pesquisa, ajustar o tamanho do local e intensidade do feixe de modo que o feixe é apenas mais largo que o dispositivo de imagem e dá uma leitura de pixel de ~ 20 e - / pixel (CCD) ou ~ 8 e - / pixel / seg (detector eletrônica direta, modo de contagem). </li></ol></li><li> Encontrar uma boa área de Specimen <ol><li> Insira o grid com mitocôndrias congelados hidratado para o microscópio eletrônico à temperatura do azoto líquido (consulte as instruções do fabricante EM). </li><li> No modo de busca, procure a rede para áreas de espessura do gelo e amostras de qualidade adequado. Dê uma busca de imagens 6 seg de áreas promissoras para determinar a adequação para a coleta de tomografia. Both da membrana mitocondrial interna e externa deve ser visível neste ampliação. </li></ol></li><li> Gravação de um Tilt Series tomográfica <ol><li> Uma vez que uma boa área espécime é encontrado, incline a fase de ± 60 ° para determinar o alcance máximo de inclinação que está disponível sem qualquer obstrução da exposição ou foco área por barras de grade ou pedaços de gelo. </li><li> Em um buraco cheio de gelo perto de aparência semelhante, mudar para o modo de exposição e ajustar o tempo de intensidade do feixe ou de aquisição de imagem de modo que cada imagem gravada tem uma dose de elétrons de 30-50 e - / pixel para CCDs ou 6-8 e - / pixel / s detectores de elétrons diretos, modo de contagem. </li><li> Calcule a razão de distribuição dose (I 0 / I 60), dividindo a média de contagem eletrônica de uma imagem de 1 seg adquiriu a 0 ° com o de uma imagem de 60 ° para. Esta relação descreve o aumento do tempo de exposição necessário para manter uma contagem constante de elétrons por imagem com o aumento do ângulo de inclinação (tempo de exposição = 1 / cos (α) n, onde (I 0 / I 60) = 2 n). A relação também serve como uma boa indicação da espessura do gelo. Boas tomograms de mitocôndrias são geralmente gravados com um I 0 / I 60 = 2,3-2,6. </li><li> Ao longo de um buraco vazio, adquirir uma imagem de 1 segundo no modo de exposição e observe a contagem de elétrons por um 2. Levando-se em conta a relação de distribuição de dose, calcular o número total de imagens que podem ser gravadas para uma dose total de elétrons específico (por exemplo, &lt;40 e - / a 2 para a determinação da estrutura e ~ 160 e - / a 2 para a morfologia). </li><li> Determinar o intervalo de inclinação apropriado para a recolha de tomograma dividindo a gama total de inclinação (por exemplo, 120 ° para ± 60 °), com o número total de imagens calculadas em 3.3.4. </li></ol></li><li> Configurar e gravar uma tomografia com os parâmetros determinados acima, usando software de coleta de dados automática apropriado 33, 34. Série Tilt são geralmente iniciado em ± 20 ° e passar por 0 ° antes de atingir altas inclinações, a fim de maximizar o conteúdo de informação de imagens de baixa inclinação, que é destruído pelo aumento da dose de elétrons. </li></ol> 4 Criação e Segmentação de Volumes tomográficos Esta seção descreve como volumes tomográficos da mitocôndria são gerados a partir de séries de inclinação e como os volumes estão presentes para a visão geral. <ol><li> Salve a série tomográfica de inclinação para um diretório apropriado. Gerar uma pilha de imagens e converter para um formato de arquivo adequado, com software de código aberto, como dm2mrc ou tif2mrc (pacote Imod), que convertem .dm3, .dm4 ou .tif para pilhas MRC. pilhas MRC são necessários para a reconstrução tomográfica com Imod 35. Outros pacotes requerem diferentes formatos. </li><li> Alinhe as imagens e gerar uma tomografia, seguindo os passos descritos no tutorial Imod ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Melhorar o contraste da tomografia usando o filtro anisotrópico de difusão não-linear distribuído com Imod. Este filtro funciona bem para as membranas e as partículas associadas com a membrana, tais como ATP-sintase. </li><li> Para a visualização, o segmento manualmente tomograma usando programas disponíveis comercialmente, por exemplo, Amira. Atribuir voxels correspondentes à membrana interna ou externa e gerar uma superfície. Usando a opção de clicker no plugin EM-pacote para AMIRA 36 marcar a localização de partículas ATP sintase. </li></ol> 5. Subtomogram cálculo da média da ATP sintase dímeros e Montagem de Estruturas X-Ray A seção a seguir descreve como médias subtomogram da ATP sintase dímeros podem ser obtidas. <ol><li> Usando as partículas marcadas como entrada e um pacote de software apropriado, como &#39;ParteEstimativa igo para o programa Electron Tomography &quot;, calcular uma média subtomogram. </li><li> Para uma estimativa de resolução, comparar duas determinados independentemente médias subtomogram por Fourier shell correlação 37. </li><li> Se disponíveis, doca conhecido estruturas de raios-X para a média subtomogram por corpo rígido encaixe, de forma manual ou usando rotinas de atracação sequenciais automáticas como as do programa Chimera 38. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui apresentado fornece uma introdução para crio-ET e subtomogram média das mitocôndrias, mas, essencialmente, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer outro compartimento da célula ou membrana. Para obter os melhores dados possíveis, os passos críticos durante o procedimento são a preparação da amostra, a estratégia de aquisição de processo de congelamento de mergulho e dados. Qualidade da amostra, o que é crítico para o sucesso, depende de um protocolo de congelação otimizado para garantir a espessura do gelo adequado, que é de suma importância para o bom contraste da imagem. A melhor estratégia de aquisição de dados depende do instrumento e amostra. Os parâmetros a serem otimizados incluem doses de elétrons por imagem, sistema de inclinação e desfocar. Adquirir um bom tomografia de uma boa amostra faz tudo ainda mais etapas de processamento mais fácil e garante um resultado final satisfatório. Cryo-ET combinada com média subtomogram e os ajustes do modelo atômico fornece detalhes de como complexos de proteínas são organizadas em their ambiente celular nativo. A técnica é igualmente adequado para investigar a estrutura de grandes complexos de proteínas de membrana, tais como a cadeia respiratória supercomplexos (1,7 MDA), dímeros ATP sintase (2x500 kDa), ou o complexo do poro nuclear (~ 120 MDa) 8, 9, 17. A organização de ATP dímeros sintase em linhas não pode ser observada por meio de técnicas de alta-resolução, tais como cristalografia de raios-X, RMN ou de uma única partícula de crio-EM, porque as linhas de dímeros são interrompidos por extracção com detergente, o que é um passo necessário para o isolamento e purificação de complexos de proteínas de membrana. O arranjo da ATP sintase, em fileiras de dímeros de cristas ao longo de arestas é um princípio organizador universal de mitocôndrias em todas as espécies. Os complexos de bombeamento de prótons da cadeia de transporte de elétrons, em particular complexo I (NADH desidrogenase), estão localizados nas áreas de membrana cada lado das linhas 8,9. Esta organização da cadeia respiratória tem profundo impacto na bioenergética mitocondrial. Se as linhas de dímeros não podem formar, devido à ausência de subunidades de proteínas específicas do dímero, as células exibem tempos de vida mais prolongados e reduzida aptidão celular, como observada no mutante de levedura mostradas na Figura 3, 41. Com o crescente interesse em doenças mitocondriais, um detalhada compreensão da base molecular que regula ultra-estrutura e função mitocondrial é de suma importância. Crio-tomografia Electron fornece uma ligação entre a estrutura da proteína foi determinada por meio de métodos de alta resolução, e a distribuição e a disposição dessas proteínas na membrana na escala dos nanómetros. Isso faz com que crio-ET uma ferramenta essencial para a compreensão da estrutura e função mitocondrial na saúde e na doença. Novos desenvolvimentos e melhorias técnicas em crio-ET incluir estratégias de rotulagem proteína para identificar a posição de protein subunidades em complexos macromoleculares ou a localização das proteínas distintas menores ou menos (&lt;0,5 MDa) em células. Além disso, métodos de processamento EM híbrido, que combinam subtomogram média com a análise de uma única partícula ou reconstrução helicoidal recentemente determinado estruturas de proteínas para ~ 8 a 42, 43. Estes métodos de processamento são atualmente restrita a proteínas purificadas, que são bem separados no gelo ou formam conjuntos helicoidais e não são actualmente aplicáveis ​​a ambientes celulares lotados como mitocôndrias e cristas membranas. Para a coleta de dados, as novas ferramentas de computação e hardware estão sendo desenvolvidas para permitir a aquisição tomografia automatizado, aumentar o contraste da imagem e reduzir a dose total de elétrons necessária. A única limitação fundamental na crio-ET é danos da radiação com a amostra pelo feixe de elétrons. Isso significa que apenas doses muito baixas de elétrons pode ser usado para gravar cada imagem de uma série tomográfica inclinação, resultando em mau sinal-trazão que, em última análise limita a resolução alcançável o-ruído. Os novos detectores de elétrons direta, lançado menos de um ano atrás, estão a revolucionar a área de de uma única partícula de crio-EM 44, 45. Estes novos detectores de proporcionar maior contraste e melhor resolução em doses mais baixas de elétrons. Para elétron crio-tomografia, isso significa que a série de inclinação com tamanhos de etapa menores ou tomografias eixo mesmo duplas podem ser coletadas sem preocupações com danos excessivos de radiação (uma imagem CCD é equivalente em dose de elétrons para 5 imagens detector eletrônica direta). As grandes quantidades de dados produzidos por esses detectores de criar seus próprios desafios em manipulação de dados, processamento e armazenamento, que terão de ser superados. Além disso, as placas de fase, que trabalham em princípios semelhantes aos usados ​​rotineiramente em microscopia de luz para melhorar o contraste de fase, estão sendo desenvolvidos atualmente para microscopia eletrônica de transmissão 46, 47. Isto deve permitir radiografias para ser recolhido mais perto de se concentrar e, portanto, a maior resolução, enquanto que, ao mesmo tempo preservando as características de baixa resolução necessária para o alinhamento e interpretação dos volumes tomográficos. Tomados em conjunto, esses avanços tecnológicos irá expandir a gama de questões biológicas que podem ser abordados por crio-ET.

As mitocôndrias são o poder de casas da célula. Através da conversão de um gradiente de protões electroquímico através da membrana mitocondrial interna na energia de ligação química, o ATP sintase mitocondrial produz a maior parte do ATP que impulsiona os processos celulares. A fim de compreender os mecanismos por trás de conversão de energia mitocondrial, precisamos determinar a estrutura da ATP sintase in situ, e para saber como ele é organizado e distribuído na membrana mitocondrial interna. Embora as estruturas de alta resolução da maior parte dos componentes da sintase ATP mitocondrial de 1-3 e mapas de baixa resolução de todo o complexo de 4 estão disponíveis, é importante estabelecer a estrutura e a conformação da enzima activa na membrana. A distribuição da ATP sintase, na membrana mitocondrial interna tem sido amplamente consideradas como aleatória, mas um início encontrando 5 e os nossos próprios resultados iniciais indicaram que 6 isto não é tele caso. Estudos subsequentes do nosso grupo e outros 7 confirmaram que o ATP sintase é disposta em linhas longas de dímeros ao longo das nervuras curvas de força nas cristas da membrana mitocondrial interna 8, enquanto que as bombas de protões na cadeia de transporte de electrões parece estar localizado em ambos os lados das linhas 9. Este arranjo tem implicações importantes para os mecanismos de conversão de energia mitocondrial. A técnica que usamos para determinar esse arranjo é elétron crio-tomografia (crio-ET). Cryo-ET é atualmente o único método que oferece tridimensional (3D) volumes precisos de células, compartimentos celulares ou organelas na resolução molecular. Cryo-ET é particularmente adequado para o estudo de grandes complexos de membranas biológicas, pois as membranas aparecem com bom contraste e são fáceis de localizar em volumes tomográficos 3D. Outros métodos para estudar a estrutura 3D de células ou organelles não fornecer detalhes molecular. Super-resolução microscopia de luz 10, 11 é excelente em revelar a posição ou a distância entre marcadores emissores de luz ligados a proteínas de interesse com uma precisão de dezenas de nm, mas não revela a estrutura da própria proteína, mesmo em baixa resolução . Microscopia eletrônica de transmissão de cortes seriados de 12 ou de imagem de bloco-face por microscopia eletrônica de varredura 13 de amostras biológicas de plástico incorporado proporcionam vistas de baixa resolução de volumes celulares, mas também não revelam detalhes molecular. Microscopia de força atômica 14 pode, em princípio, oferecer resolução molecular ou mesmo atômico, mas apenas na superfície dos objetos sobre um suporte atomicamente plana e sólida. Finalmente, a tomografia de raios X ou dispersão de 15 impulsos de raios-X a partir de lasers intensos de electrões livres é improvável para revelar a estrutura de grandes complexos, objectos aperiódicos tais como células completas ou organelos no m 16resolução olecular no futuro previsível. Assim, no momento, não há alternativa a Cryo-ET para estudos da estrutura 3D de células ou organelas com resolução nanométrica. Cryo-ET é o método de escolha para a análise da estrutura e a conformação dos conjuntos de proteínas associadas à membrana, incluindo o complexo do poro nuclear 17, a espiga 18 da gripe complexos, e os flagelos proteínas de motor 22, 23 mas também a organização das células bacterianas inteiras 19 e a entrada de vírus patogénicos tais como o VIH em células de 20-23. Cryo-ET é inestimável para a visualização de proteínas filamentosas e suas interações na célula, incluindo os filamentos de actina 24 ou axonemas 25. A resolução pode ser aumentada para 2 nm ou melhor, pela subtomogram média de 26, segundo o qual subvolumes de repetidas, feições regulares são cortadas de um volume tomográfica e média por partícula única imagem protécnicas cessamento. Cryo-ET envolve a aquisição de uma série de imagens de projeção de uma amostra fina (&lt;250 nm) tomadas em diferentes ângulos de inclinação em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). A amostra deve ser fina para que os elétrons, que interagem fortemente com a matéria, estão espalhados por mais de uma vez. Espalhamento múltiplo faz com que as imagens resultantes de difícil interpretação e reduz o contraste. Imagens da área da amostra seleccionada estão alinhadas umas em relação às outras e projectado para um espaço 3D por um programa de computador apropriado, gerando um volume 3D do espécime. O alinhamento das imagens é auxiliada por marcadores fiduciais de ouro, os quais são misturados com a amostra antes da congelação. Idealmente marcadores fiduciais 10 ou mais uniformemente distribuídas deve estar presente em cada imagem para obter um bom alinhamento. Para observar detalhes molecular, as amostras são mergulhar congelado em etano líquido, que preserva seu estado hidratado nativa. Congelamento em líquidoetano é tão rápido (~ 10 5 ° C / s) 27 que a água não se cristalizam, mas permanece em um estado como vidro vitrificado. Cristal de gelo danos formação de estruturas biológicas sensíveis. Como amostras biológicas sofrem de danos por radiação, há um limite para o número total de eventos de dispersão da amostra pode tolerar. As imagens são, assim, adquirido no modo de baixa dose: Uma área de interesse é identificado com pequeno aumento (1,500X) com uma dose de elétrons abaixo de 1 e - / nm 2 (modo de busca). A imagem é focalizada em uma ampliação maior, fora da área de interesse (modo de focagem). Só quando uma imagem é adquirida, a área de interesse, é irradiada com uma dose mais elevada de electrões (modo de exposição). Aqui, apresentamos uma visão geral de como coletar e elétrons processo crio tomografias, usando ATP sintase dímeros na membrana mitocondrial interna como um exemplo. O protocolo a seguir descreve como preparar mitocôndria para crio-ET, como configurare recolha de uma série de inclinação com uma dose total de electrões específico, e como processar a série de inclinação para obter um volume 3D da área de interesse. Uma visão geral do procedimento é ilustrado na figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

Crio-tomografia de electrões é uma ferramenta poderosa na biologia estrutural, capaz de visualizar a estrutura tridimensional de amostras biológicas, tais como células, organitos, vesículas de membrana, ou vírus em detalhe molecular. Para conseguir isso, a amostra aquosa é rapidamente vitrificados em etano líquido, que preserva-lo em um estado congelado hidratado close-to-natal. Ao microscópio eletrônico, série de inclinação são registrados à temperatura do azoto líquido, a partir do qual tomografias 3D são reconstruídos. A razão sinal-para-ruído do volume tomográfico é inerentemente baixa. Reconhecível, características recorrentes são reforçadas por média subtomogram, pelo qual subvolumes individuais são cortados, alinhados e média para reduzir o ruído. Desta forma, 3D mapeia com uma resolução de 2 nm ou melhor pode ser obtida. Um ajuste de estruturas de alta resolução disponíveis para o volume 3D, em seguida, produz modelos atômicos de complexos de proteínas em seu ambiente nativo. Aqui nós mostramos como usamos elétron crio-tomography para estudar a organização in situ de grandes complexos de proteínas de membrana de mitocôndrias. Nós descobrimos que as sintases de ATP são organizadas em filas ao longo de dímeros ápices altamente curvas da cristas membrana interna, ao passo que o complexo I está distribuído de forma aleatória nas regiões da membrana de cada lado das filas. Por subtomogram média obtivemos uma estrutura da ATP sintase mitocondrial dímero dentro da membrana de cristas.

Electron crio tomogramas de mitocôndrias revelam claramente a morfologia 3D da organela (Figura 2). Segmentação manual das membranas num volume tomográfico ilustra a estrutura das cristas em uma mitocôndria. Por imagiologia mitocôndrias de diferentes estirpes de levedura que não possuem a eliminar certos componentes da proteína, o efeito destas proteínas na morfologia cristas podem por avaliada. Figura 3 mostra uma mitocôndria de uma estirpe de levedura sem ATP sintase e da subunidade. Este componente do complexo da sintase ATP é necessária para a dimerização da ATP sintase mitocondrial. As mitocôndrias desta estirpe não têm a cristas lamelar normal das mitocôndria tipo selvagem (Figura 2) e, em vez de conter um número de compartimentos da membrana interior. Estes compartimentos são ou desprovido de cristas ou conter pequenas invaginações da membrana em forma de balão (Figura 3). Em tomograms com bom contraste, grandes complexos de proteínas mitocondriais, neste caso ATP sintase dímeros, são facilmente visíveis (Figura 4; Filme 1). As estruturas dos complexos pode ser determinada a 2-3 nm de resolução média subtomogram (Figura 5; Filme 2). Os volumes médios podem ser colocados de volta na tomografia, a fim de avaliar a organização dos complexos individuais em relação uns aos outros e a outros complexos de proteínas na membrana (Figura 6; filme 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Fluxograma mostrando as etapas do elétron crio-tomografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> Figura 2 Morfologia de uma mitocôndria de wildtype S. Cerevisiae. Fatia Central através de um volume tomográfico de um tipo selvagem S. mitocôndria cerevisiae (esquerda) e do volume rendeu-superfície correspondente (direita). O volume segmentada da membrana externa é mostrado em cinza e os volumes do limite interior e cristas membranas em azul claro. Adaptado de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. mitocôndrias a partir de um S. Cerevisiae estirpe falta uma subunidade necessária paraATP sintase dimerização. Cortam o volume tomográfica (esquerda) e acompanha o volume processado-superfície (à direita) de uma mitocôndria de uma S. Cerevisiae sem a subunidade de proteína e necessária para a ATP sintase dimerização. Quando comparada com a Figura 2, a mitocôndria da estirpe mutante não tem o cristas lamelar normal da mitocôndria tipo selvagem. Em vez disso, a mitocôndria tem muitos compartimentos da membrana interna com ou sem cristas ou cristas em forma de balão. Assim elétron crio-tomografia destaca alterações na morfologia da membrana devido a deleções de genes. Adaptado de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 Mitocôndria a partir do fungo P. anserina. cortam o volume tomográfica (à esquerda) e do volume-rendido superfície de acompanhamento (à direita) de uma mitocôndria do fungo filamentoso P. anserina. Neste tomografia, filas de 10 partículas nm (setas amarelas) estão localizados acima cumes de membrana altamente curvas no cristas da membrana interna (ver Filme 1). Estas partículas foram identificadas como dímeros ATP sintase por subtomogram média. De Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Estrutura e organização da ATP sintase mitocondrial. Vista lateral e superior mostrando a densidade eletrônica de um dímero ATP sintase de S. c<html> erevisiae conforme determinado pela média subtomogram com modelos atômicos embutidos (esquerda). Mitocondrial vesícula de membrana interior que mostra a organização da ATP sintase dímeros em filas (direita). A figura foi gerada pelo posicionamento da média subtomogram do dímero sintase ATP em volume segmentada da vesícula de membrana, usando as coordenadas calculadas durante média. Adaptado de Davies et al 8. Modelos atômicos: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (azul e roxo); oligomicina sensível conferindo proteína OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); fragmento de talo periférico [PDB: 2CLY] 1 com resíduos N-terminais de [PDB: 2WSS] 2 (amarelo e vermelho) (ver filme 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6 crista isolada a partir de uma vesícula de P. anserina mitocôndria. fatias de um volume tomográfica (à esquerda) e do volume-rendido superfície de acompanhamento (à direita) de uma vesícula crista de P. anserina. Densidades de proteínas que saem da membrana são claramente visíveis. As densidades indicadas por setas amarelas são dímeros ATP sintase, conforme identificado por subtomogram média. Setas verdes apontam para densidades identificadas pela marcação de anticorpos como NADH desidrogenase (complexo 1, para mais detalhes ver 9). A segmentação das densidades de proteína revela a sua organização na cristas, com os dímeros da ATP sintase (vermelho e amarelo) que formam as linhas ao longo das arestas de cristas altamente curvas e os complexos de NADH desidrogenase (verde) em regiões da membrana de cada lado das linhas (ver Filme 3). De Davies et al 9.28 / &quot;target =&quot; 51228fig7highres.jpg _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver a imagem ampliada. Filme 1. Electron crio-tomografia de um P. anserina mitocôndria. O filme mostra fatias sucessivas através de um volume tomográfica tomado de uma mitocôndria do fungo filamentoso P. anserina. Fileiras de ATP sintase são indicados por setas amarelas. A, o volume segmentada-rendido superfície mostra a localização da ATP sintase (esferas vermelho) em relação à estrutura 3D de cristas. Membrana externa, cinza; membrana de limite interior, azul transparente; cristas membranas, azul opaco. De Davies et al 9. Ver também Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Filme 2. média Subtomogram do dímero ATP sintase mitocondrial de S. Cerevisiae com modelos atômicos embutidos. A média foi decalculada a partir de 121 subvolumes. A densidade é apresentada em três níveis de contorno: 1s - malha, 2s - cinza claro e cinza escuro - 3s. Modelos atômicos foram ajustados para a densidade usando a rotina ajuste seqüencial em Chimera. Modelos atômicos: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (azul e roxo); oligomicina sensível conferindo proteína OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); fragmento de talo periférico [PDB: 2CLY] 1 com resíduos N-terminais de [PDB: 2WSS]. 2 (amarelo e vermelho) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Adaptado de Davies et al 8. Ver também figura 5. Filme 3 isolado a partir de uma vesícula de cristas P. anserina mitocôndria. fatias sucessivas através do volume tomográfico são mostrados, seguido pelo volume rendeu-superfície segmentada. Densidades de proteína salientes do membrane são claramente visíveis. Densidades vermelhas e amarelas são dímeros ATP sintase. Densidades verdes são NADH desidrogenase (complexo I), conforme determinado por marcação com anticorpos. De Davies et al 9. Ver também Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo.</a>

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Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

29.6K visualizações.  Max Planck Institute of Biophysics.  Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas. 

Vídeo: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biologia

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

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