Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society (KMD, BD, AWM, la tubercolosi, TBB, DJM, e WK), il Cluster di Eccellenza Francoforte &quot;complessi macromolecolari&quot;, finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) e un post-dottorato EMBO a lungo termine Fellowship (VAMG).

1 Preparazione di mitocondri da cellule o tessuti mediante centrifugazione differenziale Questa sezione descrive una procedura generale per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti da vari organismi eucarioti. I componenti del tampone e velocità di centrifugazione precise devono essere ottimizzate per ogni tessuto / specie studiate. <ol><li> Rompere le cellule in tampone isotonico (ad esempio, saccarosio 250 mm, 10 HEPES mM pH 7.4), utilizzando un mulino vetro tallone (micelio fungino) 28, digestione enzimatica della parete cellulare (Saccharomyces cerevisiae) 29, un omogeneizzatore-cuscinetto a sfere (singolo -cell eucarioti / cultura cellule / nematodi) 30, o un frullatore (tessuti animali o vegetali) 31. </li><li> Rimuovere detriti cellulari mediante filtrazione attraverso mussola seguita da centrifugazione a bassa velocità (2000 xg, a 4 ° C, 10 min). </li><li> Raccogliere il surnatante e pellet mitocondri mediante centrifugazione ad alta velocità (9.000 xg, a 4 ° C, 10 min). </li><li> Se necessario, utilizzare un gradiente di densità passo isotonica per la purificazione ulteriore della frazione mitocondriale 32. </li></ol> 2 Preparazione di mitocondri per Electron Cryo-tomografia La sezione seguente descrive come ottenere i campioni congelati-idratata per crio-ET. NOTA: Il metodo prevede l&#39;uso di azoto liquido estremamente freddo ed etano, che può causare gravi ustioni. Occhiali di sicurezza e guanti di crio-protezione devono essere indossati. Etano liquido, che è anche infiammabile, deve essere gestito in una cappa aspirante. <ol><li> Risospendere mitocondri pellet in trealosio 250 mM, 10 mM tampone HEPES a pH 7,4 ad una concentrazione di circa 5 mg / ml di proteine ​​totali. </li><li> Glow-scarico griglie EM carbonio bucata, laterali carbonio alto, in un dispositivo a depressione secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Liquefare pochi millilitri di etano dirigendo un flusso di gas etano sul lato interno di un fresco azoto liquidocontenitore di alluminio ed. </li><li> Mescolare oro proteina A-coniugato sospensione fiduciale 1: 1 con sospensione mitocondriale e applicare immediatamente 3 microlitri di una griglia EM bagliore-scarico in pinzetta. </li><li> Mettere le pinzette in un dispositivo di vetrificazione, ad esempio, una ghigliottina fatta in casa. Asciugare il liquido in eccesso con un cuneo di carta da filtro (~ 5 secondi o fino a quando si ferma liquidi diffusione) e immergersi immediatamente la griglia in etano liquido rilasciando il grilletto. </li><li> Trasferire la griglia da etano liquido in azoto liquido. Durante il trasferimento, rimuovere l&#39;eccesso di etano dalla griglia con carta da filtro. Posizionare la punta di un pezzo a forma di cuneo di carta filtro in etano liquido. Come la etano liquido sale, trascinare delicatamente la griglia la carta da filtro ma tenerlo sotto la parte frontale del liquido. Etano liquido viene rimosso dalla rete per azione capillare e una volta che tutto etano liquido è stato rimosso, trasferire immediatamente la griglia in azoto liquido. </li><li> Posizionare la griglia vetrificata in una scatola di immagazzinaggio griglia, unand conservare in azoto liquido per un uso successivo come appropriato. </li></ol> 3 Registrazione di tomografica Tilt Series La sezione seguente descrive come impostare e raccogliere una serie di inclinazione tomografica di un mitocondrio con un microscopio elettronico Polara dotato di un filtro di energia post-colonna e camera CCD. Protocolli simili sono utilizzati con tutti i microscopi elettronici crio-dotati di CCD o telecamere dirette rivelatore di elettroni. <ol><li> Allineare il microscopio <ol><li> Inserire provino ad esempio, grafite e le isole d&#39;oro su pellicola di carbonio bucata. </li><li> Selezionare la modalità di ricerca nel sistema di basse dosi del microscopio. </li><li> Portare campione altezza eucentrica. Questo è il punto di minimo movimento xy quando si inclina il supporto del campione. Centrare un punto di interesse a 0 ° di inclinazione, inclinare la fase a 20 ° e ricentrare il punto alterando lo z-altezza. Torna a 0 ° e ripetere fino a spostamento laterale è ridotto al minimo. </li><li> Selezionaremodalità di esposizione. Scegli ingrandimento desiderato per la raccolta di un tomogramma (ad esempio, 25,000X sul rivelatore ≈ 0,6 nm CAMPIONE dimensione dei pixel). </li><li> Scegli una piccola apertura del condensatore (50-70 mm) e selezionare la dimensione dello spot e l&#39;intensità del fascio in modo che il fascio è solo più largo del dispositivo di imaging e dà una lettura di 60 pixel e - / pixel (CCD) o 14 e - / pixel / sec (rivelatore di elettroni diretto, modalità conteggio). </li><li> Apertura del condensatore Center. </li><li> Trova gaussiana fuoco ad esempio, il punto di contrasto minimo. Ripristino lettura microscopio defocus e corretti punti di articolazione e il centro di rotazione secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Quadrante in defocus desiderata per la registrazione tomogram. NOTA: Alta defocus (8 micron) aumenta il contrasto, ma riduce la risoluzione, considerando che la bassa defocus (2-4 micron) aumenta la risoluzione a scapito del contrasto. </li><li> Su un buco vuoto, generare un nuovo guadagno di riferimento e allineare filtro di energia secondo il fornitore diistruzioni. </li><li> Allineare ricerca e di esposizione modi. Nel modo di esposizione, centrare un punto di interesse e passare alla modalità di ricerca. Selezionare ingrandimento di 1,500X (0,033 micron / pixel di campione sul rivelatore) e la sfocatura di 100 micron (per aumentare il contrasto). Punto di interesse schiena Portare a centrare utilizzando bobine di spostamento immagine. </li><li> Nel modo di ricerca, regolare la dimensione dello spot e l&#39;intensità del fascio in modo che il fascio è solo più largo del dispositivo di imaging e dà una lettura pixel di ~ 20 e - / pixel (CCD) o ~ 8 e - / pixel / sec (rivelatore di elettroni diretto, modalità conteggio). </li></ol></li><li> Trovare un buon Area campione <ol><li> Inserire la griglia con mitocondri congelati-idratata nel microscopio elettronico a temperatura dell&#39;azoto liquido (fare riferimento alle istruzioni del produttore EM). </li><li> Nel modo di ricerca, cercare la griglia per le zone di spessore del ghiaccio e del campione di qualità appropriato. Prendete un 6 sec ricerca di immagini di settori promettenti per determinare l&#39;idoneità per la raccolta tomogram. Both la membrana mitocondriale interna ed esterna deve essere visibile in questo ingrandimento. </li></ol></li><li> Registrazione di un tomografica Tilt Series <ol><li> Una volta che una buona zona esemplare si trova, inclinare la fase ± 60 ° per determinare la portata massima inclinazione che è disponibile senza alcun ostacolo di esposizione o di messa a fuoco da bar griglia o grumi di ghiaccio. </li><li> Su un buco pieno di ghiaccio nelle vicinanze di aspetto simile, passare alla modalità di esposizione e regolare il tempo di intensità del fascio o l&#39;acquisizione delle immagini in modo che ogni immagine registrata ha una dose di 30-50 elettrone e - / pixel per CCD o 6-8 e - / pixel / s rivelatori di elettroni diretti, modalità di conteggio. </li><li> Calcolare il rapporto di distribuzione della dose (I 0 / I 60) dividendo il numero medio di elettroni per un&#39;immagine 1 sec acquisita a 0 ° con quella di un&#39;immagine di 60 °. Questo rapporto descrive l&#39;aumento del tempo di esposizione necessario per mantenere costante il numero di elettroni per ogni immagine con l&#39;aumentare dell&#39;angolo di inclinazione (tempo di esposizione = 1 / cos (α) n dove (I 0 / I 60) = 2 n). Il rapporto serve anche come una buona indicazione dello spessore del ghiaccio. Buone tomogrammi di mitocondri sono generalmente registrati con un I 0 / I 60 = 2,3-2,6. </li><li> Su un buco vuoto, acquisire un&#39;immagine 1 sec in modalità di esposizione e notare il conteggio elettronico per Å 2. Tenendo conto del rapporto di distribuzione della dose, calcolare il numero totale di immagini che possono essere registrate per una dose totale di elettroni specifico (ad esempio, &lt;40 e - / a 2 per la determinazione della struttura &amp; ~ 160 e - / A 2 per morfologia). </li><li> Determinare l&#39;intervallo di inclinazione appropriata per la raccolta tomografia dividendo il range di inclinazione totale (ad esempio, 120 ° per ± 60 °) per il numero totale di immagini calcolati in 3.3.4. </li></ol></li><li> Impostare e registrare un tomogramma con i parametri determinati in precedenza utilizzando il software appropriato raccolta automatica dei dati 33, 34. Serie Tilt sono di solito avviati a ± 20 ° e passare attraverso 0 ° prima di raggiungere elevate inclinazioni al fine di massimizzare il contenuto informativo delle immagini a bassa inclinazione, che viene distrutto aumentando la dose di elettroni. </li></ol> 4 Creazione e segmentazione di volumi tomografiche Questa sezione descrive come volumi tomografiche di mitocondri sono generati da serie tilt e come sono presenti per la visualizzazione generale dei volumi. <ol><li> Salvare la serie tomografico inclinazione a una directory appropriata. Generare una serie di immagini e convertire in un formato di file appropriato con il software open-source, come ad esempio dm2mrc o tif2mrc (pacchetto IMOD), che convertono .dm3, .dm4 o tif file stack MRC. pile MRC sono necessari per la ricostruzione tomografica con IMOD 35. Altri pacchetti richiedono diversi formati. </li><li> Allineare le immagini e generare un tomogramma seguendo la procedura descritta nel tutorial IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Migliora il contrasto del tomogramma utilizzando il filtro anisotropico diffusione non lineare distribuito con MDI. Questo filtro funziona bene per le membrane e particelle associate alla membrana, come ATP sintasi. </li><li> Per la visualizzazione, segmento manualmente il tomogramma utilizzando programmi disponibili in commercio per esempio, Amira. Assegnare voxel corrispondenti alla membrana interna o esterna e generare una superficie. Utilizzando l&#39;opzione clicker nel plugin EM-pacchetto per AMIRA 36 contrassegnare la posizione delle particelle ATP sintetasi. </li></ol> 5. Subtomogram della media dell&#39;ATP sintasi dimeri e montaggio di strutture X-Ray La sezione seguente descrive come medie subtomogram di ATP sintasi dimeri possono essere ottenuti. <ol><li> Utilizzando le particelle contrassegnate come input e un pacchetto software appropriato, come il &#39;ParteStima icolo per il programma Electron Positron &#39;, calcolare una media subtomogram. </li><li> Per un preventivo risoluzione, confrontare due medie subtomogram determinati autonomamente da Fourier shell correlazione 37. </li><li> Se disponibili, dock noto strutture a raggi X nel medio subtomogram di corpo rigido raccordo, manualmente o utilizzando le routine di docking automatico sequenziale come quelli nel programma Chimera 38. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo qui presentato fornisce un&#39;introduzione alla crio-ET e subtomogram media dei mitocondri, ma essenzialmente la stessa procedura può essere applicata a qualsiasi altro compartimento cellulare o membrana. Per ottenere i migliori dati possibili, fasi critiche nel corso della procedura sono la preparazione del campione, la strategia di acquisizione processo di congelamento tuffo e dati. Qualità del campione, che è fondamentale per il successo, dipende da un protocollo di congelamento ottimizzato per garantire lo spessore del ghiaccio adatto, che è di fondamentale importanza per il buon contrasto dell&#39;immagine. La strategia ottimale di acquisizione dati dipende dallo strumento ed il campione. Parametri da ottimizzare includono dose di elettroni per immagine, sistema di inclinazione e sfocatura. Acquisire una buona tomogramma di un buon campione rende ogni ulteriore trasformazione passaggi più facili e garantisce un risultato finale soddisfacente. Cryo-ET combinato con subtomogram media e montaggio di modello atomico fornisce dettagli su come complessi proteici sono disposti in thambiente cellulare nativo EIR. La tecnica è ideale per indagare la struttura di grandi complessi proteici di membrana, come supercomplessi catena respiratoria (1.7 MDA), dimeri ATP sintasi (2x500 kDa), o il complesso del poro nucleare (~ 120 MDA) 8, 9, 17. L&#39;organizzazione di ATP dimeri sintasi in righe non può essere osservato con tecniche ad alta risoluzione come la cristallografia a raggi X, NMR o singola particella crio-EM, perché le righe dimero sono interrotti per estrazione detergente, che è un passo necessario per l&#39;isolamento e purificazione di complessi proteici di membrana. La disposizione della ATP sintasi in file di dimeri lungo crinali creste è un principio organizzativo universale dei mitocondri in tutte le specie. I complessi protone-pompaggio della catena di trasporto degli elettroni, in particolare complesso I (NADH deidrogenasi), sono situati nelle zone di membrana lati delle righe 8,9. Questa organizzazione della catena respiratoria ha un impatto profondo sulla bioenergetica mitocondriale. Se le righe dimero non possono formare a causa dell&#39;assenza di subunità proteiche specifica-dimero, le cellule presentano tempi di generazione più lunghi e ridotta idoneità cellulare, come osservato nel mutante di lievito mostrato in Figura 3 41. Con il crescente interesse per le malattie mitocondriali, una dettagliata comprensione delle basi molecolari che governano ultrastruttura e funzione mitocondriale è di fondamentale importanza. Electron crio-tomografia fornisce un collegamento tra struttura proteica determinata mediante metodi ad alta risoluzione, e la distribuzione e la disposizione di queste proteine ​​nella membrana sulla scala dei nanometri. Questo rende crio-ET uno strumento essenziale per comprendere la struttura e la funzione mitocondriale in salute e malattia. Ulteriori sviluppi tecnici e miglioramenti in crio-ET includono strategie di proteina-etichettatura per identificare la posizione di Protein subunità in complessi macromolecolari o la posizione delle proteine ​​distinte più piccole o meno (&lt;0,5 MDA) nelle cellule. Inoltre, i metodi di lavorazione EM ibridi, che combinano subtomogram media con l&#39;analisi singola particella o ricostruzione elicoidale hanno recentemente determinato strutture proteiche a ~ 8 A 42, 43. Questi metodi di lavorazione sono attualmente limitati alle proteine ​​purificate, che sono ben separati in ghiaccio o si formano gruppi elicoidali e non sono attualmente applicabili agli ambienti cellulari affollati come i mitocondri e le membrane creste. Per la raccolta dei dati, nuovi strumenti informatici e hardware sono in fase di sviluppo per l&#39;acquisizione tomogram automatizzato, aumentare il contrasto dell&#39;immagine e ridurre la dose totale richiesta di elettroni. L&#39;unica limitazione fondamentale in crio-ET è danni da radiazioni al campione dal fascio di elettroni. Ciò significa che solo dosi molto basse di elettroni possono essere usati per registrare ogni immagine di una serie tomografica inclinazione, con conseguente scarsa segnale-trapporto che in ultima analisi, limita la risoluzione ottenibile o-rumore. I nuovi rivelatori di elettroni diretto, uscito meno di un anno fa, stanno rivoluzionando il campo di singolo-particella crio-EM 44, 45. Questi nuovi rivelatori forniscono un maggiore contrasto e una migliore risoluzione a dosi più basse di elettroni. Per elettrone crio-tomografia, questo significa che serie tilt con dimensioni di passo più piccole o addirittura tomogrammi biassiali possono essere raccolti senza preoccupazioni per i danni da radiazioni eccessive (una sola immagine CCD è equivalente a dosaggio elettronico a 5 immagini dirette rivelatore di elettroni). Le grandi quantità di dati prodotti da questi rilevatori di creare le proprie sfide nella gestione dei dati, trasformazione e stoccaggio, che dovranno essere superate. Inoltre, le piastre di fase, che lavorano su principi simili a quelli utilizzati di routine in microscopia ottica per aumentare il contrasto di fase, sono attualmente in fase di sviluppo per la microscopia elettronica a trasmissione 46, 47. Ciò dovrebbe permettere tomogrammi da rilevare più vicino al fuoco e quindi a maggiore risoluzione, mentre allo stesso tempo conservando bassa risoluzione caratteristiche necessarie per l&#39;allineamento e l&#39;interpretazione dei volumi tomografiche. Presi insieme, questi progressi tecnologici espandere notevolmente la gamma di questioni biologiche che possono essere affrontati con crio-ET.

I mitocondri sono i power-case del cellulare. Con la conversione di un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna in energia legame chimico, la ATP sintetasi mitocondriale produce la maggior parte del ATP che guida i processi cellulari. Al fine di comprendere i meccanismi che stanno dietro la conversione di energia mitocondriale, abbiamo bisogno di determinare la struttura della ATP sintasi in situ, e per scoprire come è organizzato e distribuito nella membrana mitocondriale interna. Sebbene strutture ad alta risoluzione della maggior parte dei componenti mitocondriali ATP sintasi 1-3 e cartine bassa risoluzione dell&#39;intero complesso 4 sono disponibili, è importante stabilire la struttura e conformazione dell&#39;enzima di lavoro nella membrana. La distribuzione della ATP sintasi nella membrana mitocondriale interna è stato ampiamente ipotizzato essere casuale, ma uno dei primi 5 e trovare i nostri risultati iniziali 6 indicato che questo non è tche caso. Studi successivi del nostro gruppo e altri 7 hanno confermato che l&#39;ATP sintasi è organizzato in lunghe file di dimeri lungo i crinali strettamente curve della membrana mitocondriale interna creste 8, mentre le pompe protoniche della catena di trasporto degli elettroni sembrano essere situato su entrambi i lati delle file 9. Questa disposizione ha importanti implicazioni per i meccanismi di conversione energetica mitocondriale. La tecnica che abbiamo utilizzato per determinare tale disposizione è crio-elettroni tomografia (crio-ET). Cryo-ET è attualmente l&#39;unico metodo che fornisce accurate tridimensionale (3D) I volumi delle cellule, compartimenti cellulari o organuli a risoluzione molecolare. Cryo-ET è particolarmente adatto per studiare i grandi complessi di membrane biologiche, perché le membrane appaiono con un buon contrasto e sono facili da tracciare in volumi tomografiche 3D. Altri metodi per studiare la struttura 3D delle cellule o organelles non forniscono dettagli molecolare. Super-risoluzione microscopia ottica 10, 11 è eccellente a rivelare la posizione o distanze tra etichette luminescenti collegati a proteine ​​di interesse con una precisione di decine di nm, ma non rivela la struttura della proteina stessa, anche a bassa risoluzione . Microscopia elettronica a trasmissione di sezioni seriali di 12 o di imaging block-face da microscopia elettronica a scansione 13 di campioni biologici di plastica-embedded offrono viste a bassa risoluzione di volumi cellulari, ma allo stesso modo non rivelano dettaglio molecolare. Microscopia a forza atomica 14 può in linea di principio di fornire risoluzione molecolare o atomica, ma solo alla superficie degli oggetti su un atomicamente piatta sostegno, solido. Infine, tomografia a raggi X 15 o dispersione di impulsi di raggi X intensi da laser ad elettroni liberi 16 è improbabile per rivelare la struttura di grandi e complessi, oggetti aperiodici come le cellule intere o organelli a mRisoluzione olecular nel prossimo futuro. Quindi allo stato attuale, non vi è alcuna alternativa al crio-ET per studi sulla struttura 3D di cellule o organuli a risoluzione nanometrica. Cryo-ET è il metodo di scelta per l&#39;esame della struttura e la conformazione dei gruppi di proteine ​​associate alla membrana, tra cui il complesso del poro nucleare 17, il picco dell&#39;influenza complessi 18, e flagelli proteine ​​motrici 22, 23 ma anche l&#39;organizzazione di intere cellule batteriche 19 e l&#39;entrata di virus patogeni come l&#39;HIV nelle cellule 20-23. Cryo-ET ha un valore inestimabile per la visualizzazione di proteine ​​filamentose e le loro interazioni nella cellula, compresi i filamenti di actina 24 o axonemes 25. La risoluzione può essere migliorata a 2 nm o meglio subtomogram media di 26, in base al quale subvolumes di ripetute, lineamenti regolari sono tagliati fuori da un volume tomografica e media per singola particella Image Protecniche di lavorazione. Cryo-ET comporta l&#39;acquisizione di una serie di immagini di proiezione di un esemplare sottile (&lt;250nm) prese a diversi angoli di inclinazione in un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Il campione deve essere sottile in modo che gli elettroni, che interagiscono fortemente con la materia, sono sparsi in non più di una volta. Scattering multiplo rende le immagini risultanti difficili da interpretare e riduce il contrasto. Immagini dell&#39;area campione selezionato sono allineati l&#39;uno rispetto all&#39;altro e proiettati in uno spazio 3D da un programma per computer adatto, generando un volume 3D del campione. L&#39;allineamento delle immagini è aiutata da marker fiduciali oro, che si mescolano con il campione prima del congelamento. Marker fiduciali Idealmente 10 o più equamente distribuiti dovrebbero essere presenti in ogni immagine per ottenere un buon allineamento. Per osservare dettaglio molecolare, i campioni sono tuffo congelati in etano liquido, che conserva il loro stato idratato nativo. Congelamento di liquidoetano è così veloce (~ 10 5 ° C / sec) 27 che l&#39;acqua non cristallizza, ma rimane in uno stato simile al vetro vetrificato. Cristalli di ghiaccio danneggia formazione strutture biologiche sensibili. Come campioni biologici soffrono di danni da radiazioni, c&#39;è un limite al numero totale di eventi di scattering il campione può tollerare. Le immagini vengono quindi acquisiti in modalità a basso dosaggio: Una zona di interesse è identificata a basso ingrandimento (1,500X) con una dose inferiore a 1 elettrone e - / nm 2 (modalità di ricerca). L&#39;immagine viene poi messo a fuoco con un ingrandimento maggiore, l&#39;area di interesse (modalità di messa a fuoco). Solo quando l&#39;immagine viene acquisita, l&#39;area di interesse viene irradiata con una dose elevata di elettroni (modo di esposizione). Qui, vi presentiamo una panoramica di come raccogliere e di elettroni processo di crio-tomografie, utilizzando ATP sintasi dimeri nella membrana mitocondriale interna come un esempio. Il seguente protocollo descrive come preparare i mitocondri per crio-ET, come impostaree raccogliere una serie di inclinazione con una dose specifica di elettroni totale, e come elaborare la serie di inclinazione per ottenere un volume 3D della zona di interesse. Una panoramica della procedura è illustrata nella figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

Electron crio-tomografia è un potente strumento per la biologia strutturale, in grado di visualizzare la struttura tridimensionale di campioni biologici, come le cellule, organelli, vescicole di membrana, o virus al dettaglio molecolare. Per raggiungere questo obiettivo, il campione acquoso viene rapidamente vetrificato in etano liquido, che conserva in uno stato congelato-idratata close-to-native. Nel microscopio elettronico, serie inclinazione sono rilevati alla temperatura dell&#39;azoto liquido, da cui tomografie 3D sono ricostruiti. Il rapporto segnale-rumore del volume tomografica è intrinsecamente bassa. Riconoscibile, caratteristiche ricorrenti sono arricchite da subtomogram media, con la quale i singoli subvolumes sono tagliati fuori, allineati e media per ridurre il rumore. In questo modo, le mappe 3D con una risoluzione di 2 nm o migliore può essere ottenuto. Una forma di strutture ad alta risoluzione disponibili al volume 3D allora produce modelli atomici di complessi di proteine ​​nel loro ambiente nativo. Qui mostriamo come usiamo elettrone crio-tomograpHY per studiare in situ organizzazione di grandi complessi proteici di membrana in mitocondri. Troviamo che sintasi ATP sono organizzati in file di dimeri lungo apici molto curve della membrana interna creste, mentre io complesso è distribuito in modo casuale nelle regioni di membrana su entrambi i lati delle righe. Con subtomogram media abbiamo ottenuto una struttura mitocondriale ATP sintasi dimero all&#39;interno della membrana creste.

Electron crio-tomografie di mitocondri rivelano chiaramente la morfologia 3D del organello (Figura 2). Segmentazione manuale delle membrane in un volume tomografica illustra la struttura delle creste in un mitocondrio. Con l&#39;imaging mitocondri provenienti da diversi ceppi di lievito eliminazione diretta che mancano alcuni componenti proteiche, l&#39;effetto di queste proteine ​​su creste morfologia può venire valutato. Figura 3 mostra un mitocondrio da un ceppo di lievito privo di ATP sintetasi subunità e. Questo componente è necessario del complesso ATP sintasi per la dimerizzazione della ATP sintasi mitocondriale. I mitocondri da questo ceppo manca la normale lamellare creste dei mitocondri di tipo selvatico (Figura 2) e invece contiene una serie di compartimenti membrana interna. Questi comparti sono o privi di creste o contengono piccole invaginazioni di membrana a forma di palloncino (Figura 3). In tomograms con un buon contrasto, grandi complessi di proteine ​​mitocondriali, in questo caso ATP sintasi dimeri, sono facilmente visibili (figura 4; Movie 1). Le strutture dei complessi possono essere determinati a 2-3 nm risoluzione da subtomogram media (figura 5; Movie 2). I volumi medi possono essere riposti nella tomografia per valutare l&#39;organizzazione dei singoli complessi rispetto all&#39;altro e ad altri complessi proteici nella membrana (Figura 6; film 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Flow-chart che mostra le fasi di elettroni crio-tomografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Figura 2 Morfologia di un mitocondrio di tipo selvatico S. Cerevisiae. Fetta centrale attraverso un volume tomografica di un tipo selvatico S. mitocondrio cerevisiae (a sinistra) e il corrispondente volume-superficie di rendering (a destra). Il volume segmentato della membrana esterna è visualizzata in grigio e volumi del limite interno e creste membrane in azzurro. Adattato da Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 mitocondrio da una S. Cerevisiae ceppo manca una subunità necessarie perATP sintasi dimerizzazione. Tagliate attraverso il volume tomografica (a sinistra), che accompagna il volume-superficie di rendering (a destra) di un mitocondrio da una S. Cerevisiae ceppo manca la proteina subunità e necessario per l&#39;ATP sintasi dimerizzazione. Quando confrontato con la figura 2, il mitocondrio dal ceppo mutante manca la normale lamellare creste dei mitocondri tipo selvatico. Invece, il mitocondrio ha molti compartimenti di membrana interna sia con senza creste o creste a forma di palloncino. Così elettrone crio-tomografia evidenzia alterazioni della morfologia della membrana a causa di delezioni geniche. Adattato da Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 mitocondrio dal fungo P. anserina. Affettare attraverso il volume tomografica (a sinistra) e di volume-superficie di rendering di accompagnamento (a destra) di un mitocondrio dal fungo filamentoso P. anserina. In questo tomogramma, filari di 10 particelle nm (frecce gialle) si trovano sopra le creste molto curve di membrana in membrana creste interna (vedi filmato 1). Queste particelle sono state identificate come dimeri ATP sintasi di subtomogram media. Da Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Struttura e organizzazione della ATP sintasi mitocondriale. Laterale e vista dall&#39;alto che mostra la densità elettronica di un dimero ATP sintasi da S. c<html> erevisiae come determinato dal subtomogram media con modelli atomici a muro (a sinistra). Mitocondriale vescicola membrana interna che mostra l&#39;organizzazione di ATP sintasi dimeri in righe (a destra). Il dato è stato generato posizionando la media subtomogram della sintasi dimero ATP nel volume segmentato della vescicola membrana, utilizzando le coordinate calcolate durante media. Adattato da Davies et al 8. Modelli atomici: F 1 / rotore-ring [PDB: 2WPD] 39 (blu e viola); oligomicina sensitive conferendo proteina-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); frammento gambo periferico [PDB: 2CLY] 1 con residui N-terminali da [PDB: 2WSS] 2 (giallo e rosso) (vedi Movie 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6 Isolato Crista vescicola da un P. anserina mitocondrio. Fette da un volume tomografica (a sinistra) e di volume-superficie di rendering di accompagnamento (a destra) di una vescicola crista da P. anserina. Densità di proteine ​​che sporgono dalla membrana sono chiaramente visibili. Le densità indicati da frecce gialle sono dimeri ATP sintetasi, come individuate dalla subtomogram media. Frecce verdi indicano densità individuati mediante l&#39;etichettatura degli anticorpi come NADH deidrogenasi (complesso 1, per i dettagli vedere 9). Segmentazione delle densità di proteine ​​rivela la loro organizzazione in creste, con i dimeri ATP sintasi (rosso e giallo) che formano righe lungo i crinali creste molto curve e complessi NADH deidrogenasi (verdi) nelle regioni di membrana su entrambi i lati delle righe (vedi Movie 3). Da Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Movie 1 Electron crio-tomogramma di un P. anserina mitocondrio. Il filmato mostra le fette successive attraverso un volume tomografica presa di un mitocondrio dal fungo filamentoso P. anserina. Righe di ATP sintasi sono indicati da frecce gialle. Il volume segmentato superficie rendering mostra la posizione di ATP sintasi (sfere gialle) in relazione alla struttura creste 3D. Membrana esterna, grigio; membrana limite interno, blu trasparente; creste membrane, blu opaco. Da Davies et al 9. Vedere anche la Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Movie 2 media Subtomogram della sintasi mitocondriale dimero ATP da S. Cerevisiae con modelli atomici a muro. La media è statacalcolata da 121 subvolumes. La densità viene visualizzata a tre livelli di contorno: 1s - maglia, 2s - grigio chiaro e 3s - grigio scuro. Modelli atomici sono stati montati nella densità utilizzando la routine in forma sequenziale in Chimera. Modelli atomici: F 1 / rotore-ring [PDB: 2WPD] 39 (blu e viola); oligomicina sensitive conferendo proteina-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); frammento gambo periferico [PDB: 2CLY] 1 con residui N-terminali da [PDB: 2WSS]. 2 (giallo e rosso) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Adattato da Davies et al 8. Vedere anche Figura 5. Movie 3 Isolati creste vescicola da un P. anserina mitocondrio. fette successive attraverso il volume tomografica sono presenti, seguito dal volume-superficie resi segmentato. Densità di proteine ​​sporgenti dal membrane sono chiaramente visibili. Densità rossi e gialli sono dimeri ATP sintetasi. Densità verdi sono NADH deidrogenasi (complesso I), come determinato mediante l&#39;etichettatura degli anticorpi. Da Davies et al 9. Vedere anche Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

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Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l&#39;organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.6K Views.  Max Planck Institute of Biophysics.  Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l'organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone. 

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Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Ricerca

Biologia

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

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Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Visualizzazione dei Vascolare Ca^{2 +} Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni

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