فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة أكرون لتمويل التي دعمت هذا العمل.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية قوية جدا التي تمتد العديد من التخصصات. أنها فعالة من حيث التكلفة، والانضباطي إجراء بسيط نسبيا، مما يسمح إنتاج غلة عالية من البروتينات مصمم خصيصا. من المهم أن نلاحظ أن تصميم والتعبير عن البروتينات المستهدفة ليست دائما واضحة. التعبير ...

البروتينات تغطي مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية التي هي المسؤولة عن العديد من الوظائف البيولوجية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل الأنسجة السليمة والمنظمة. هذه الجزيئات بدء الآلاف من مسارات الإشارات التي تتحكم يصل التنظيم و / أو أسفل تنظيم الجينات والبروتينات الأخرى، والحفاظ على التوازن داخل الجسم البشري. تعطيل بروتين واحد يؤثر هذا على شبكة الإنترنت بأكملها من الإشارات، التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور اضطرابات مدمرة أو الأمراض. هندسة البروتينات الفردية في المختبر يقدم حلا واحدا لمكافحة هذه الآثار الضارة ويوفر بديلا للأدوية جزيء صغير. في عام 1977، وكان الجينات ترميز التسلسل السوماتوستاتين 14 حمض أميني واحد من البروتينية المهندسة الأولى التي تم إنشاؤها باستخدام E. القولونية 1. بعد فترة وجيزة في عام 1979، تم استنساخ الأنسولين في البلازميد pBR322، حولت، أعرب، وتنقيته 2. منذ ذلك الحين، توسعت البروتينات المؤتلف نفوذهم لحقول متعددة من الدقةearch مثل المواد الحيوية، تسليم المخدرات، وهندسة الأنسجة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، والزراعة، والانزيمات الصناعية والوقود الحيوي وغيرها (للاستعراضات انظر المراجع 3-8). ويرجع إلى حد كبير إلى براعة أن التقنية تقدم عن طريق إضافة الأنصاف تطبيق معين الكيميائية أو تسلسل البروتين لأغراض بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، وتحديد البروتين الهدف وتحقيق الاستقرار وتنقية هذا. عبر تقنية الحمض النووي المؤتلف، والبروتينات المؤتلف يمكن التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنظمة المضيف حقيقية النواة وبدائية النواة بما فيها الثدييات، النباتات، الحشرات، الخميرة، والفطريات، أو البكتيريا. يقدم كل مضيف مزايا مختلفة وعادة ما يتم تحديد أفضل نظام قائم على وظيفة البروتين، والغلة، والاستقرار، والتكلفة الإجمالية، وتطويره. وغالبا ما تفتقر خلايا البكتيريا آليات التعديل بعد متعدية التي توفر المضيفين حقيقية النواة (أي ارتباط بالغليكوزيل، ثاني كبريتيد سد، ه<html> ح.) 5. ونتيجة لذلك، تؤدي أنظمة الثدييات والحشرات عادة في أفضل التوافق والتعبير عن البروتينات حقيقية النواة، ولكن هذه المضيفين وعادة ما تكون أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا 9. لذا، E. القولونية هو المضيف يفضل لنظام التعبير لدينا لأن الخلايا التوسع بسرعة في ظروف النمو غير مكلفة وآليات التعبير الجيني مفهومة جيدا 5،9. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام من السهل أن حجم المتابعة لأغراض الإنتاج والنتائج في البروتينات وظيفية على الرغم من عدم وجود تعديلات ما بعد متعدية 10. وE. يتم اختيار سلالة القولونية K12 في هذا البروتوكول لاستنساخ لأن هذه السلالة يقدم عوائد البلازميد ممتازة على أساس الكفاءة التحول عالية. بالإضافة إلى ذلك، E. ويستخدم سلالة القولونية BL21 للتعبير لأن هذه السلالة المضيف يحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 الجين الذي يوفر البروتين التعبير للرقابة والاستقرار 11. خيمة &quot;&gt; بعد اختيار المضيف، يجب اتخاذ مزيد من الحذر في اختيار ناقلات التعبير المثالي لتسهيل اختيارها والتحكم التعبير البروتين. توليف البروتينات المؤتلف يبدأ مع تسلسل الحمض النووي المستهدف أن يتم استنساخ بتوجيه من البكتيريا T7 النسخ وإشارات الترجمة، و هو فعل التعبير في الخلايا المضيفة التي تحتوي على نسخ الكروموسومات من الجين T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز 12. هذه النواقل، والمستمدة من pBR322 ناقلات البلازميد (للمراجعة أنظر المرجع 13)، وتخضع لرقابة مشددة من قبل المروج T7 وضعت في البداية من قبل الدارس وزملاؤه 14 وتوفير إضافية التحكم من خلال إدراج المشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي وأمريكا اللاتينية والكاريبي كاظمة (lac1) 15،16. للالمؤتلف هندسة البروتينات، وهذا النظام التعبير يوفر القدرة على تصميم تسلسل الأحماض الأمينية معينة من البروتين المطلوب عن طريق إدخال مختلفة تسلسل الحمض النووي المستهدف أو لإنشاء البروتينات الانصهار تتكون من المجال جنبا إلى جنبق من البروتينات واحدة. بالإضافة إلى ذلك، بعض النواقل سلسلة تشمل الببتيد علامة تعديلات على وضعها على N C أو محطة. لأغراض التصميم لدينا، تمت إضافة الحامض الاميني (صاحب) علامة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لتنقية وأدرج تسلسل biotinylatable 15 الأحماض الأمينية لbiotinylation 17،18. في هذا البروتوكول البلازميد التي تحتوي على الجينات المقاومة الأمبيسلين، تم اختياره لتحمل لنا الانصهار biotinylatable تسلسل البروتين. يتم التحكم في هذا التعبير ناقلات عبر T7 المروج أمريكا اللاتينية والكاريبي والتي يسببها بسهولة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). وتستخدم تعبيرات اختبار (الثقافات على نطاق صغير) لتحديد وجود والذوبان من البروتين المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في أي شكل قابل للذوبان أو غير قابلة للذوبان في صياغة إجراءات التنقية. وهناك البروتين للذوبان أعرب داخل الخلية البكتيريا الخضوع للطي التلقائي للحفاظ على الهيكل الأصلي لها 19. عادة الأمبنية مواتية الديناميكا الحرارية. في كثير من الحالات النشاط الأيضي للمضيف لا يفضي إلى البروتين الهدف، ووضع الضغط على النظام الذي يؤدي إلى إنتاج بروتين غير قابلة للذوبان وتشكيل الهيئات إدراج تتألف من المجاميع البروتين غير قابلة للذوبان. وبالتالي فإن البروتين الهدف يبدل طبيعة، جعلها غير نشطة بيولوجيا عموما 20. يتم تحجيم المتابعة كلا التعبيرين الاختبار، ويتم تحديد إجراءات العزل عن طريق ذوبان البروتين الهدف. مطلوب استعادة الطبيعة إضافية أو طوي ثانية خطوة للبروتينات قابلة للذوبان. البروتينات المؤتلف الناتجة يمكن تنقيته باستخدام مزيد من حجم الاستبعاد اللوني. في البيت يوفر إنتاج البروتين المؤتلف مزايا التكلفة على المنتجات التجارية منذ ملليغرام من البروتين الهدف يمكن أن تكون معزولة للتر الواحد من الثقافة الرئيسية. معظم المعدات المطلوبة متاحة في مختبر البيولوجية أو الكيميائية التقليدية. الهندسة البروتين يسمح لخلقالبروتينات الانصهار مخصصة مع وظائف المضافة التي ليست دائما متاحة تجاريا. الشكل 1 يصور الإجراءات الرئيسية التي تشارك في البروتينات المؤتلف الهندسة. مع هذا النظام التعبير أنشأنا العديد من البروتينات biotinylatable، مثل انترفيرون غاما، عامل النمو المشتق من الصفيحات، وعظم تخلقية البروتين 21-23، ولكن سوف نركز على اثنين من البروتينات التي قمنا بتصميم لتوجيهات محوار، NGF (29 كيلو دالتون ) وSEMA3A (91 كيلو دالتون) 10 (للمراجعة أنظر المرجع 24). Biotinylation هو أسلوب شائع لتحديد الهوية، وتجميد وعزل البروتينات المسماة باستخدام المعروفة البيوتين streptavidin التفاعل 25-27. تحقيقات الفيزيائية الحيوية 28،29، 30 أجهزة الاستشعار، ونقاط الكم 31 بعض الأمثلة من النظم التي تستخدم تقارب عالية من البيوتين streptavidin اقتران مع د K بناء على أمر من 10 -15 M 27. وE. الحيوي القولونيةيغاز القصدير، البيرة، يساعد في المرفق التساهمية من البيوتين إلى جانب سلسلة يسين وجدت داخل البيوتين الموسومة تسلسل 18،32. وقد أنتجت الربط البيوتين على المواد والجزيئات الحيوية تسليم مستمرة من عوامل النمو إلى الخلية لعدة تطبيقات هندسة الأنسجة 21،33-35. وبالتالي، هندسة هذه البروتينات مصمم خصيصا biotinylatable هو أداة قوية يمكن أن تتجاوز الاهتمامات البحثية متعددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

وقد استخدمت المؤتلف هندسة البروتينات القولونية (E. كولاي) نظم التعبير عن ما يقرب من 4 عقود، واليوم E. كولاي لا يزال الكائن المضيف الأكثر استخداما على نطاق واسع. مرونة النظام يسمح لإضافة الأنصاف مثل علامة البيوتين (للتفاعل streptavidin) والبروتينات وظيفية أكبر مثل بروتين الفلورية الخضراء أو الكرز الأحمر البروتين. أيضا، وقد مكن دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية مثل chelators أيون الفلز، المجموعات الوظيفية على رد الفعل فقط، تحقيقات الطيفية، والجزيئات نقل التعديلات بعد متعدية التلاعب أفضل من خصائص البروتين وظائف. ونتيجة لهذا الأسلوب يخلق البروتينات الانصهار للتخصيص التي تقدم فائدة كبيرة لمختلف مجالات البحث العلمي. وبشكل أكثر تحديدا، قد أدرجت تسلسل البروتين biotinylatable في العديد من البروتينات المستهدفة بسبب تفاعل عالية تقارب بين البيوتين مع أفيدين وstreptavidin. وقد ساعد هذا في تعزيز بالإضافة إلى ذلك كشف وتنقية البروتينات الموسومة فضلا عن فتح المجال لتطبيقات الثانوية مثل الفرز الخلية. وبالتالي، تظهر جزيئات البيوتين المسمى تأثير متزايد وعلى نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي وbioindustrial. لغرض بحثنا قمنا هندسة البروتينات الانصهار المؤتلف البيروكسيديز تحتوي على عامل النمو العصبي (NGF) وsemaphorin3A (SEMA3A) مناطق وظيفية. لقد ذكرت سابقا كيف أن هذه البروتينات الانصهار البيروكسيديز، جنبا إلى جنب مع غيرها من تسلسل البروتين النشط، يمكن المربوطة إلى الحيوية لهندسة الأنسجة وأغراض التجدد. يحدد هذا البروتوكول أساسيات الهندسة biotinylatable البروتينات في نطاق مليغرام، وذلك باستخدام T7 لاك محرض النواقل وE. المضيفين التعبير القولونية، بدءا من التحول لتوسيع نطاق المتابعة وتنقيتها.

<html> الاستنساخ واختبار التعبير عندما يتم تنفيذ الطلاء بشكل صحيح، يجب مستعمرات معزولة واحد تشكيل لزيادة فرص نتف البكتيريا الخلايا تحولت نسيلي (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا ومطلي عدد كبير جدا من الخلايا، يتم تحضين لوحات ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا.

التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.4K Views.  University of Akron.  تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا. 

Video: Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

استخدام الخلايا الجذعية البشرية ارتشاح لتجديد العظام

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; للبشرة هندسة الأنسجة

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

عزل الفئران الدهنية المشتقة من الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة شظايا كما وحدات الأوعية الدموية للهندسة الأنسجة

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

عملية صب المستندة إلى الغزل الرطب من الجيلاتين لتجديد الأنسجة

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...