نحن نعترف بامتنان تقاسم المصادر المفتوحة من MATLAB تتبع الجسيمات رمز تقدمها ماريا Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> )، جنبا إلى جنب مع رمز IDL في وقت سابق وثائق واسعة النطاق التي تقدمها جون كروكر واريك أسابيع R.. وقدم هذا العمل ممكن بتمويل من المعهد الوطني للسرطان (لجنة التحقيق الوطنية / NIH)، وK99CA155045 R00CA155045 (PI: JPC).

1. الأجسام الشبه الكروية التثقيف ورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 10 مل من الماء خلية ثقافة الصف مع 0.1 غرام من الاغاروز للحصول على حل الاغاروز 1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة الحل الاغاروز إلى فوق 70 درجة مئوية (حوالي 14 ثانية في الميكروويف القياسية أو باستخدام لوحة التسخين) قبل aliquoting 40 ميكرولتر من الحل الاغاروز في بئر في لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل في حين حصاد الخلايا باستخدام التقنيات القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدادة الكريات لتحديد تركيز الخلايا في التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق الخلية إلى 1،000 خلية / مل وإضافة 100 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى البئر تحتوي على سرير الشفاء الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينة على شاكر بين عشية وضحاها في حاضنة تعيين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينة من شاكر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الكروية حتى يتم التوصل إلى القطر المطلوب. على سبيل المثال، وبعد 9 أيام، وهي ليرة سوريةheroid سيكون حوالي 450 ميكرون في القطر. خلال هذا الوقت، وسائط النمو الطازجة يمكن أن تضاف إلى الآبار ولكن ينبغي تجنب التطلع لأن هذا سيؤدي إلى إزالة كروي. </li></ol> 2. إعداد الأجسام الشبه الكروية جزءا لا يتجزأ من ورم 3D في ECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محطة عمل مع المواد اللازمة داخل غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط مخفف من المعدلة الكربوكسيل 1 ميكرون قطر تحقيقات التتبع الفلورسنت بإضافة تحقيقات الأسهم 2 أجزاء (2٪ مواد صلبة) إلى 25 أجزاء من الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة زجاجة من 3.1 ملغ / مل الكولاجين البقري من الثلاجة ووضعه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 125 ميكرولتر من الكولاجين إلى 2 مل قارورة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من المخفف الحل التتبع التحقيق إلى القارورة التي تحتوي على الكولاجين ودوامة لفترة وجيزة لتوزيع تحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 235 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة ثقافة الخلية التي تحتوي على الفينول الحمراء (والتي سوف تتحول الصفراء) لمجموع حجم 410 مل ودوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 مل (نصف مجموع حجم) ووضعه في قارورة جديدة 2 مل. سوف قارورة تحتوي على 1 كروي الورم وسوف فيال 2 أن تكون مزيجا السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 2 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 1 إلى 1 فيال لتحقيق الحل إلى محايد الرقم الهيدروجيني (يجب سائل الإعلام والثقافة التي تحتوي على الفينول الأحمر العودة إلى اللون الأحمر). لاحظ أن هذا سوف يسبب الخليط لبدء علاج إذا لم يتم الاحتفاظ به على الجليد. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج، ثم العودة إلى رف الجليد على الفور. ملاحظة: كروي هو بالكاد مرئية للعين المجردة بعد 9 أيام من الثقافة وزواله من السرير الاغاروز مهمة حساسة. استخدام المجهر تشريح قد يكون من المفيد لبعض المستخدمين. الحفاظ على سلامة كروي أثناء النقل هو الهدف الأسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الحافة واسعة الفم، وإزالة بلطف 40 ميكرولتر من وسائل الاعلام من البئر الذي يحتوي على الورم كروي. الإبقاء على هذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق البئر لمعرفة ما إذا كان كرويتمت إزالة في الخطوة السابقة. إذا كان، إضافة 40 ميكرولتر تحتوي كروي لفيال 1، وإذا لم يكن كذلك، ضع 40 ميكرولتر مرة أخرى إلى البئر وكرر الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف اثارة فيال 1 (لا خطر vortexing ل، فإنه قد يؤدي إلى تلف كروي) قبل نقل الخليط في 60 ميكرولتر في أجزاء منفصلة من ثلاثة آبار لوحة 96 جيدا. تفقد كل بئر مع المجهر بعد إضافة الخليط إلى تحديد والذي يحتوي أيضا كروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 2 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم و 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى فيال 2 ودوامة قبل aliquotting 60 ميكرولتر من هذا الخليط لبئر فارغة في لوحة 96 جيدا ووضع العلامات كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية إلى علاج لمدة 1 ساعة على الأقل. </li></ol> 3. كونستركت شبكة من نقاط عينة وتأخذ شريط فيديو في كل نقطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة عينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. سماح 10 دقيقة للعينة لequilibrate مع درجة حرارة الغرفة إذا مرحلة ساخنة غير متوفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة عينة مع انخفاض العدسات الهدف بالطاقة للتأكد من انها سليمة وجاهزة للتصوير. تحديد موقف الورم داخل البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كيفية العديد من نقاط العينة التي يجب اتخاذها. عادة، سوف 20 نقطة العينة في كل بئر، وزعت في حلقات متحدة المركز حول كروي نتائج مفصلة بشكل كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة إلى كل الموضع المطلوب واستخدام المجهر التواصل البرمجيات لتسجيل x و y الإحداثيات (أو إحداثيات سجل يدويا إذا تفاعل البرمجيات غير متوفرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل المجهر لعدسة الهدف رفيع المستوى (عادة 100X)، وحدد المكعب مرشح المناسب لطول الموجة من الإثارة تحقيقات التتبع. استخدام قائمة من النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4 للانتقال إلى أول نقطة في الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التركيز للعثور على قاع البئر، ثم نقل ما يصل الى العثور على مجال الرؤية (فوف) التي تحتوي على العديد من تراك في التركيزإيه تحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الرسم البياني شدة وضبط شدة التعرض والوقت لإعطاء أعظم النطاق الديناميكي ممكن مع ضمان أن الصورة لا تصبح مشبعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تسلسل الفيديو بمعدل الإطار من 20-30 ميللي ثانية لكل إطار (ما يقرب من 800 لقطة في الثانية أو 16-24 في طول ينصح لتوفير إحصاءات كافية عن الحساب MSD قوية متوازنة مع الحاجة إلى تقليل اكتساب الوقت في كل نقطة الشبكة المكاني) وحفظ مع اتفاقية المناسبة. أثناء التسجيل، لا تلمس المجهر أو الجدول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،6-3،9 لكل نقطة عينة في الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 3،3-3،10 لكل بئر في التجربة. </li></ol> 4. تحليل البيانات والفيديو لحساب خصائص الريولوجية في كل نقطة عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ كافة بيانات الفيديو إلى مجلد تحليل (ربما على كمبيوتر آخر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد بيانات الصورة في MATLAB أو برامج التحليل الأخرى. NOTE: وثائق واسعة النطاق بشأن مجموعة من الجسيمات MATLAB إجراءات تتبع اعتمدت هنا هو متاح في <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . فمن المستحسن استخدام وظيفة الدعوة مخصصة لأتمتة معالجة ملفات متعددة في مواقع مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة البرمجيات من خلال تحليل عدة إطارات من الفيديو لتحديد بشكل مناسب الاختيار والرفض المعلمات (الحجم، ممر الموجة، الخ) لتحديد مواقع مركز التحقيق. يوصف خلفية واسعة لهذه الخطوات الحاسمة التي كتبها كروكر وجرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج لتحديد تلقائيا كل موقف دقق في جميع الأطر الفيديو ومن ثم ربط هذه المواقف في مسارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البيانات مسار لحساب متوسط ​​مربع الإزاحة (MSD) بوصفها وظيفة من الوقت الضائع، ويجري التأكد من تطبيق عامل المعايرة المكانية المناسبة (ميكرون لكل بكسل) للعدسة هدف محدد، أي binning بكسل، الخ (نفذت عادةفي البيانات الفوقية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب G * (باستخدام المعمم علاقة ستوكس آينشتاين تؤخذ بعين الاعتبار حدود انطباق GSER عن معين عينة 24،28،43. بدلا من ذلك، قد يرغب المستخدمين لتفسير خصائص ECM مباشرة من MSD ببساطة عن طريق المقارنة بين قانون السلطة التحجيم، الهضبة القيم والأرقام القياسية لعدم التجانس أو غيرها من المعالم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4.2 خلال 4.6 لكل فوف في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في تسجيل البيانات الموقف من الخطوة 3.4 مع modulii اللزجة على تردد معين من الفائدة. اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر المستخدمة، وهذه الخطوة يمكن أن تيسره روتين مخصصة التي يقرأ البيانات الوصفية المجهر أو موقف البيانات يمكن جدولتها يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظائف 3D الاستيفاء لتوليد خريطة الريولوجيا المكاني للECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

في هذا البروتوكول نقدم استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع التغيرات المحلية طوليا في ECM صلابة في نماذج ورم 3D. ونحن نتصور أن هذه المنهجية يمكن أن تعتمدها علماء الأحياء السرطان وفيزيولوجيون المهتمين في السلوك mechanosensitive المتورطين في مصفوفة إعادة عرض خلال...

يبدو واضحا من مجموعة متزايدة من الأدلة في الأدب أن الخلايا السرطانية، كما هو الحال مع الخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة، هي حساسة للغاية إلى الخواص الميكانيكية والفيزيائية الحيوية المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومكونات أخرى المكروية 1-9. وقد وفرت الدراسات الآلية أنيقة نظرة ثاقبة لدور صلابة خارج الخلية كشريك إشارات mechanosensitive المعقدة التي تنظم السلوك نمو خبيث والتشكل 2،3،10،11. وقد تيسر هذا العمل ولا سيما من خلال تطوير نماذج 3D في المختبر أن الورم استعادة بيولوجيا هندسة الأنسجة ذات الصلة، ويمكن زراعتها في المواد السقالة مع الميكانيكا الانضباطي والتقط بواسطة المجهر الضوئي 12-19. ومع ذلك، فإن الجانب الآخر من هذا الحوار mechanoregulatory بين الورم والمكروية، وسرطان الخلايا بدوره من خلالها تعديل الريولوجيا من محيطهم، لا يزال إلى حد ماأكثر صعوبة للدراسة. على سبيل المثال، أثناء عمليات الغزو، والخلايا في محيط الورم قد يخضع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) وزيادة التعبير عن metalloproteases مصفوفة (تقوم ال MMPs) التي تسبب تدهور المحلية من ECM 20-22، والذي بدوره يؤثر على سلوك نمو mechanosensitive من الخلايا السرطانية القريبة الأخرى. من خلال مجموعة متنوعة من العمليات البيوكيميائية، وسرطان الخلايا الهاتفي باستمرار صلابة بيئتهم المحلية صعودا وهبوطا لتناسب عمليات مختلفة في أوقات مختلفة. والدافع وراء هذه المنهجية الموصوفة هنا بسبب الحاجة إلى الأدوات التحليلية التي تبلغ عن التغيرات المحلية في صلابة والامتثال للECM خلال النمو، والتي يمكن دمجها مع نماذج 3D والورم المترابطة طوليا مع التغيرات البيوكيميائية والمظهرية دون إنهاء ثقافة. في البحث عن الطريقة الصحيحة لتنفيذ في هذا السياق، microrheology الجسيمات تتبع (PTM) يظهر كمرشح قوي.هذا الأسلوب، رائدة في الأصل من قبل ميسون ويتز 23،24، يستخدم حركة تحقيقات التتبع جزءا لا يتجزأ من السوائل المعقدة للإبلاغ عن معامل معقدة تعتمد على تردد اللزجة القص، G * (ω) في جداول طول ميكرون. وقد تم تطوير هذا النهج العام مع وجود اختلافات متعددة تناسب تطبيقات مختلفة في لينة مكثف المسألة، الغرويات، الفيزياء الحيوية والفيزياء البوليمر 25-31. PTM له بعض المزايا النسبية لأساليب أخرى، حيث يتم تقديم قراءات من زوجية المحلية من خلال التصوير الفيديو غير مدمرة تحقيقات التتبع غير نشط كيميائيا التي أدرجت في وقت إعداد الثقافة وتبقى في مكانها على مدى فترات طويلة من النمو. هذا هو على النقيض من القياسات معيار الذهب مع القص متذبذبة مقياس غلفاني بكميات كبيرة، الأمر الذي يتطلب بالضرورة إنهاء ثقافة والتقارير الريولوجيا العيانية الأكبر من عينة بدلا من القياسات نقطة داخل مجمع microenvir الورم 3Donment. في الواقع عددا من الدراسات قد بينت فائدة تفسير قياسات حركات التتبع التحقيق في أو حول الخلايا السرطانية أو غير السرطانية لقياس التشوهات المرتبطة بالهجرة خلية 32، إجهاد الناجم عن كروي توسيع 33، 34،35 الريولوجيا داخل الخلايا، و لرسم خريطة الضغوط الميكانيكية وهندسة الأنسجة سلالات في 36، والعلاقة بين حجم المسام وسرعة الغزو 37. تقنيات أخرى مناسبة لmicrorheology، مثل القوة الذرية المجهري (AFM) يمكن تنفيذها، ولكن في المقام الأول لبحث نقاط على سطح العينة وأيضا قد تشكل قضايا العقم الثقافة التي تعقد قياسات الطولية 38. هنا، نحن تصف بروتوكول شامل يشمل أساليب لنمو الورم 3D الكروية مناسبة لنقل في ECM مع تحقيقات الفلورسنت المدمجة للفيديو الجسيمات تتبع وتحليل أساليب لرسم خرائط موثوق المكانيةالتغييرات في microrheology على مر الزمن في الثقافة. في تنفيذ الحاضر، تزرع نماذج 3D الورم في شكل multiwell بهدف نحو إدماج قياسات microrheology مع المقايسات التقليدية الأخرى (على سبيل المثال، السمسة) هذا الشكل الذي يفضي إلى. في هذا التوضيح ممثل هذه المنهجية أننا الثقافة في المختبر باستخدام الأجسام الشبه الكروية 3D-1 PANC الخلايا، وهو خط خلية سرطان البنكرياس أنشئت المعروفة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية 39، ولكن جميع القياسات الموصوفة هنا تنطبق على نطاق واسع لدراسة الأورام الصلبة باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا مناسبة لثقافة 3D. لأنه يستند أصلا إلى التصوير هذه الطريقة هي مناسبة بشكل مثالي لاشتراكهما تسجيل البيانات microrheology عالية الدقة مع الحقول التي تنتقل عن طريق الضوء كبير من الرأي القائل بأن التبليغ عن أي تغييرات في نمو الخلايا، والهجرة والنمط الظاهري. تنفيذ PTM متكاملة مع المجهر الضوئي المنقولة بهذه الطريقة يفترض تحديد المواقع استنساخه من ذوي الخوذات البيضاء مرحلة المجهرمعنوى يتوفر عادة على المجاهر البيولوجية widefield epifluorescence التجارية الآلية. بروتوكول تطوير أدناه يمكن تنفيذها مع أي المجهر البيولوجية مضان الآلي مجهزة بشكل معقول. هذا هو أسلوب كثيفة البيانات بطبيعتها، الأمر الذي يتطلب اكتساب غيغابايت من البيانات المجهري الفيديو الرقمية لمعالجة حاليا. في بروتوكول التالية، بروتوكول 1 تنتمي إلى الإعداد الأولي من الأجسام الشبه الكروية الورم الذي يوصف هنا باستخدام تراكب على الاغاروز ولكن يمكن أن تكون بديلا مع مجموعة متنوعة من وسائل أخرى مثل شنقا انخفاض بنسبة 40، 41 أو الثقافة الدوارة التقنيات. يصف بروتوكول 2 عملية التضمين الكروية في سقالة الكولاجين على الرغم بدلا من ذلك، يمكن أن تزرع في المختبر الأورام 3D بواسطة التغليف أو تضمين الخلايا معلق في ECM 12،15، بدلا من الأجسام الشبه الكروية غير ملتصقة واحدة شكلت من قبل. البروتوكولات اللاحقة تصف إجراءات سbtaining القياسات microrheology وقت حل من خلال الحصول على ومعالجة البيانات المجهري الفيديو، على التوالي. يوصف معالجة البيانات باستخدام MATLAB، والاستفادة من إجراءات مفتوحة المصدر لPTM مبنية على خوارزميات صفت في الأصل من قبل كروكر وجرير 42، والتي قد وضعت أيضا على نطاق واسع لمنصات البرمجيات المختلفة (انظر http://www.physics.emory.edu/ ~ أسابيع / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

وقد تبين المكروية الميكانيكية ليكون بمثابة منظم حاسمة للسلوك نمو الورم والإشارات، التي هي في حد ذاتها تشكيلها وتعديلها كجزء من مجموعة معقدة، والتفاعلات في اتجاهين mechanosensitive. في حين أن تطوير نماذج 3D بيولوجيا الورم ذات الصلة سهلت الدراسات الآلية على أثر مصفوفة الريولوجيا على نمو الورم، والمشكلة معكوس التغييرات رسم الخرائط في البيئة الميكانيكية الناجمة عن الأورام يظل تحديا. هنا، نحن تصف تنفيذ تتبع الجسيمات microrheology (PTM) بالتزامن مع نماذج 3D من سرطان البنكرياس كجزء من نهج قوية وقابلة للحياة لرصد التغيرات الجسدية طوليا في المكروية الورم، في الموقع. المنهجية الموصوفة هنا يدمج نظام إعداد نماذج 3D في المختبر جزءا لا يتجزأ من نموذج مصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالة من النوع الأول الكولاجين مع تحقيقات fluorescently المسمى موزعة بشكل متجانس لحماماتsition والقياسات microrheology تعتمد على الوقت في جميع أنحاء العينة. ومطلي الأورام في المختبر وبحث في ظروف موازية باستخدام لوحات التصوير multiwell. بالاعتماد على الأساليب المتبعة، يتم تحويل أشرطة الفيديو من الحركات التحقيق التتبع عبر علاقة المعمم ستوكس اينشتاين (GSER) تقديم تقرير مجمع تعتمد على تردد معامل القص اللزجة، G (ω) *. لأن هذا النهج هو القائم على التصوير، ويتم تعيين توصيف الميكانيكية أيضا على حقول المكانية التي تنتقل عن طريق الضوء كبيرة أن يقدم تقريرا في وقت واحد تغييرات نوعية في 3D حجم الورم والنمط الظاهري. ، يتم عرض نتائج التحقق من صحة البيانات المتناقضة ممثل تظهر استجابة الميكانيكية في المناطق الفرعية المرتبطة المترجمة الناجم عن الغزو تدهور المصفوفة وكذلك نظام المعايرة. وتعرض أيضا نتائج غير مرغوب فيها من أخطاء التجريبية المشتركة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه القضايا. ال 96 جيدا 3D شكل الطلاء ثقافة تنفيذها في هذا البروتوكول هو جonducive لارتباط القياسات microrheology مع المقايسات فحص العلاجية أو التصوير الجزيئي لاكتساب رؤى جديدة في تأثير العلاج أو المنبهات البيوكيميائية على المكروية الميكانيكية.

للتحقق من صحة G * (ω) القياسات على مواقع محلية داخل المجمع المكروية نموذج الورم، أجريت تجربتين التحقق من صحة الأولية. أولا، وسعى للتحقق من صحة القياسات لدينا ضد &quot;المعيار الذهبي&quot; من الجزء الأكبر متذبذبة القص rheometry. نحن على استعداد عينات مماثلة من الكولاجين مصف?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D.

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Views.  University of Massachusetts Boston.  تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D. 

Video: Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

تمكن صفائف الهيدروجيل من زيادة الإنتاجية لفحص تأثيرات مكونات المصفوفة والعلاجات في نماذج الأورام 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...