Agradecemos a partilha de código aberto do MATLAB código de rastreamento de partículas fornecido por Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), juntamente com o código anterior IDL e extensa documentação fornecida por John C. Crocker e Eric R. Weeks. Este trabalho foi possível graças ao financiamento do Instituto Nacional do Câncer (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

1. Esferóides Cultivar tumorais <ol><li> Misturar 10 ml de água de grau de cultura de células com 0,1 g de agarose para obter uma solução de agarose a 1%. </li><li> Solução de agarose de calor acima dos 70 ° C (cerca de 14 segundos num forno de microondas padrão ou usando uma placa de aquecimento) antes de alíquotas de 40 ul de solução de agarose a um poço numa placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 1 hora, enquanto a colheita de células utilizando técnicas padrão. </li><li> Usar um hemacitómetro para determinar a concentração de células na suspensão. </li><li> Dilui-se a suspensão de células a 1000 células / ml e adicionar 100 ul desta diluição para o poço que contém o leito de agarose curado. </li><li> Colocar a amostra num agitador durante a noite numa incubadora a 37 ° 5% de CO 2 e C. </li><li> Remova a amostra de agitador e adicionar 100 ml de meio de cultura celular. </li><li> Incubar esferóides até diâmetro desejado é atingido. Por exemplo, após 9 dias, um spHeroid será de cerca de 450 m de diâmetro. Durante este tempo, o meio de crescimento fresco pode ser adicionado aos poços de aspiração, mas deve ser evitado uma vez que isto irá resultar na remoção do esferóide. </li></ol> 2. Preparando Spheroids tumorais 3D incorporado em ECM <ol><li> Prepara-se uma estação de trabalho com materiais necessários dentro de uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Prepara-se uma mistura diluída de 1 um de diâmetro sondas marcadoras fluorescentes modificadas com carboxilato adicionando sondas banco de 2 partes (2% de sólidos) a 25 partes de água estéril. </li><li> Remover uma garrafa de 3,1 mg / ml de colágeno bovino do frigorífico e coloque-o no gelo. </li><li> Alíquota de 125 mL de colágeno em um vazio frasco de 2 ml. </li><li> Adicionar 50 ul de solução diluída de sonda traçador para o frasco contendo o colagénio e vortex brevemente para distribuir sondas. </li><li> Adicionar 235 ul de meio de cultura de células apropriado contendo vermelho de fenol (o qual vai ficar amarelo) para um volume total de 410 ml e vortex brevemente antes de retirar 205 ml (metade do volume total) e colocá-lo em um novo frasco de 2 ml. Frasco 1 conterá o esferóide de tumor e Frasco 2 será uma mistura de controlo. </li><li> Adicionar ~ 2 mL de NaOH a 1 M para o recipiente 1 para trazer novamente a solução até um pH neutro (meios de cultura contendo vermelho de fenol deve retornar a vermelho). Note-se que isto fará com que a mistura para iniciar a cura se não for mantido em gelo. Vortex brevemente para misturar, em seguida, retornar para rack de gelo imediatamente. NOTA: O esferóide é pouco visível a olho nu, após 9 dias de cultura e de sua retirada da cama de agarose é uma tarefa delicada. O uso de um microscópio de dissecção pode ser útil para alguns utilizadores. Manter a integridade do esferóide durante a transferência é primordial. </li><li> Usando uma pipeta de ponta em toda a boca, retire 40 mL de mídia do poço contendo o esferóide tumor. Guarde este 40 mL durante a realização da próxima etapa. </li><li> Verificar o poço para ver se o esferóidefoi removido no passo anterior. Se foi, adicionar 40 ul contendo o esferóide para o recipiente 1. Se não, colocar os 40 ul de volta para dentro do poço e repetir o passo anterior. </li><li> Agitar suavemente Vial 1 (não arrisque vórtex, pode danificar o esferóide) antes de transferir a mistura em 60 porções ul em três poços separados de uma placa de 96 poços. Inspeccionar cada poço com um microscópio, após a adição de mistura para determinar o que também contém o esferóide. </li><li> Adicionar ~ 2 mL de NaOH 1 M e 40 ul de meio de cultura de células para o frasco de 2 e vórtice antes aliquotamento 60 ul desta mistura a um poço vazio na placa de 96 poços e rotulagem como um controlo. </li><li> Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C para curar durante pelo menos 1 hr. </li></ol> 3. Construir Rede de Pontos de exemplo e ter um vídeo em cada ponto <ol><li> Transfira a amostra a partir da placa da incubadora para a platina do microscópio. Permita 10 minutos para que a amostra Equilibrate com a temperatura ambiente, se uma fase aquecida não está disponível. </li><li> Observar a amostra com baixas lentes objetivas movidos para ter certeza que está intacto e pronto para a imagem latente. Determinar a posição do tumor para dentro do poço. </li><li> Decida quantos pontos de amostragem para tomar. Normalmente, os 20 pontos de amostragem em cada poço, distribuídos em anéis concêntricos em torno do esferóide produzirá resultados adequadamente detalhados. </li><li> Mova o palco para cada posição desejada e usar microscópio interface de software para gravar as coordenadas xey (ou registro de coordenadas manualmente se a interface do software não estiver disponível). </li><li> Ligue o microscópio para uma lente objetiva de alta potência (tipicamente 100X) e selecione o cubo filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas traçadores. Use a lista de pontos criados no passo 3,4 para passar para o primeiro ponto na grade. </li><li> Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço, então mover-se para encontrar um campo de visão (FOV) contendo vários trac em focoer sondas. </li><li> Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e tempo de exposição para obter a maior gama dinâmica possível, assegurando que a imagem não fique saturada. </li><li> Obter uma seqüência de vídeo em uma taxa de quadros de 20-30 milissegundos por quadro (cerca de 800 quadros ou 16-24 seg de comprimento é recomendado para obter estatísticas suficientes para cálculo MSD robusto equilibrada com a necessidade de minimizar o tempo de aquisição em cada ponto de grade espacial) e salvar com uma convenção adequada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou mesa. </li><li> Repita os passos de 3,6-3,9 para cada ponto de amostra na grade. </li><li> Repita os passos 3,3-3,10 para cada poço na experiência. </li></ol> 4. Analisar dados em vídeo para Calcular Propriedades reológicas em cada ponto amostral <ol><li> Copie todos os dados de vídeo para uma pasta de análise (possivelmente em um computador diferente). </li><li> Dados de imagem importar para MATLAB ou outro software de análise. NÃOTE: vasta documentação sobre o conjunto de rotinas de monitoramento de partículas MATLAB adotadas aqui está disponível em <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Recomenda-se o uso de uma função de chamada personalizado para o processamento de múltiplos arquivos em diferentes posições automatizar. </li><li> Calibrar o software através da análise de vários frames do vídeo para determinar de forma adequada selecção e de rejeição de parâmetros (tamanho, passa-banda, etc) para a identificação de posições centrais sonda. Extensa fundo para estas etapas cruciais é descrito por Crocker e Grier. </li><li> Use o software para determinar automaticamente a cada posição da sonda para todos os quadros de vídeo e, em seguida, vincular essas posições em trajetórias. </li><li> Use os dados para calcular a trajetória quadrado médio de deslocamento (MSD) em função do tempo de atraso, sendo certo de aplicar o fator de calibração espacial adequada (mM por pixel) para a lente objetiva específica, qualquer binning pixels, etc (normalmente realizadoem meta-dados). </li><li> Calcule G * (usando a relação generalizada Stokes-Einstein levados em consideração os limites de aplicabilidade da GSER para um determinado amostra 24,28,43. Alternativamente, os usuários podem querer interpretar propriedades ECM diretamente do MSD pela simples comparação de escala lei de potência, planalto valores, índices de heterogeneidade ou de outros parâmetros. </li><li> Repita os passos 4.2 através de 4.6 para cada fov no experimento. </li><li> Co-registro de dados de posição a partir do passo 3.4 com respectivos módulos viscoelásticos em uma freqüência específica de interesse. Dependendo do fabricante do microscópio utilizado, este passo pode ser facilitada por uma rotina personalizada que lê metadados microscópio ou posição de dados podem ser tabulados manualmente. </li><li> Use funções de interpolação 3D para gerar um mapa de reologia espacial da ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste protocolo, apresentamos uma estratégia robusta e amplamente aplicável para longitudinalmente rastreamento de alterações locais na ECM rigidez em modelos de tumores em 3D. Nós prevemos que esta metodologia poderia ser adotada por biólogos câncer e biofísicos interessadas em comportamento mechanosensitive implicados na remodelação da matriz durante o crescimento de tumores e processos de invasão. A quantificação precisa da cinética de degradação da matriz poderia ser particularmente útil para aquele...

Fica claro a partir de um crescente corpo de evidências na literatura de que as células cancerosas, como acontece com as células epiteliais de mamíferos não-malignas, são altamente sensíveis às propriedades mecânicas e biofísicos da matriz extracelular circundante (ECM) e outros componentes do microambiente 1-9. Estudos sobre os mecanismos elegantes forneceram insights sobre o papel da rigidez extracelular como um parceiro de sinalização mechanosensitive complexo que regula o comportamento crescimento maligno e morfogênese 2,3,10,11. Este trabalho foi facilitado, em especial, pelo desenvolvimento de 3D ​​em modelos tumorais in vitro que restauram biologicamente arquitectura dos tecidos relevantes e podem ser cultivadas em materiais de andaime com mecânicos ajustáveis ​​e fotografada por microscopia óptica 12-19. No entanto, o outro lado dessa caixa de diálogo mechanoregulatory entre tumor e microambiente, através do qual as células cancerosas, por sua vez alterar a reologia de seu entorno, permanece um tantomais difíceis de estudar. Por exemplo, durante os processos de invasão, as células na periferia do tumor podem sofrer epitelial para mesenquimal (EMT) e aumentar a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs), que provocam a degradação do local ECM 20-22, que por sua vez influenciam o comportamento de crescimento de mechanosensitive outras células tumorais proximais. Através de uma variedade de processos bioquímicos, células cancerosas discar continuamente a rigidez local do seu meio ambiente para cima e para baixo para se adequar a diferentes processos em momentos diferentes. A metodologia descrita aqui é motivado pela necessidade de ferramentas analíticas que relatam alterações locais na rigidez e conformidade do ECM durante o crescimento, que podem ser integrados com modelos de tumor 3D e correlatos longitudinalmente com alterações bioquímicas e fenotípicas sem terminar a cultura. Em busca de uma técnica adequada para implementar neste contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) emerge como um forte candidato.Este método, foi pioneira originalmente por Mason e Weitz 23,24, usa o movimento de sondas de rastreamento incorporado em um fluido complexo para relatar o complexo módulo dependente da freqüência viscoelástico de cisalhamento, G * (ω) em escalas de comprimento micro. Esta abordagem geral foi desenvolvido com múltiplas variações adequadas para diferentes aplicações em soft-Matéria Condensada, colóides, biofísica e física polímero 25-31. PTM tem certas vantagens em relação a outros métodos, uma vez que as leituras da viscoelasticidade local são fornecidos pela imagem de vídeo não-destrutiva das sondas marcadoras bioquimicamente inactivos que são incorporados no momento da preparação da cultura e permanecem no lugar durante longos períodos de crescimento. Isto está em contraste com as medições padrão de ouro com um reómetro de cisalhamento oscilatório a granel, o que requer, necessariamente, de terminação da cultura e relata a reologia macroscópica volume da amostra, em vez de medições pontuais dentro do tumor microenvir 3D complexoente. De fato, vários estudos têm ilustrado a utilidade de interpretar as medições dos movimentos da sonda tracer ou em torno de células de câncer ou não câncer de medir deformações associadas com a migração de células 32, estresse mecânico induzido por um esferóide expansão 33, reologia intracelular 34,35, e mapear tensões mecânicas e deformações em tecidos artificiais 36, e relação entre o tamanho dos poros e velocidade invasão 37. Outras técnicas adequadas para microrheology, como a microscopia de força atômica (AFM) pode ser implementado, mas principalmente para os pontos de sondagem na superfície da amostra e também podem representar problemas de esterilidade da cultura que complicam medições longitudinais 38. Aqui, nós descrevemos um protocolo abrangente que inclua métodos para o crescimento do tumor de esferóides 3D aptos a serem transferidos em ECM com sondas fluorescentes embutidas para vídeo partícula de rastreamento e análise de métodos para o mapeamento confiável espacialmudanças na microrheology mais tempo em cultura. Na presente implementação, modelos de tumores em 3D são cultivadas em formato de vários poços com vistas à incorporação de medidas microrheology com outros ensaios tradicionais (por exemplo, de citotoxicidade), que este formato é propício para. Nesta ilustração representativa de essa metodologia de cultura in vitro esferóides 3D utilizando PANC-1 de células, de uma linha celular de cancro pancreático estabelecido conhecido para formar esferóides 39, mas todas as medições aqui descritas são amplamente aplicável ao estudo de tumores sólidos utilizando uma variedade de linhas celulares adequado para cultura 3D. Como esse método é baseado em imagem latente inerentemente é ideal para co-registro de dados microrheology de alta resolução com grandes campos de luz transmitida de vista que relatam alterações no crescimento celular, migração e fenótipo. A implementação da PTM integrado com microscopia de luz transmitida desta forma assume posicionamento reprodutível dos wh estágio do microscópioich está normalmente disponível em epifluorescência widefield comercial microscópios biológicos motorizados. O protocolo desenvolvido abaixo pode ser implementado com qualquer fluorescência automatizada microscópio biológico a equipados. Este é um método intensivo de dados inerente, o que exige a aquisição de gigabytes de dados de microscopia de vídeo digitais para processamento offline. No seguinte protocolo, Protocolo 1 refere-se a uma preparação inicial de esferóides de tumor que é descrito aqui, utilizando sobreposição de agarose, mas podem ser substituídos com uma variedade de outros métodos, tais como a gota em suspensão 40, ou cultura rotativa 41 técnicas. Protocolo 2 descreve o processo de incorporação de esferóides de um andaime do colagénio embora alternativamente, in vitro tumores 3D pode ser cultivada por encapsulação ou a incorporação de células ressuspensas em ECM 12,15, em vez de simples esferóides não aderentes pré-formados. Protocolos subsequentes descrevem os procedimentos para obtaining medições microrheology resolvida no tempo através da aquisição e processamento de dados de microscopia de vídeo, respectivamente. O processamento de dados é descrito usando MATLAB, fazendo uso de rotinas de código aberto para a PTM construído em algoritmos originalmente descritos por Crocker e Grier 42, que também foram amplamente desenvolvidos para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semanas / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

O microambiente mecânica tenha sido mostrado que actua como um regulador essencial do comportamento de crescimento tumoral e a sinalização, que é em si remodelada e modificada como parte de um conjunto de interacções, bidireccional mechanosensitive complexos. Enquanto o desenvolvimento de modelos de tumor 3D biologicamente relevantes tenham facilitado os estudos mecanísticos sobre o impacto da reologia da matriz sobre o crescimento do tumor, o problema inverso de alterações de mapeamento do ambiente mecânica induzida por tumores permanece um desafio. Aqui, descrevemos a implementação de rastreamento de partículas microrheology (PTM), em conjunto com modelos 3D de câncer de pâncreas, como parte de uma abordagem robusta e viável para monitorar longitudinalmente mudanças físicas no microambiente tumoral, in situ. Esta metodologia integra um sistema de preparação in vitro modelos 3D incorporados em uma matriz extracelular modelo (ECM) andaime de colágeno tipo I com sondas marcadas com fluorescência distribuída uniformemente para pomedições microrheology dependentes do tempo em todo o espécime ção-e. in vitro tumores são banhados e sondado em condições paralelas usando placas de imagem multipoços. Baseando-se em métodos estabelecidos, vídeos de movimentos sonda traçadores são transformados através da Relação Generalizada Stokes Einstein (GSER) para relatar o módulo de cisalhamento complexo viscoelástico dependente da freqüência, G * (ω). Como essa abordagem é baseada em imagem, caracterização mecânica também é mapeado sobre grandes campos espaciais de luz transmitida simultaneamente para relatar mudanças qualitativas no tamanho e fenótipo tumoral 3D. Os resultados representativos mostrando contrastante resposta mecânica em sub-regiões associadas com a degradação da matriz localizada induzida por invasão, bem como a calibração do sistema, dados de validação são apresentados. Também são apresentados os resultados indesejáveis ​​de erros experimentais comuns e solução de problemas dessas questões. O formato cultura chapeamento 3D de 96 poços implementado neste protocolo é conducive a correlação de medições microrheology com testes de rastreio terapêuticos ou de imagem molecular para ganhar novos insights sobre o impacto de tratamentos ou estímulos bioquímicos no microambiente mecânica.

Para verificar a validade do G * (ω) medições em posições localizadas dentro de um microambiente do tumor modelo complexo, dois experimentos de validação iniciais foram realizados. Em primeiro lugar, procurou-se validar nossas medidas contra o &quot;padrão ouro&quot; de reometria de cisalhamento oscilatório granel. Foram preparadas amostras idênticas de matriz de colagénio (sem células) a uma concentração de colagénio de 1,0 mg / ml. Estas amostras foram sondadas com um reómetro de massa (TA Ins...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K visualizações.  University of Massachusetts Boston.  -Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D. 