אנו בתודה להכיר שיתוף הקוד הפתוח של קוד מעקב של חלקיק MATLAB הניתן על ידי מריה Kilfoil <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">(http://people.umass.edu/kilfoil/),</a> יחד עם הקוד קודם לכן IDL ותיעוד מקיף הניתן על ידי ג &#39;ון ג קרוקר ואריק שבועות ר &#39;. עבודה זו התאפשרה על ידי מימון מהמכון הלאומי לסרטן (NCI / NIH), K99CA155045 וR00CA155045 (PI: JPC).

1. Spheroids גידול Culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 מיליליטר של מים כיתה תרבית תאים עם 0.1 גרם של agarose כדי להשיג פתרון agarose 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון agarose חום לעיל 70 מעלות צלזיוס (בערך 14 שניות במיקרוגל רגיל או באמצעות צלחת חימום) לפני aliquoting 40 μl של פתרון agarose לתוך באר בצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 ואילו קצירת תאים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hemacytometer כדי לקבוע את הריכוז של תאים בתרחיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל השעיה תא ל1,000 תאים / מיליליטר ולהוסיף דילול זה 100 μl הלמכיל גם מיטת agarose נרפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על שייקר לילה בחממה שנקבעה על 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם מייקר ולהוסיף של תקשורת בתרבות תא 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הספרואידים עד לקוטר רצוי. לדוגמא, לאחר 9 ימים, spheroid יהיה כ 450 מיקרומטר קוטר. במהלך תקופה זו, תקשורת צמיחה טרי ניתן להוסיף לבארות, אך יש להימנע משאיפה שכן זה יגרום להסרה של אליפטית. </li></ol> 2. הכנת spheroids גידול 3D המשובץ בECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תחנת עבודה עם חומרים הדרושים בתוך הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מדוללת של 1 מיקרומטר בדיקות נותב-הותאם carboxylate קוטר ניאון על ידי הוספת בדיקות מניית 2 חלקים (מוצקי 2%) ל25 חלקי מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוק 3.1 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן שור מהמקרר ומניח אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 125 μl של קולגן לתוך בקבוקון 2 מיליליטר ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול פתרון בדיקה נותב לבקבוקון המכיל קולגן ובקצרה מערבולת להפיץ בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 235 μl של תקשורת בתרבות התא המתאימה המכילה פנול אדום (שיצהיב) עבור נפח כולל של 410 מ&quot;ל ובקצרה מערבולת לפני הסרת 205 מיליליטר (חצי מהנפח הכולל) ולמקם אותו בבקבוקון מיליליטר 2 חדש. 1 הבקבוקון יכיל אליפטית הגידול והבקבוקון 2 יהיה תערובת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 2 μl של 1 M NaOH לבקבוקון 1 להביא את הפתרון בחזרה לpH הניטרלי (תקשורת ותרבות המכילה פנול אדום צריכה לחזור לאדום). שים לב שזה יגרום לתערובת כדי להתחיל בריפוי אם היא לא שמרה על קרח. בקצרה מערבולת לערבב, ולאחר מכן לחזור למדף קרח באופן מיידי. הערה: אליפטית הוא בקושי נראה לעין בלתי מזוינת, לאחר 9 ימים של התרבות והסרתה מהמיטה agarose היא משימה עדינה. שימוש במיקרוסקופ לנתיחה עשוי להיות מועיל עבור חלק מהמשתמשים. השמירה על שלמות אליפטית במהלך ההעברה היא בעל חשיבות עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה קצה רחב פה, בעדינות להסיר 40 μl של מדיה מן הבאר מכילה אליפטית הגידול. לשמור על זה 40 μl בעת ביצוע השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו היטב כדי לראות אם אליפטיתהוסר בשלב הקודם. אם זה היה, להוסיף μl 40 מכיל אליפטית לבקבוקון 1. אם לא, מקום 40 μl חזרה אל תוך הבאר וחזור על השלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבב 1 יאל (לא להסתכן vortexing, זה עלול לגרום נזק לאליפטית) לפני העברת התערובת ב60 מנות μl לשלוש בארות נפרדות מצלחת 96 היטב. בדוק היטב כל אחד עם מיקרוסקופ לאחר הוספת תערובת כדי לקבוע שגם מכיל את אליפטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 2 μl 1 M NaOH ו40 μl של תקשורת בתרבות תא לבקבוקון 2 מערבולת לפני aliquotting 60 μl של תערובת זו לריקה גם בצלחת 96 היטב ותיוג כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת באינקובטור 37 C ° לרפא במשך שעה לפחות 1. </li></ol> 3. לבנות רשת של נקודות לדוגמא וקח את וידאו בכל נקודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחת המדגם מן החממה לבמה מיקרוסקופ. לאפשר 10 דקות למדגם לequilibrate עם טמפרטורת החדר אם במה מחוממת אינה זמינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדוגמא עם עדשות אובייקטיביות המופעלים נמוכות כדי לוודא שהוא שלם ומוכן להדמיה. לקבוע את מיקום הגידול בתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחליט כמה נקודות מדגם לקחת. בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל טוב, שהופצו בטבעות קונצנטריות סביב אליפטית תפיק תוצאות מספקת מפורטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את הבמה לכל מיקום רצוי ולהשתמש בתוכנת מיקרוסקופ התממשקות כדי להקליט את קואורדינטות x ו-y (או רשומת קואורדינטות באופן ידני אם ממשק תוכנה אינו זמין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את המיקרוסקופ לעדשה גבוהה מופעל על מטרה (בדרך כלל 100X), ובחר את קוביית המסנן המתאימה לגל העירור של בדיקות המעקב. השתמש ברשימה של נקודות שנוצרו בשלב 3.4 כדי לעבור לנקודה הראשונה ברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר, ולאחר מכן להעביר עד למצוא שדה הראייה (FOV) המכיל כמה טראק בפוקוסאה בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב להיסטוגרמה האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת החשיפה וזמן לתת הטווח הדינמי הגדול ביותר אפשרי, תוך הבטחה כי התמונה אינה הופכת להיות רווי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20-30 אלפיות שני לכל מסגרת (כ 800 מסגרות או 16-24 שניות באורך מומלץ לספק סטטיסטיקות מספיקות לחישוב MSD חזק מאוזנת עם צורך מזעור זמן רכישה בכל נקודת רשת מרחבית) ולשמור עם אמנה מתאימה. במהלך ההקלטה, אל תיגעו מיקרוסקופ או שולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.6-3.9 עבור כל נקודת דגימה ברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.3-3.10 לכל אחד גם בניסוי. </li></ol> 4. לנתח וידאו נתונים כדי לחשב מאפייני Rheological בכל נקודה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את כל נתוני וידאו לתיקיית ניתוח (אולי במחשב אחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יבוא תמונה לתוך MATLAB או תוכנות ניתוח אחרות. איןTE: תיעוד נרחב לגבי הסט של רוטינות מעקב אחר חלקיקי MATLAB אימצו כאן הוא זמין <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">בhttp://people.umass.edu/kilfoil.</a> השימוש בפונקציה קוראת מותאם אישית לאוטומציה עיבוד של מספר קבצים בעמדות שונות מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את התוכנה על ידי ניתוח מספר פריימים של וידאו כדי לקבוע כראוי פרמטרים בחירה ודחייה (גודל, bandpass, וכו &#39;) לזיהוי עמדות מרכז בדיקה. רקע נרחב לצעדים חיוניים אלה מתואר על ידי קרוקר וגריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי כל עמדת בדיקה לכל מסגרות הווידאו ולאחר מכן לקשר את העמדות הללו למסלולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) כפונקציה של זמן השהיה, להיות בטוח כדי להחיל את גורם כיול המרחבי המתאים (מיקרומטר לפיקסל) לעדשה הספציפית האובייקטיבית, כל binning פיקסל, וכו &#39;(שבוצע בדרך כללבmeta-data). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב * G (באמצעות ביחס סטוקס איינשטיין הכללי לקחו בחשבון את גבולות תחולתה של GSER למדגם מסוים 24,28,43. לחלופין, משתמשים עשויים לרצות לפרש מאפייני ECM ישירות מMSD פשוט על ידי ההשוואה דרוג חוק החשמל, מישור ערכים, מדדים של הטרוגניות או פרמטרים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2 דרך 4.6 עבור כל שדה ראייה בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף לרשום נתוני מיקום מצעד 3.4 עם modulii viscoelastic בתדר מסוים של עניין. בהתאם ליצרן של המיקרוסקופ בשימוש, ניתן להקל שלב זה על ידי שגרה מותאמת אישית אשר קוראת metadata מיקרוסקופ או עמדה ניתן נספרו הנתונים באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציות אינטרפולציה 3D כדי ליצור מפת rheology המרחבי של ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בפרוטוקול זה אנו מציגים אסטרטגיה חזקה וישימה באופן נרחב לאורכי מעקב אחר שינויים מקומיים בקשיחות ECM במודלי גידול 3D. אנחנו מדמיינים שמתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת על ידי ביולוגים בסרטן וBiophysicists מתעניינים בהתנהגות mechanosensitive מעורבת בשיפוץ מטריקס במהלך גידול ותהליכי ...

זה ברור מגוף הולך וגדל של ראיות בספרות שתאי הסרטן, כמו בתאי האפיתל של יונקים שאינם ממאירים, הם רגישים מאוד לתכונות מכאניות וbiophysical של מטריקס סביב תאי (ECM) ורכיבי המיקרו אחרים 1-9. מחקרים מכניסטית אלגנטיים סיפקו תובנות לתוך התפקיד של קשיחות תאית כשותף איתות mechanosensitive מורכב המווסת את ההתנהגות ממארת צמיחה והמורפוגנזה 2,3,10,11. עבודה זו כבר בהנחייתם בפרט על ידי הפיתוח של 3D במודלי גידול מבחנה שלשחזר ביולוגי ארכיטקטורת רקמה רלוונטית וניתן לגדל בחומרי פיגום עם מכניקה מתכונן וצלמו ידי מיקרוסקופיה אופטית 12-19. עם זאת, הצד השני של הדו שיח הזה בין mechanoregulatory גידול והמיקרו, שדרכו תאי הסרטן בתורו לשנות את rheology של סביבתם האחר, נותר במידה מסוימתקשה יותר ללמוד. לדוגמא, במהלך תהליכי פלישה, תאים בפריפריה של גידול עשויים לעבור אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) ולהגדיל את הביטוי של metalloproteases המטריצה ​​(MMPs) שגורמים להשפלה מקומית של 20-22 ECM, אשר בתורו משפיע mechanosensitive צמיחת התנהגות של תאים סרטניים הפרוקסימלי אחרים. באמצעות מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים, תאים סרטניים לחייג הרף הקשיחות המקומית של הסביבה שלהם למעלה ולמטה כדי להתאים את התהליכים שונים בזמנים שונים. המתודולוגיה שתוארה כאן היא מונעת על ידי הצורך בכלים אנליטיים הלדווח על שינויים מקומיים בנוקשות והציות של ECM בצמיחה, שיכול להיות משולב עם מודלים גידול 3D וקורלציה אורכים עם שינויים ביוכימיים ופנוטיפי ללא הפסקת התרבות. בחיפוש טכניקה מתאימה ליישום בהקשר זה, microrheology חלקיקי המעקב (PTM) מתגלה כמועמד חזק.בשיטה זו, הייתה חלוצה במקור על ידי מייסון וייץ 23,24, משתמש בתנועה של בדיקות מעקב מוטבעות בנוזל מורכב לדווח מודולוס התדירות תלויה מורכב הגזירה viscoelastic, G * (ω) בקני מידת אורך מיקרון. גישה כללית זו פותחה עם וריאציות מרובות מתאימות ליישומים שונים בעניין, קולואידים, ביופיסיקה-מרוכז רכה ופיסיקה פולימר 25-31. יש PTM יתרונות מסוימים ביחס לשיטות אחרות, שכן מונה המציין viscoelasticity המקומי מסופק על ידי וידאו הדמיה שאינה הרסנית של בדיקות מעקב ביוכימית פעילה המשולבות בעת הכנת התרבות ולהישאר במקום לאורך תקופות ממושכות של צמיחה. זאת בניגוד למדידות תקן זהב עם rheometer oscillatory גזירה בתפזורת, שבהכרח דורש הפסקת התרבות ומדווח rheology מקרוסקופית התפזורת של המדגם ולא מדידות נקודה בתוך microenvir גידול 3D המורכבonment. ואכן מספר מחקרים הדגימו את התועלת של פרשנות מדידות של תנועות חללית נותב או סביב תאים סרטניים או שאינו סרטניים למדוד עיוותים הקשורים לתא הגירה 32, לחץ מכאני הנגרם על ידי אליפטית הרחבת 33, rheology תאיים 34,35, ו למפה לחצים מכאניים וזנים ברקמות מהונדסות 36, ויחס בין גודל הנקבובית ומהירות פלישת 37. טכניקות אחרות מתאימות לmicrorheology, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן ליישם, אבל בעיקר לחיטוט נקודות במדגם השטח וגם עלולות להוות בעיות עקרות התרבות שתסבכנה מדידות אורך 38. כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף הכולל שיטות לצמיחה של הספרואידים גידול 3D מתאימים להעברה לECM עם בדיקות ניאון משובצות לשיטות וידאו חלקיקי מעקב וניתוח לאופן מהימן מיפוי מרחבישינויים בmicrorheology לאורך זמן בתרבות. ביישום הנוכחי, מודלים 3D גידול גדלים בפורמט multiwell עם נוף לכיוון שילוב של מדידות microrheology עם מבחני אחרים מסורתיים (למשל, cytotoxicity) שהפורמט הזה הוא תורם ל. באיור נציג זה של במבחנה הספרואידים זה אנו המתודולוגיה תרבות 3D באמצעות PANC-1 תאים, שורת תאי סרטן לבלב הוקמה הידועה כדי ליצור הספרואידים 39, אבל כל המדידות שתוארו במסמך זה הן החלים רחב ללמוד בגידולים מוצקים תוך שימוש במגוון של שורות תאים מתאים לתרבות 3D. מכיוון שהוא מבוססת הדמיה בשיטה זו המיסוד הוא אידיאלי לשיתוף רישום של נתונים microrheology ברזולוציה גבוהה עם שדות מועברים האור גדולים של דעה כי לדווח על שינויים בצמיחת תאים, הגירה ופנוטיפ. יישום PTM משולב עם מיקרוסקופ אור להעביר בדרך זו מניחה מיצוב לשחזור של Wh הבמה מיקרוסקופich הוא בדרך כלל זמין במיקרוסקופים ביולוגיים epifluorescence widefield המסחרי ממונעים. הפרוטוקול שפותח בהמשך יכול להיות מיושם עם כל מיקרוסקופ ביולוגי הקרינה אוטומטית מצויד באופן סביר. זוהי שיטה עתירת נתונים מיסודו, שדורשת רכישה של ג&#39;יגה בייט של נתונים במיקרוסקופ וידאו דיגיטליים לעיבוד מקוון. בפרוטוקול הבא, פרוטוקול 1 נוגע להכנה הראשונית של הספרואידים גידול אשר מתואר כאן על ידי שימוש בכיסוי agarose אבל יכול להיות תחליף עם מגוון רחב של שיטות אחרות כגון ירידה תלויה 40, או תרבות סיבובית 41 טכניקות. פרוטוקול 2 מתאר את התהליך של הטבעת הספרואידים בפיגום קולגן אם כי לחלופין, במבחנה גידולי 3D יכולים להיות גדלו באנקפסולציה או הטבעה של תאי resuspended בECM 12,15, ולא הספרואידים אינם חסיד מראש יצרו אחת. הפרוטוקולים הבאים מתארים נהלים לobtaining מדידות microrheology זמן נפתר על ידי הרכישה ועיבוד של נתונים במיקרוסקופ וידאו, בהתאמה. עיבוד נתונים מתואר באמצעות MATLAB, מה שהופך את השימוש בגרות קוד פתוח לPTM הבנוי על אלגוריתמים שתוארו במקור על ידי קרוקר וגריר 42, שיש גם פותחו בהרחבה לפלטפורמות תוכנה שונות (ראה http://www.physics.emory.edu/ ~ שבועות / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Microenvironment המכני הוכח לפעול כרגולטור חיוני של גידול בצמיחת התנהגות ואיתות, אשר עצמו שופץ והותאם כחלק מסדרה של יחסי גומלין מורכבים, דו כיוונית mechanosensitive. בעוד שהפיתוח של מודלים 3D גידול ביולוגי רלוונטיים הקל מחקרים מכניסטית על ההשפעה של rheology מטריצה ​​על צמיחת גידול, הבעיה ההפוכה של שינויי מיפוי בסביבה מכאנית הנגרמת על ידי גידולים נותרת מאתגרת. כאן, אנו מתארים את יישום microrheology מעקב חלקיקים (PTM) בשילוב עם מודלים 3D של סרטן לבלב כחלק מגישה חזקה וברת קיימא עבור אורכי ניטור שינויים פיזיים בmicroenvironment הגידול, באתרם. המתודולוגיה שתוארה כאן משלבת מערכת של הכנה במבחנה המודלים 3D המשובץ במטריצה ​​תאית מודל פיגום (ECM) של סוג קולגן אני עם בדיקות שכותרתו fluorescently מפוזרות באופן אחיד לפוsition ומדידות microrheology תלוי זמן לאורך כל הדגימה. במבחנה גידולים הם מצופים ונחקרו בתנאים מקבילים באמצעות צלחות הדמיה multiwell. ציור על שיטות מבוססות, קטעי וידאו של תנועות חללית נותב הופכים באמצעות היחס כלליים סטוקס איינשטיין (GSER) לדווח מודולוס מורכב התדירות תלויה הגזירה viscoelastic, G (ω) *. מכיוון שגישה זו היא מבוסס הדמיה, אפיון מכאני ממופה גם הוא על שדות המרחבית מועבר אור גדולים לדווח בו זמנית שינויים איכותיים בגודל גידול 3D ופנוטיפ. נציג תוצאות מראים מנוגד תגובה מכאנית בתת אזורים הקשורים בשפלה מקומית-Induced פלישת מטריקס, כמו גם כיול מערכת, אימות נתונים מוצגים. תוצאות בלתי רצויות מטעויות ניסיוניות נפוצות ופתרון בעיות בנושאים אלה גם מוצגות. פורמט ציפוי תרבות 96 היטב 3D מיושם בפרוטוקול זה הוא גonducive למתאם של מדידות microrheology עם מבחני מיון טיפוליים או הדמיה מולקולרית כדי לקבל תובנות חדשות על השפעה של טיפולים או גירויים ביוכימיים בmicroenvironment המכני.

כדי לוודא את תוקפו של G * מדידות (ω) בעמדות מקומיות בתוך microenvironment גידול מודל מורכב, שני ניסויי אימות ראשוניים בוצעו. ראשית, אנו ביקשנו לאמת את המדידות שלנו נגד &quot;תקן הזהב&quot; של rheometry הגזירה תנודתית בתפזורת. הכנו דגימות זהות של מטריצת הקולגן (ללא תאים) בריכוז ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Views.  University of Massachusetts Boston.  microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D. 

Video: Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...