Biz minnetle (Maria Kilfoil tarafından sağlanan MATLAB partikül izleme kodu açık kaynak paylaşımını kabul <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), John C. Crocker ve Eric tarafından sağlanan erken IDL kodu ve kapsamlı belgeler ile birlikte R. Weeks. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI / NIH), K99CA155045 ve R00CA155045 (: JPC PI) fon tarafından mümkün olmuştur.

1.. Kültürleme Tümör küremsileri <ol><li> Bir% 1 agaroz çözelti elde etmek için 0.1 g agaroz ile hücre kültürü dereceli su 10 ml karıştırın. </li><li> 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir kuyuya agaroz çözeltisi 40 ul aliquoting önce 70 ° C&#39;nin üzerinde (standart mikrodalga ya da bir ısıtma plakası kullanılarak yaklaşık 14 saniye) için ısı agaroz çözüm. </li><li> Standart teknikler kullanılarak hücreler hasat sırasında en az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek için bir hemasitometre kullanarak. </li><li> 1000 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltilir ve de tedavi agaroz yatak içeren, bu seyreltme 100 ul ilave edin. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de ayarlanan bir inkübatör içinde gece boyunca bir karıştırıcıda örnek yerleştirin. </li><li> Çalkalayıcı dan bir numune alın ve hücre kültür ortamı içinde 100 ul ilave edin. </li><li> İstenen çapı ulaşılana kadar küremsilerin inkübe edin. Örneğin, sonra 9 gün, spheroid çap olarak yaklaşık 450 mikron olacaktır. Bu süre boyunca, taze büyüme ortamı, oyuklara ilave edilebilir, ancak bu, sfero çıkarılmasıyla neden olacaktır çünkü aspirasyon kaçınılmalıdır. </li></ol> 2.. ECM Gömülü 3D Tümör sferoidler hazırlanıyor <ol><li> Laminar akış içinde gerekli malzemeleri ile bir iş istasyonu hazırlayın. </li><li> 25 parça steril su ile 2 kısım stok sondalar (% 2 katı) ekleyerek karboksilat-modifiye 1 mikron çapında floresan probları tracer seyreltilmiş bir karışım hazırlayın. </li><li> Buzdolabından 3.1 mg / ml sığır kollajeni bir şişe kaldırma ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Kısım 125, boş bir şişe içine 2 ml kolajen ul. </li><li> Probları dağıtmak için kısaca kolajen ve vorteks içeren şişeye seyreltilmiş tracer sondası çözeltisinin 50 ul ekle. </li><li> Uygun hücre kültür ortamı 41 toplam hacim fenol kırmızı (ki sarı dönecek) içeren 235 ul ekleyinKısaca 205 ml (yarım toplam hacim) kaldırılması ve yeni bir 2 ml&#39;lik cam şişede yerleştirmeden önce 0 ml ve vorteks. Vial 1 tümör sfero içerir ve Vial 2, bir kontrol karışımı olacaktır. </li><li> Nötr pH (fenol kırmızısı içeren kültür ortamı kırmızı dönmelidir) geri çözüm getirmek için 1 flakon 1 M NaOH ~ 2 ul ekleyin. Bu karışım, buz üzerinde tutulur değilse kür başlamak neden olacağını not edin. Karıştırmak için vorteks kısaca, sonra hemen buz rafa dönmek. NOT: sfero kültür ve agaroz yataktan çıkartılmasını 9 gün sonra hassas bir iştir çıplak gözle zorlukla görülebilir. Diseksiyon mikroskop kullanımı, bazı kullanıcılar için yararlı olabilir. Transfer sırasında sfero bütünlüğünü korumak önemlidir. </li><li> Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, yavaşça de tümör sfero ihtiva eden ikinci medya 40 ul çıkarın. Sonraki adımı yürütürken bu 40 ul saklayın. </li><li> Görmek için kuyu kontrol edin spheroidÖnceki adımda çıkarıldı. Eğer öyle olsaydı, 1 flakon için sfero içeren 40 ul ekleyin. Değilse, geri kuyuya 40 ul yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın. </li><li> Yavaşça, 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı oyuklarına 60 ul kısımlar halinde karışımın aktarmadan önce (bu küremsi zarar verebilir, vorteks riski yoktur) Vial 1 karıştırın. Iyi küremsi içeren belirlemek için karışımın ilave edildikten sonra bir mikroskop ile de, her kontrol edin. </li><li> Ekle ~ 2 ul 1 M NaOH ve 40 Vial 2 hücre kültür ortamı ul ve bir kontrol olarak 96 oyuklu plaka ve etiketleme iyi boş bu karışım 60 ul aliquotting önce girdap. </li><li> En az 1 saat boyunca tedavi etmek için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li></ol> 3.. Örnek Noktalar Izgara Construct ve her noktada bir video atın <ol><li> Mikroskop sahneye inkübatör örnek plaka aktarın. Numune için 10 dakika Equil izin verısıtılmış bir sahne mevcut değilse, oda sıcaklığı ile ibrate. </li><li> Emin sağlam ve görüntüleme için hazır hale getirmek için düşük güçlü objektifler ile örnek gözlemlemek. Kuyunun içindeki tümör konumunu belirler. </li><li> Almak için kaç puan örnek karar verin. Tipik olarak, sfero etrafında konsantrik halkalar dağıtılan her kuyuda 20 numune noktaları, yeterince ayrıntılı sonuçlar üretecektir. </li><li> Her istenen pozisyona sahne taşımak ve x ve y koordinatları (veya yazılımı arayüzü kullanılamıyor ise rekor elle koordinatları) kaydetmek için mikroskop arayüz yazılımı kullanın. </li><li> Yüksek enerjili objektif lens (genellikle 100X) için mikroskop geçin ve izleyici probları uyarma dalga boyu için uygun filtre küpü seçin. Kılavuzdaki ilk noktaya taşımak için adım 3.4 oluşturulan noktaların listesini kullanın. </li><li> Kuyunun dibini bulmak için odağı ayarlayın, sonra (FOV) birkaç odakta trac içeren bir görüş alanına bulmak için yukarı taşımaksondalar er. </li><li> Yoğunluk histogram gözlemlemek ve görüntü doymuş hale gelmez sağlarken en dinamik aralığı vermek için mümkün maruz kalma yoğunluğu ve zaman ayarlayın. </li><li> Kare başına 20-30 msn bir kare hızında video dizisini elde (yaklaşık 800 kare veya uzunluğu 16-24 sn her uzamsal ızgara noktada toplama süresini en aza indirmek için ihtiyacı ile dengeli sağlam MSD hesaplanması için yeterli istatistik sağlamak için tavsiye edilir) ve uygun bir kongre ile kaydedin. Kayıt sırasında, mikroskop veya tabloyu dokunmayın. </li><li> Tekrar Kılavuzdaki her numune noktası için 3,6-3,9 adımları. </li><li> Tekrar deneyde her bir kuyu için 3,3-3,10 adımları. </li></ol> 4. Her örnek Noktasında Reolojik Properties hesapla Video Veri Analiz <ol><li> (Belki farklı bir bilgisayarda) bir analiz klasöre tüm video verilerini kopyalayın. </li><li> MATLAB içine ithal görüntü verileri ya da diğer analiz yazılımı. HAYIRTE: Burada benimsenen MATLAB parçacık izleme rutinleri kümesi ilişkin kapsamlı belgeler mevcuttur <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Farklı pozisyonlarda birden fazla dosya işleme otomasyonu için özel bir arama işlevinin kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Uygun prob merkezi pozisyonları belirlenmesi için seçme ve reddetme parametreleri (boy, bant geçiren, vb) belirlemek için videonun çeşitli karelerini analiz ederek yazılımı kalibre. Bu önemli adımlar için kapsamlı plan Crocker ve Grier tarafından açıklanmıştır. </li><li> Otomatik olarak tüm video karelerinin her sonda konumunu belirlemek ve daha sonra yörüngeleri içine bu pozisyonları bağlantı yazılımını kullanın. </li><li> Vb özel objektif lens, herhangi bir piksel binning için uygun mekansal kalibrasyon faktörü (piksel başına mikron) uygulamak için emin olmak, gecikme zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirmesini (MSD) hesaplamak için yörünge verileri kullanarak (genellikle taşınanmeta-veri). </li><li> Belirli bir numune 24,28,43 için GSER uygulanabilirlik sınırları. Alternatif olarak, kullanıcıları sadece güç kanunu ölçekleme, plato karşılaştırarak MSD doğrudan ECM özelliklerini yorumlamak isteyebilirsiniz dikkate alınır genelleştirilmiş Stokes-Einstein ilişkisini kullanarak G * (hesaplayın heterojenlik ve diğer parametrelerin değerleri, endeksleri. </li><li> Tekrar deneyde her FOV için 4,6 ile 4,2 adım. </li><li> Ilgi belirli bir frekansta viskoelastik modül kullanılmasına ile adım 3.4 konum verilerini co-kayıt. Kullanılan mikroskop üreticisine bağlı olarak, bu adım mikroskop meta veya konumunu veri elle tablo olabilir okur özel bir rutin kolaylaştırılabilir. </li><li> ECM bir mekansal reolojisi harita oluşturmak için 3D interpolasyon fonksiyonları kullanın. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokolde boylamasına 3D tümör modelleri ECM katılık yerel değişiklikleri izleme için güçlü ve yaygın olarak uygulanabilir bir strateji tanıtmak. Bu metodoloji, tümör büyümesi ve işgali süreçlerinde matris yeniden karıştığı mechanosensitive davranış ilgilenen kanser biyologlar ve fizikçinin tarafından kabul edilebileceğini öngörülüyor. Matris bozulması kinetiği kesin miktar, doğrudan matris yeniden bağlantılıdır 3B tümör modellerinde matris metaloproteazların, lisil oksida...

Bu, kanser hücreleri, habis olmayan memeli epitel hücreleri ile olduğu gibi, çevreleyen hücre dışı matrisin (ECM) ve diğer mikro-ortam bileşenleri 1-9 mekanik ve biyofiziksel özelliklerini son derece duyarlı olduğu literatürde kanıtlar giderek artan bir gövdeden açıktır. Zarif mekanik çalışmalar malign büyüme davranışı ve morfogenetiğine 2,3,10,11 düzenleyen karmaşık bir mechanosensitive sinyal ortağı olarak hücre dışı sertlik rolüne anlayışlar sağladı. Bu çalışma, biyolojik olarak ilgili doku mimarisinin yeniden ayarlanabilir ve mekaniği ile iskele malzeme yetiştirilen ve optik mikroskopi ile görüntülenmiştir 12-19 edilebilir vitro tümör modellerinde 3D ​​geliştirilmesi ile, özellikle kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, tümör ve sırayla kanser hücrelerinin çevrelerini reolojisini değiştirmek, üzerinden mikro arasında, bu mechanoregulatory iletişim diğer tarafında, bir miktar kalırçalışmak daha zor. Örneğin istilası işlemler sırasında, bir tümörün çevresinde hücreler sırayla arasında mechanosensitive büyüme davranışını etkiler ECM 20-22, yerel olarak bozulmasına neden olduğu mezenkimal geçiş (EMT) epitel geçmesi ve matris metaloproteazların (MMPler) ekspresyonunu artırabilir Diğer yakın tümör hücreleri. Biyokimyasal süreçlerin çeşitli aracılığıyla, kanser hücreleri sürekli olarak farklı zamanlarda farklı süreçleri uygun yukarı ve aşağı çevrelerinin yerel sertliğini çevirin. Burada açıklanan metodoloji 3D tümör modelleri ile entegre ve kültürünü sonlandırma olmadan biyokimyasal ve fenotipik değişiklikler ile uzunlamasına deneþtirilebilir büyümesi sırasında sertlik ve ECM uygun olarak yerel değişiklikleri, rapor analitik araçlar için ihtiyaç tarafından motive edilir. Bu bağlamda uygulamak için uygun bir teknik arayışı içinde, partikül izleme microrheology (PTM) güçlü bir aday olarak ortaya çıkmaktadır.Bu yöntem, Mason ve Weitz 23,24 ile başlangıçta öncülüğünü, mikron uzunluk ölçeklerinde frekans-bağımlı karmaşık viskoelastik kesme modülü, G * (ω) bildirmek için karmaşık bir sıvı içinde gömülü izleyici sondaları hareketini kullanır. Bu genel yaklaşım, yumuşak yoğunlaştırılmış madde, kolloidler, biyofizik ve polimer fizik 25-31 farklı uygulamalar için uygun çok sayıda varyasyonları ile geliştirilmiştir. Yerel viskoelastisite okumalar kültür hazırlama sırasında dahil büyüme ve uzun süreler boyunca yerinde kalması olan biyokimyasal olarak aktif olmayan tracer sondaların tahribatsız bir video görüntüleme ile sağlanan bu yana PTM, diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Bu, zorunlu olarak kültür sonlandırma gerektirir ve kompleks 3 boyutlu tümör microenvir içinde noktası ölçümleri yerine, numunenin kütle makroskopik reolojiye bildiren bir osilatör kesme yığın reometre, altın standart ölçümlere aksine bironment. Gerçekten de bir takım çalışmalar hücre göçü 32, genişleyen bir sferoit 33, hücre içi Reolojinin 34,35 tarafından oluşturulan mekanik stres ile ilişkili deformasyonlar ölçmek için veya kanser ya da kanser olmayan hücrelerin etrafında izleyici sonda hareketlerinin ölçümleri yorumlama programı resimli, ve var mekanik gerilmeler ve suşları mühendislik dokularının 36, ve gözenek boyutu ve işgali hızı 37 arasındaki ilişkiyi haritasına. Böyle atomik kuvvet mikroskobu (AFM) olarak microrheology uygun diğer teknikler, uygulanabilir, ama öncelikle de numune yüzeyinde puan sondalama ve için uzunlamasına ölçümler 38 zorlaştırıyor kültür kısırlık sorunları oluşturabilecek. Burada, biz güvenilir mekansal haritalama video partikül izleme ve analiz yöntemleri için gömülü floresan problar ile ECM içine transferi için uygun 3D tümör sferoidlerin büyümesi için yöntemleri içeren kapsamlı bir protokol açıklarkültür içinde zamanla microrheology olarak değişir. Mevcut uygulamada, 3D tümör modelleri bu biçim için elverişli diğer geleneksel deneyler (örneğin, sitotoksisite) ile microrheology ölçümleri dahil sağlayacak bir şekilde çok-yuvalı formatta büyütülür. PANC-1 hücreleri kullanılarak bu yöntem biz kültür in vitro 3D küremsi Bu temsili örnek olarak, sferoidler 39, ancak bu tarifnamede tarif edilen bütün ölçümler oluşturmak için bilinen bir kurulan pankreas kanseri hücre soyu hücre çizgileri, çeşitli kullanılarak katı tümörlerin incelemek için geniş çapta uygulanabilir olduğunu 3D kültür için uygundur. Bu yöntem, doğal görüntüleme bazlı olduğundan bu ideal hücre büyümesi, göç ve fenotip değişiklikleri bildirmek büyük görüş iletilen ışık alanları ile yüksek çözünürlüklü microrheology veri co-kayıt için uygundur. PTM uygulanması mikroskop sahne WH tekrarlanabilir konumlandırma varsayar bu şekilde iletilen ışık mikroskobu ile entegreich motorlu ticari widefield epifluorışıma biyolojik mikroskopları üzerinde genellikle mevcuttur. Aşağıda geliştirilen protokol herhangi bir makul donanımlı otomatik floresan biyolojik mikroskop ile uygulanabilir. Bu çevrimdışı işleme için dijital video mikroskopi gigabayt veri edinimini gerektiren bir doğal veri-yoğun bir yöntemdir. Aşağıdaki protokolde, Protokol 1 agaroz üzerinde kalıbı kullanılarak burada tarif edilmiştir, fakat bu asılı damla 40 ya da 41 döner kültür teknikleri gibi çeşitli yöntemler ile ikame edilmiş olabilir, tümör küremsiler başlangıç ​​hazırlanması ile ilgilidir. Protokol 2 alternatif olarak, in vitro 3B tümörler, kapsülleme ya da yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ECM 12,15 gömülmesi de, yerine tek bir önceden oluşturulmuş yapışmayan sferoitler tarafından yetiştirilen edilebilir olsa da, bir kollajen iskele sferoidler gömme işlemi tarif eder. Müteakip protokoller o prosedürleri tarifsırasıyla, Video mikroskopi veri edinme ve işleyerek zaman çözüme microrheology ölçümleri btaining. Veri işleme (bkz. http://www.physics.emory.edu/, MATLAB kullanarak orjinal da yoğun farklı yazılım platformları için geliştirilmiş olan Crocker ve Grier 42, tarafından açıklanan algoritmalar üzerine inşa PTM&#39;sinden açık kaynak rutinleri yararlanarak tarif edilir ~ hafta / Idl /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Mekanik mikro çevre kendisi yenilenmiş ve karmaşık, iki yönlü mechanosensitive etkileşimlerinin bir kümesinin bir parçası olarak modifiye edilir tümör büyümesi davranış ve sinyallemenin önemli bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Biyolojik ilgili 3D tümör modellerinin geliştirilmesi, tümör büyümesi üzerindeki matris reolojinin etkisi üzerinde mekanik çalışmalar kolaylaştırmış olsa da, tümörlerin yol açtığı mekanik çevre haritalama değişikliklerin ters problem zorlu kalır. Burada, uzunlamasına yerinde, tümör mikro-fiziksel değişiklikleri izlemek için, sağlam ve uygun bir yaklaşım bir parçası olarak pankreas kanseri 3D modelleri ile bağlantılı olarak parçacık izleme microrheology (PTM) &#39;nin uygulanmasını tarif etmektedir. Burada tarif edilen metodoloji ile, floresanla işaretlenmiş problar muntazam po için dağıtılmış bir model hücre dışı matrisin tip I kollajenin (ECM) iskele gömülü in vitro 3D modeller hazırlamak için bir sistem entegrenoktası pozisyonu ve numune boyunca zamana bağlı microrheology ölçümleri. In vitro tümörler kaplama ve çok-yuvalı plakalar kullanılarak görüntüleme paralel koşullarda sondalandı. Kurulan yöntemleri Çizim, izleyici sonda hareketlerin videoları karmaşık frekans-bağımlı viskoelastik kesme modülü, G * (ω) rapor Genelleştirilmiş Stokes Einstein İlişkisi (GSER) üzerinden dönüşür. Bu yaklaşım, görüntüleme-tabanlı olduğundan, mekanik karakterizasyonu aynı anda 3D tümör boyutu ve fenotip niteliksel değişiklikleri bildirmek için büyük iletilen ışık mekansal alanlar üzerine eşleştirilir. Lokalize işgali kaynaklı matriks bozulması yanı sıra sistem kalibrasyon ile ilişkili alt bölgelerde mekanik tepki zıt gösteren Temsilcisi sonuçları doğrulama verileri sunulmaktadır. Yaygın deneysel hatalar ve bu konularda sorun giderme istenmeyen sonuçları da sunulmuştur. Bu protokol uygulanan 96-kuyu 3D kültür kaplama biçimidir cterapötik tarama deneyleri veya mekanik mikro üzerinde tedaviler veya biyokimyasal uyaranlara etkisini içine yeni anlayışlar kazanmak için moleküler görüntüleme ile microrheology ölçümlerin korelasyon onducive.

G * Karmaşık bir modeli tümör mikro içinde lokalize pozisyonlarda (ω) ölçümleri geçerliliğini doğrulamak için, iki ilk doğrulama deneyleri gerçekleştirilmiştir. Öncelikle, biz toplu osilatör kesme reometri &quot;altın standart&quot; karşı ölçümleri doğrulamak için çalıştı. Bu, 1.0 mg / ml kolajen konsantrasyonunda (hücreler olmadan) Kolajen matrisin aynı numuneler hazırlandı. Bu örnekler (&quot;(bu protokol boyunca aynı parametreler kullanılarak) ve G elde edilen ?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Görüntüleme.  University of Massachusetts Boston.  Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir. 