Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

1. صيانة خطوط الخلايا البلعمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو RAW264.7 وخطوط الخلايا J774A.1 في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2. للمساعدة في الحفاظ العقم، إضافة 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) في وسائل الإعلام (على الرغم من أن هذا ليس ضروريا بدقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة حاسمة: تأكد من أن الضامة تنمو في حالة صحية لكفاءة ترنسفكأيشن سيرنا والتي يسببها ضربة قاضية الجينات. استخدام خلايا الممرات بين 3 و 10 بعد ذوبان الجليد النقي، وهذه خطوط بلعم تظهر أفضل كفاءة ترنسفكأيشن والحفاظ على بقاء قوة بعد ترنسفكأيشن في هذه المرحلة. لا تستخدم عددا مرور العالي (&gt; 20)، وكفاءة ترنسفكأيشن وإسقاط الموروثة على حد سواء يقلل إلى حد كبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالأمثل سيرنا ترنسفكأيشن، وخلايا لوحة عند 20٪ confluency وتنمو يوما أو يومين حتى تصل إلى خلايا لا يزيد عن 80٪ التقاء. وخلايا متضخمة لا بالنقل efficiently. </li></ol> 2. برمجة نظام المكوك 96-جيدا لترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء برنامج مكوك 96-جيدا على جهاز كمبيوتر متصل المكوك. حدد ملف المعلمة الجديد من أعلى القائمة ملف اليسرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء على الآبار التي سيتم transfected على عرض 96 لوحة جيدا التخطيطي. سيقوم الصندوق الأخضر الذي يشير إلى الآبار ويتم اختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البرنامج الذي يتوافق مع خط خلية بلعم تستخدم (DS-136 لRAW264.7 أو DS-130 لJ774A.1)، ثم حدد تطبيق، وتقع تحت diagramed وحة 96-جيدا. ملاحظة أنه بعد اختيار البرنامج، سيتم الملونة الآبار على لوحة تخطيطية الأزرق الداكن. دوائر فارغة تشير إلى الآبار التي لم يتم تعيينها برنامج ولن تكون صدمة. </li></ol> 3. إعداد الكواشف لترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل Nucleofector ™ يعمل عن طريق خلط SF خط الخلية 96-جيدا الحل Nucleofector ™مع كامل محتويات أنبوب ملحق المغلقة. السماح للالكواشف المختلطة للتوازن في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. تخزين الزائد الحل الكامل Nucleofector ™ في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة المالحة DMEM، RPMI-1640، 0.25٪ التربسين / EDTA، والفوسفات مخزنة (PBS) في 37 درجة مئوية قبل إعداد الضامة لترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيرنا لترنسفكأيشن من قبل ذوبان على الجليد. من أجل تقليل عدد يذوب تجميد سيرنا، وتجميد الرناوات siRNAs جديدة مأخوذة في أول مرة تستخدم فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التجارب الأولية، واستخدام سيرنا بجرعة عالية نسبيا من 2 ميكرومتر (01:10 المخفف من 20 ميكرومتر الأسهم). بعد ذلك يعاير الرناوات siRNAs التي تحفز الجينات القوي ضربة قاضية الى جرعات أقل، على الرغم من أن هناك حاجة إلى جرعات أعلى عادة لكفاءة ضربة قاضية الجينات في الضامة مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا. تتوفر الرناوات siRNAs من مصادر عديدة؛ ملاحظة: إلى حد ما قوية ضربة قاضية الجينات يمكن الحصول علىباستخدام SMARTPOOLs siGenome، وهي برك من أربعة الرناوات siRNAs تستهدف كل جين. كعنصر تحكم السلبية، أي استخدام مختلف حمامات غير مستهدفة أو سيرنا الرناوات siRNAs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة كفاءة ترنسفكأيشن، إما بالنقل سيطرة بلازميد pmaxGFP (المقدمة في مجموعات AMAXA) أو الرناوات siRNAs fluorescently المسمى، بالتوازي مع الرناوات siRNAs التجريبية. نتوقع 30-50٪ ترنسفكأيشن من البلازميد GFP (يعاير بواسطة المجهر أو التدفق الخلوي بعد يوم من ترنسفكأيشن) و&gt; 99٪ من ترنسفكأيشن fluorescently المسمى سيرنا (يعاير التدفق الخلوي مباشرة بعد ترنسفكأيشن والإنعاش). </li></ol> 4. إعداد الضامة لترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الضامة ملتصقة من أطباق زراعة الخلايا بواسطة trypsinization. نضح في وسائل الاعلام وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع ما قبل تحسنت 0.25٪ التربسين / EDTA (1 مل / 10 سم لوحة) لمدة 1-2 دقائق حتى تبدأ الخلايا لفصل. اضغط برفق لوحة ونقل المحاليلنشوئها خلال الحضانة لتعظيم trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، إضافة 9 مل + سائل الاعلام DMEM FBS، مزيج بلطف صعودا وهبوطا، وجمع الخلايا بواسطة pipetting في أنبوب معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الضامة معزولة باستخدام عدادة الكريات. نتوقع نحو 10 مليون دولار الضامة في 10 سم لوحة. حساب العدد الإجمالي للالضامة الحاجة؛ كل بئر على متن المكوك 96-جيدا يتطلب 200،000 الخلايا. تذكر أن تضيف قيمة بضع آبار إضافية &quot;خلايا للسماح pipetting لخسائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة عدد المحسوبة للخلايا في أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة في 150 x ج في درجة حرارة الغرفة. لا أجهزة الطرد المركزي بسرعة كبيرة جدا لأن ذلك سوف يقلل الصحة بلعم والكفاءة ترنسفكأيشن. </li></ol> 5. Nucleofection الضامة مع سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم 96-جيدا لوحة أسفل جولة (التي يسهل الخلط مع تقليل فقدان كاشف)، إضافة 2 ميكرولتر من كل سيرنا إلى كل بئر لتكون transfECTED. ملاحظة: اعتمادا على عدد من الرناوات siRNAs، وهذا يمكن إنجازه خلال الخطوة بلعم الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من الخلايا بالطرد المركزي. resuspend بلطف الخلايا في حل Nucleofector ™ SF (التي تحتوي على الحل ملحق)، وذلك باستخدام 20 ميكرولتر لكل 200،000 خلايا مكعبات. مرة واحدة معلق، استخدام الخلايا فورا لترنسفكأيشن الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا معلق في حوض معقم. باستخدام ماصة الأقنية، ونقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية معلق في كل بئر من لوحة 96-جيدا تحتوي على الرناوات siRNAs. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية / سيرنا في 96-جيدا Nucleocuvette ™ لوحة خطوة حاسمة: تجنب توليد فقاعات خلال خطوة نقل مثل هذه الأخطاء يمكن أن تحدث أثناء Nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع جميع العينات التجريبية في لوحة ترنسفكأيشن، وتغطي لوحة 96-جيدا مع غطاء المقدمة والاصدارذ الاستفادة برفق على سطح صلب لإزالة أي فقاعات من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96-جيدا مع غطاء جيدا في 96 المكوكية Nucleofector واختر &quot;تحميل وبدء&quot; على أسفل يمين الشاشة البرنامج. قبل Nucleofection، اتبع موجه برنامج لحفظ النتائج. ملاحظة: أثناء عملية Nucleofection، سيتم تصوير الآبار tranfected بنجاح على التخطيطي 96-جيدا على الشاشة من خلال دائرة خضراء مع علامة زائد. وهناك دائرة حمراء مع وجود علامات تشير إلى ناقص خطأ، وعلى الأرجح بسبب فقاعات أو حجم الصحيح من الكواشف pipetting لسوء. </li></ol> 6. الإنعاش وتصفيح الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد Nucleofection، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 80 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) RMP1-1640 وسائل الإعلام إلى كل بئر. إضافة وسائل الإعلام إلى جانب كل بئر، مما يتيح وسائل الإعلام لخلط ببطء مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، والتي هي حساسة جدا في هذه المرحلة. لا تضيف وسائل الإعلام بسرعة كبيرة، وهذه الإرادةانخفاض كبير جدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات 96-جيدا مع عينات transfected وRPMI-1640 في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 2 دقيقة. هذا أمر بالغ الأهمية لتسمح للخلايا للتعافي قبل مواصلة التلاعب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة ونقل بعناية خليط من كل بئر إلى 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من قبل تحسنت (37 درجة مئوية) + DMEM FBS المتوسطة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ ل24-36 ساعة (تحسين التوقيت الدقيق لالرناوات siRNAs الفردية، على الرغم من أن هذا النطاق الزمني يعمل بشكل جيد عموما). </li></ol> 7. تحفيز الضامة مع LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24-36 ساعة بعد Nucleofection الحضانة، وإعداد LPS (أو غيرها من PAMPs) في وسائل الإعلام الطازجة. إعداد ما يكفي من متوسطة جديدة لجميع الآبار (200 ميكرولتر مالقانونين / بئر من لوحة 96-جيدا زائد قليلا اضافية لpipetting ل). تمييع LPS إلى تركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل في DMEM FBS +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح بعناية من 96 لوحة جيدا وإضافة وسائل الإعلام الطازجة تحتوي على LPS إلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة استجابة لLPS أو PAMPs أخرى في أوقات مختلفة بعد التحفيز. 6 ساعة كافية لتوليد قوة استجابة خلوى التهابات السيتوكينات لمثل IL-6 أو TNFα. </li></ol> 8. رصد الاستجابة المستحثة الفطرية المناعي، إسقاط الموروثة، واستمرار في الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة يسببها LPS-إنتاج السيتوكينات، ماصة طاف من الخلايا إلى صفيحة تخزين 96-جيدا. ومن ثم يمكن قياس إنتاج السيتوكينات بواسطة ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تتم إزالة طاف، ومراقبة بقاء الخلية باستخدام فلوريسئين ثنائي الأسيتات (عندما المشقوق من قبل esterases الخلوية في الخلايا الحية، ويصبح هذا المركب الفلورسنت). تحديد الرناوات siRNAs التي تستهدف الجينات التي تتحكم في بقاء الخلية باستخدام رنهجه. ملاحظة: يجب أن يكون عملية ترنسفكأيشن نفسها تأثير قليل على جدوى إذا أجريت بشكل صحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل الأسهم في الأسيتون) إلى كل بئر (1: 100 التخفيف النهائي في PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة ل1-5 دقيقة ثم مراقبة مضان في الخلايا باستخدام قارئ لوحة (460 نانومتر الإثارة، 515 الانبعاث نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لضمان أن مضان في الآبار موحد، ليز الخلايا باستخدام مخازن مثل RIPA. وهذا يوفر إشارة الفلورسنت موحدة في البئر، كما يتم تكوين بعض القراء لوحة لمراقبة سوى جزء صغير من البئر. إذا لم يتم مطلي الخلايا بشكل موحد، يمكن للثنائي الأسيتات فلوريسئين تعطي قراءة غير دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبديل لمراقبة بقاء الخلية، ومراقبة الجينات التي يسببها سيرنا ضربة قاضية من قبل QPCR باستخدام RNA المستمدة من الخلايا الملتصقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة طاف من الخلايا (الخطوة 8.1 أعلاه)، إعلانعازلة د RLT (الذي يستخدم لتحلل والحفاظ على RNA) مباشرة إلى الخلايا الملتصقة إلى ليز لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مستحضر عدة RNA مثل RNeasy مصغرة عدة، واستخدام QPCR مع الاشعال الجينات المحددة لمراقبة الجينات ضربة قاضية بالنسبة للسيطرة على العلاج سيرنا. استخدام التمهيدي لΒactin أو GAPDH للتطبيع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبديل آخر لرصد جوانب أخرى من الاستجابة المناعية الفطرية، ومراقبة القدرة أكلة من الضامة بإضافة المسمى FITC E. جسيمات القولونية مباشرة على الخلايا الملتصقة باستخدام عدة. بعد بروتوكول الشركة المصنعة، والتي تستغرق بضع ساعات فقط، ومراقبة امتصاص أكلة باستخدام قارئ لوحة أو المجهري. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The innate immune response to infection. , (2004).</li><li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+macrophage+activation.">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li><li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets.">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li><li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages:+mechanism+and+functions.">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li><li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages:+an+immunologic+functional+perspective.">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li><li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity.">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+comes+of+age.">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li><li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The macrophage. , (2002).</li><li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules.">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages:+a+case+study+for+optimization+procedure.">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li><li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach.">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li><li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network.">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide.">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands.">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice.">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li><li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus.">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li><li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines.">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li><li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells.">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li><li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2.">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li><li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3.">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732 (2001).</li><li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+toll-like+receptor+(TLR3)+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands.">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li><li>Fernandez-Botran, R., V&#283;tvi&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).</li></ol>

تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. وقد رعت هذه المادة من قبل ونزا، وشركة

وقد نشرت العديد من الدراسات التي تم فيها استهداف الجينات الفردية عن طريق سيرنا في الضامة الفئران. بينما الدهون بوساطة ترنسفكأيشن تم استخدامها لتقديم سيرنا على خطوط خلايا البلاعم على أساس فردي، وهذه الأساليب تعاني من الآثار المحتملة على قدرتها على البقاء، ضربة قاضي?...

في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب فعالة لكبح الجينات في خطوط خلايا البلاعم الماوس باستخدام الرناوات siRNAs ورصد آثار هذه العلاجات على الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنفيذ هذه الإجراءات في شكل 96-جيدا، مما يسمح للشاشات رني في متوسطة أو عالية الإنتاجية الموضة. ردا على إصابة البشر جبل الاستجابة المناعية الفطرية الفورية واستجابة أبطأ ولكن أكثر تحديدا المناعة التكيفية. وتتضمن هذه الاستجابة المناعية الفطرية السريعة تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية أكلة بما في ذلك الضامة 1. وتشارك الضامة تفعيلها كلاسيكي في الاستجابات الالتهابية الحادة وتنتج البروتينات المضادة للميكروبات والمركبات، والسيتوكينات كيموكينات، ومستضدات موجودة 2،3. الضامة تفعيلها بدلا من ذلك تلعب دورا في تنظيم الحصانة، والحفاظ على التسامح وإصلاح الأنسجة والتئام الجروح 4-8. بسبب طائفة واسعة من الوظائف الخاصةيمكن الضامة تلعب دورا في العديد من الأمراض بما في ذلك تصلب الشرايين والتهاب المفاصل والسرطان 9. وبالتالي، فإن دراسة الضامة مجالا رئيسيا للبحوث لبعض الوقت في طائفة واسعة من المجالات المرض. على الرغم من أهميتها في الاستجابة المناعية الفطرية، الضامة يمكن أن يكون تحديا خلايا للعمل مع. على وجه الخصوص، فمن الصعب الحصول على ترنسفكأيشن كفاءة استخدام الكواشف الدهون في الضامة دون سمية المرتبطة 10،11. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم تسليم سيرنا بكفاءة لالضامة، متانة الجين رني الناجم عن ضربة قاضية في كثير من الأحيان يمكن أن يكون معتدلا إلى حد ما ويمكن أن تختلف من الجينات إلى الجين. للتغلب على هذه التحديات التقنية، قمنا الأمثل ترنسفكأيشن وتقنيات ضربة قاضية 12-16 في اثنين من خطوط الخلايا الماوس بلعم، RAW264.7 17 و 18 J774A.1. يستخدم هذا النهج AMAXA Nucleofector 96-جيدا نظام المكوك لترنسفكأيشن. هذا النظاميستخدم مزيجا من المواد الكيميائية المتخصصة و electroporation لبالنقل الخلايا في شكل 96-جيدا 19. بعد ترنسفكأيشن، نحن تصف الأساليب لتعظيم الانتعاش الخلايا وقدرتها على البقاء وتعظيم اللاحقة التي يسببها سيرنا ضربة قاضية الجينات. لتوضيح فائدة هذا النهج، نحن تصف بروتوكول للتسليم سيرنا على هذه السطور خلية بلعم، وتحفيز هذه الخلايا مع عديد السكاريد الشحمي (بي إس)، ومراقبة الاستجابة المناعية الفطرية على مستوى إنتاج العديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات. نحن نقدم بيانات العينة التي نعمل استهداف تول مثل مستقبلات (TLR) عائلة، أفرادها الشعور LPS والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الأخرى (PAMPs)، لتنظيم المناعة الفطرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAM-1001S</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4SC-2096</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RAW264.7 mouse macrophage cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >J774A.1 mouse macrophage cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >siGenome smartpool siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>varies depending on gene</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Non-targeting control siRNA pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001206-13-20</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Block-iT fluorescent oligo for electrooration</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13750062</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>421</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >DMEM, high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-065</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RPM1-1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875-093</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SV30010</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-89 </td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >96 well round bottom sterile plates (not coated)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-745</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Biosystems</td>
			<td>DY406</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Mouse TNFa Duoset ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Biosystems</td>
			<td>DY410</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RLT Bufer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Vybrant Phagocytosis Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-6694</td>
		<td></td></tr>
	</tbody>
</table>

using rna-interference to investigate the innate immune response in mouse macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

للتدليل على كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام هذا النهج، فإننا مراقبة امتصاص FITC المسمى سيرنا باستخدام عداد الكريات تدفق (الشكل 1). لتوضيح فائدة نهجنا لرصد الاستجابة المناعية الفطرية، فإننا transfected الرناوات siRNAs استهداف الجينات ا...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages at JoVE.com

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.6K Views.  National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Video: Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

التدخل في الحمض النووي الريبي القراد

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

باستخدام تحليل النشوء والتطور للتحقيق التوكسينات الجينات الأصل

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...