Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

1. תחזוקה של שורות תאי מקרופאג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול RAW264.7 ושורות תאי J774A.1 DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) בשעה 37 ºC בנוכחות של 5% CO 2. כדי לסייע לשמור על סטריליות, להוסיף 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) לתקשורת (אם כי זה לא ממש הכרחי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד קריטי: ודא שמקרופאגים גדלים במצב בריא עבור transfection יעיל ומציאת גן מושרה siRNA. השתמש בתאים בין קטעי 3 ו -10 לאחר הפשרה טריות, כקווי מקרופאג הללו מפגינים יעילות transfection הטובה ביותר ולשמור על הישרדות לאחר transfection חזק בשלב זה; לא להשתמש במספר גבוה יותר מעבר (&gt; 20), כיעילות transfection וגן מציאה שני יקטינו מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection siRNA מותאם, תאי צלחת בconfluency 20% ולגדול יום או יומיים עד שהתאים מגיעים ללא מפגש יותר מ -80%. תאי מגודלים לא transfect efficiently. </li></ol> 2. תכנות מערכת הסעות 96-גם לTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת הסעות 96, גם על המחשב המחובר להסעות. בחר קובץ פרמטר חדש מתפריט הקובץ השמאלי העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את הבארות שיהיה transfected על סכמטי צלחת 96-היטב המוצגות. קופסא ירוקה תציין שבארות נבחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התכנית המתאימה לשורת תא מקרופאג בשימוש (DS-136 לRAW264.7 או DS-130 לJ774A.1) ובחר להחיל, ממוקמת מתחת לצלחת 96-היטב diagramed. שים לב שלאחר בחירת תכנית, הבארות על הצלחת סכמטי תהיה בצבע כחולה כהה. חוגים ריקים מצביעים על בארות שלא הוקצו בתכנית ולא יהיו בהלם. </li></ol> 3. הכנת ריאגנטים לTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון Nucleofector ™ עובד על ידי ערבוב שורת תאי SF 96, גם פתרון Nucleofector ™עם כל התכולה של צינור תוספת המצורפת. לאפשר ריאגנטים המעורבים לאזן בטמפרטורת חדר לפני השימוש. אחסן פתרון עודף מלא Nucleofector ™ ב 4 ºC עד 3 חודשים לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם מלוח DMEM, RPMI-1640, טריפסין 0.25% / EDTA, ופוספט שנאגר (PBS) בשעה 37 ºC לפני הכנת מקרופאגים לtransfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את siRNA לtransfection על ידי הפשרה על קרח. על מנת לצמצם את מספר מפשיר הקפאה של siRNA, להקפיא siRNAs החדשה בaliquots הפעם הראשונה שהם נמצאים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים ראשוניים, להשתמש siRNA במינון גבוה יחסית של 2 מיקרומטר (בדילול 01:10 מ -20 מיקרומטר מניות). בהמשך לכך לכייל siRNAs שגורמת לגנים חזקים מציאה עד למינונים נמוכים יותר, אם כי במינונים גבוהים יותר בדרך כלל יש צורך במציאת גן יעיל במקרופאגים בהשוואה לסוגי תאים אחרים. הערה: siRNAs זמינות ממקורות רבים; למדי ניתן להשיג מציאה גן חזקהבאמצעות SMARTPOOLs siGenome, שברכות של ארבע siRNAs מיקוד כל גן. כביקורת שלילית, להשתמש בכל בריכות שונות במיקוד שאינו siRNA או siRNAs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על יעילות transfection, transfect או פלסמיד pmaxGFP השליטה (בתנאי בערכות Amaxa) או siRNAs fluorescently שכותרתו במקביל לsiRNAs הניסיונית. מצפה transfection 30-50% של פלסמיד GFP (assayed על ידי מיקרוסקופ או cytometry זרימת היום לאחר transfection) וtransfection&gt; 99% מsiRNA fluorescently שכותרתו (assayed ידי cytometry זרימה מייד לאחר transfection והתאוששות). </li></ol> 4. הכנת המקרופאגים לTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק מקרופאגים חסיד ממנות התרבות של תאים על ידי trypsinization. לשאוב את התקשורת ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר הסרת PBS, דגירה התאים עם מראש חימם 0.25 טריפסין% / EDTA (1 מיליליטר / 10 סנטימטר צלחת) ל1-2 דקות עד שתאים מתחילים לנתק. לטפוח בעדינות את הצלחת ולהעביר את solution במהלך הדגירה על מנת למקסם את trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, להוסיף 9 מיליליטר DMEM תקשורת + FBS, מערבב בעדינות מעלה ומטה, ולאסוף את התאים על ידי pipetting לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר של מקרופאגים המבודדים באמצעות hemocytometer. מצפה בערך 10 מיליון מקרופאגים לכל 10 צלחת סנטימטר. לחשב את המספר הכולל של מקרופאגים צורך; כל טוב שבאטל 96 גם דורש 200,000 תאים. זכור להוסיף את השווי של כמה בארות נוספות של תאים, כדי לאפשר להפסדי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה המספר המחושב של תאים לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה התאים עבור 10 דקות ב XG 150 בטמפרטורת חדר. אל צנטריפוגות מהר מדי כמו זה יהיה להפחית בריאות מקרופאג ויעילות transfection. </li></ol> 5. nucleofection של המקרופאגים עם siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות היטב 96 צלחת סטרילית תחתית עגול (המאפשר ערבוב תוך מזעור הפסד מגיב), להוסיף 2 μl של כל siRNA לכל transf גם להיותected. הערה: בהתאם למספר siRNAs, זה יכול להיות מושלם במהלך שלב צנטריפוגה מקרופאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מתאי centrifuged. בעדינות resuspend תאי פתרון Nucleofector ™ SF (המכילים את פתרון התוסף), באמצעות 20 μl ל200,000 תאים pelleted. ברגע שresuspended, להשתמש בתאים באופן מיידי לtransfection האופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי resuspended לתוך שוקת סטרילי; בעזרת פיפטה רבה, העברת 20 μl של תערובת תאים המושעית זה לבאר כל צלחת 96-היטב המכילה את siRNAs. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 μl של תערובת התא / siRNA לתוך 96-גם צלחת Nucleocuvette ™ צעד קריטי:. למנוע יצירת בועות במהלך שלב ההעברה כמו זה יכול לגרום לשגיאות במהלך nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצבת כל דגימות ניסוי בצלחת transfection, מכסה את הצלחת 96-היטב עם המכסה וVer סיפקy לטפוח בעדינות על משטח קשה כדי להסיר בועות מהדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת 96-היטב עם מכסה ל96-גם הסעות Nucleofector ובחר &#39;להעלות ולהתחיל &quot;בצד הימין למטה של ​​מסך התכנית. לפני nucleofection, בצע את הפקודה התכנית כדי לשמור את התוצאות. הערה: במהלך תהליך nucleofection, בארות tranfected הצלחה תהיה להיות מתוארות על 96, גם סכמטי על המסך על ידי עיגול ירוק בסימן חיובי. עיגול אדום עם סימני מינוס מציין שגיאה, ככל הנראה בשל בועות או אמצעי האחסון הנכון של חומרים כימיים pipetting-רע. </li></ol> שחזור 6. וציפוי של המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר nucleofection, בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 80 μl של מחוממים מראש (37 ºC) RMP1-1640 תקשורת היטב כל אחד. הוסף את התקשורת לצד של כל טוב, המאפשר התקשורת לערבב באיטיות עם תאי transfected, שהם מאוד עדינים בשלב זה. אל תוסיף את התקשורת מהר מדי, כרצון זובמידה ניכר את הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחות 96-גם עם דגימות transfected וRPMI-1640 לחממת 37 ºC עם 5% CO 2 למשך 2 דקות; זה הוא קריטי כדי לאפשר לתאים להתאושש לפני לקדם מניפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 96-היטב מהחממה ולהעביר בזהירות את התערובת מכל טוב לצלחת תרבית רקמת 96, גם בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להוסיף מ( 37 ºC) DMEM בינוני מחומם מראש + FBS 100 μl היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את צלחת 96-גם רקמת התרבות עם דגימות בחממה 37 ºC עם 5% CO 2 ל24-36 שעות (לייעל את העיתוי המדויק לsiRNAs בודדת, אם כי טווח זמן זה בדרך כלל עובד היטב). </li></ol> 7. גירוי של המקרופאגים עם LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה לאחר nucleofection 24-36 שעות, להכין LPS (או PAMPs אחר) בתקשורת טרי. להכין מדיום טרי מספיק עבור כל הבארות (מ &#39;200 μlעדיה / היטב צלחת 96-היטב בתוספת תוספת קטנה עבור pipetting). לדלל LPS לריכוז סופי של 20 ng / ml בDMEM + FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת בזהירות לשאוב מצלחת 96-היטב ומוסיפה את התקשורת הטרי המכילה LPS לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התגובה לLPS או PAMPs האחר בזמנים שונים לאחר גירוי. 6 שעות מספיקות כדי ליצור תגובת ציטוקינים דלקתית חזקה לציטוקינים כגון IL-6 או TNFα. </li></ol> 8. ניטור המושרה מולדת התגובה החיסונית, ג&#39;ין מציאה, ויכולת הקיום בהמקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על מושרה LPS ייצור ציטוקינים, פיפטה supernatant מהתאים לתוך צלחת אחסון 96-היטב. ייצור ציטוקינים לאחר מכן ניתן למדוד על ידי ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שsupernatant מוסר, לפקח על כדאיויות תא באמצעות diacetate והעמסת (כאשר ביקעו ידי esterases הסלולרי בתאים חיים, המתחם הזה הופך ניאון). לזהות siRNAs כי יעד הגנים ששולטות כדאיות תא באמצעות tהגישה שלו. הערה: תהליך transfection עצמו יהיה השפעה מועטת על יכולת קיום אם מבוצע כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף diacetate והעמסת (5 מ&quot;ג / מיליליטר מניות באצטון) זה טוב (1: 100 דילול סופי PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 4:59 דקות ולאחר מכן לעקוב אחר הקרינה בתאים באמצעות קורא צלחת (460 עירור ננומטר, 515 פליטת ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי להבטיח שהקרינה בבארות היא אחידה, lyse התאים באמצעות מאגרים כגון ריפה; זה מספק אות ניאון אחידה בבאר, כחלק מקוראי הצלחת מוגדרים לפקח רק חלק קטן מהבאר; אם התאים אינם מצופים באופן אחיד, diacetate והעמסת יכול לתת קריאה מדויקת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלופה למעקב כדאיות תא, לעקוב אחר הגן מושרה siRNA מציאה על ידי qPCR באמצעות RNA הנגזר מהתאים חסיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר supernatant הוא להסיר את התאים (שלב 8.1 לעיל), מודעהחיץ ד RLT (המשמש לתמוגה ושימור של RNA) ישירות לתאים חסיד לlyse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA באמצעות ערכת הכנת RNA כגון RNeasy מיני הערכה, ולהשתמש qPCR עם פריימרים גן ספציפי כדי לפקח על גן יחסי מציאה לשלוט טיפול siRNA. השתמש בפריימרים לΒactin או GAPDH לנורמליזציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלופה נוספת כדי לפקח על היבטים אחרים של התגובה החיסונית המולדת, לפקח על יכולת phagocytic של מקרופאגים על ידי הוספת א-שכותרתו FITC חלקיקי coli ישירות על התאים חסיד באמצעות ערכה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, אשר לוקח רק כמה שעות, לפקח ספיגת phagocytic באמצעות קורא צלחת או במיקרוסקופ. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The innate immune response to infection. , (2004).</li><li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+macrophage+activation.">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li><li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets.">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li><li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages:+mechanism+and+functions.">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li><li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages:+an+immunologic+functional+perspective.">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li><li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity.">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+comes+of+age.">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li><li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The macrophage. , (2002).</li><li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules.">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages:+a+case+study+for+optimization+procedure.">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li><li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach.">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li><li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network.">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide.">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands.">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li><li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice.">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li><li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus.">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li><li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines.">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li><li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells.">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li><li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2.">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li><li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3.">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732 (2001).</li><li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+toll-like+receptor+(TLR3)+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands.">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li><li>Fernandez-Botran, R., V&#283;tvi&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מאמר זה מומן על ידי Lonza, Inc.

מחקרים רבים שפורסמו שבגנים בודדים היו ממוקדים על ידי siRNA במקרופאגים העכבריים. בעוד transfection תיווך שומנים נעשה שימוש כדי לספק siRNA לשורות תאי מקרופאג על בסיס אישי, שיטות אלה סובלים מהשפעות אפשריות על כדאיות, מציאה גן מוגבלת, ושונות מגן לגן. לפתח מבחני חזקים יותר שיכול לשמ?...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות יעילים כדי לדכא גנים בשורות תאי מקרופאג עכבר באמצעות siRNAs ולעקוב אחר ההשפעות של טיפולים אלה בתגובה החיסונית המולדת. נהלים אלה מתבצעים בפורמט 96-היטב, המאפשרים למסכי RNAi באופנה בינונית או תפוקה גבוהה. בתגובה לזיהום, בני אדם הר תגובה מיידית של מערכת חיסון מולדת ותגובה חיסונית אדפטיבית איטית אבל יותר ספציפית. תגובה חיסונית מולדת מהירה זה כוללת את הגיוס והפעלה של תאים חיסוניים מולדים phagocytic כוללים מקרופאגים 1. מקרופאגים מופעלים קלסי מעורבים בתגובות דלקתיות חריפות ולייצר חלבונים אנטי-מיקרוביאלי ותרכובות, ציטוקינים וכמוקינים, והווה אנטיגנים 2,3. מקרופאגים מופעלים לחלופין למלא תפקיד בויסות חסינות, שמירה על סובלנות, תיקון רקמות, וריפוי פצעי 4-8. בגלל המגוון הרחב של פונקציות שלהם, מקרופאגים יכולים לשחק תפקיד במספר רב של מחלות, כולל טרשת עורקים, דלקת פרקים וסרטן 9. כך, המחקר של מקרופאגים היה אזור עיקרי של מחקר כבר כמה זמן במגוון רחב של תחומים מחלה. למרות חשיבותם בתגובה החיסונית המולדת, מקרופאגים יכולים להיות מאתגרים תאים לעבוד איתו. בפרט, קשה להשיג transfection יעיל באמצעות ריאגנטים שומנים במקרופאגים ללא הרעלה כרוכה 10,11. יתר על כן, גם כאשר siRNA מועבר ביעילות למקרופאגים, על חוסנו של הגן מושרה RNAi מציאה לעתים קרובות יכול להיות מתון למדי ויכול להשתנות מגן לגן. כדי להתגבר על אתגרים טכניים אלה, יש לנו מותאמים transfection וטכניקות מציאה 12-16 בשתי שורות תאי מקרופאג העכבר, RAW264.7 17 וJ774A.1 18. גישה זו עושה שימוש במערכת הסעות 96, גם Amaxa Nucleofector לtransfection; מערכת זומשתמש בשילוב של חומרים כימיים וelectroporation מיוחדים transfect תאים בפורמט 96-גם 19. בעקבות transfection, אנו מתארים שיטות למקסם את התאוששות תא כדאיות ועל מנת למקסם את מציאה גן מושרה siRNA שלאחר מכן. כדי להמחיש את התועלת של גישה זו, אנו מתארים פרוטוקול למסירת siRNA לשורות תאי מקרופאג אלה, לעורר תאים אלה עם lipopolysaccharide (LPS), ולנטר את התגובה החיסונית המולדת ברמת ייצור של כמה ציטוקינים פרו-דלקתיים. אנו מספקים נתונים לדוגמה שבה אנו ממקדים משפחת קולט Toll-like (TLR), שחבריה לחוש LPS ודפוסים אחרים הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs), להסדיר חסינות מולדת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAM-1001S</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4SC-2096</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RAW264.7 mouse macrophage cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >J774A.1 mouse macrophage cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >siGenome smartpool siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>varies depending on gene</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Non-targeting control siRNA pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001206-13-20</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Block-iT fluorescent oligo for electrooration</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13750062</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>421</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >DMEM, high glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-065</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RPM1-1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875-093</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SV30010</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-89 </td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >96 well round bottom sterile plates (not coated)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-745</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Biosystems</td>
			<td>DY406</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Mouse TNFa Duoset ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Biosystems</td>
			<td>DY410</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >RLT Bufer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
		<td></td></tr>
		<tr >
			<td >Vybrant Phagocytosis Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-6694</td>
		<td></td></tr>
	</tbody>
</table>

using rna-interference to investigate the innate immune response in mouse macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

כדי להדגים את היעילות של transfection שימוש בגישה זו, אנו במעקב ספיגה של siRNA FITC שכותרתו באמצעות cytometer זרימה (איור 1). כדי להמחיש את התועלת של הגישה שלנו לבקרה על התגובה החיסונית המולדת, אנו transfected siRNAs מיקוד גני רגולטורי חיסון מולד...

Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages at JoVE.com

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.6K Views.  National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Video: Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA התערבות קרציות

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

באמצעות ניתוח פילוגנטי לחקור האיקריוטים מקור גנטי

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...