نشكر الأردن ديفيس، يانيان لين، اريك شادلر وJimiao تشنغ للمساعدة التقنية مع هذه الدراسة. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني وظيفيه منح MCB-1054962 لALA

1. إعداد كبيرة عصير التفاح لوحات أجار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل 4 لوحات، إضافة 375 مل من H 2 O، 11.25 غرام ذبابة أجار وبقضيب إلى قارورة 1،000 مل. هذا هو مزيج A. A الأوتوكلاف ميكس مع غطاء قارورة توج فضفاضة على دورة واحدة و 30 دقيقة التعقيم للبضائع السائلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 مل عصير التفاح، 12.5 غرام سكر المائدة وبقضيب إلى كوب 500 مل. هذا هو ميكس ميكس الحرارة B. B على منصة ساخنة مع التحريك والحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 70 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من التعقيم من مزيج A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من خلط التعقيم، ونقل ميكس ميكس A. B لنضع الخليط مع التحريك مجتمعة بلطف واتركها تبرد لمدة 15 دقيقة. تجنب الإفراط في التبريد والتصلب أجار نتج قبل إضافة المواد الحافظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 10٪ (وزن / حجم) الميثيل الحل 4-hydroxybenzoate في الايثانول. وهذا التصرف كمادة حافظة. إضافة 3.75 مل من الحل إلى ما سبق التفاح خليط عصير أجار. الحفاظ على التحريك لمدة anotheص 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 125 مل عصير التفاح أغار خليط مع المواد الحافظة في كل 300 سم 2 أو لوحة من البلاستيك الستايروفوم. اتركها تبرد لRT ويصلب. تجنب تشكيل فقاعات الهواء بينما تتدفق. ملاحظة: التفاح وعصير لوحات أجار تكون جاهزة للاستخدام فورا. تغطية لوحات غير المستخدمة مع يلف واضحة وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. </li></ol> 2. ذبابة الفاكهة الأجنة جمع ومعالجة ما قبل يشابك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل قفص السكان مع ما يقرب من 40،000 إلى 50،000 الذباب التي سيتم جمعها الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من لوحات كل منها يحتوي على 125 مل من معيار دقيق الذرة، دبس المتوسطة 12 ويرش حوالي 4 غرام من خميرة الخباز المجففة على كل لوحة. وضع هذه اللوحات في قفص السكان في الحاضنة 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتسمين الذباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 التفاح الدافئ لوحات عصير أجار إلى 25 درجة مئوية. رش حوالي 1 غرام من خميرة الخباز المجففة على كللوحة. وضع لوحات 2 في القفص السكان للبدء في جمع 0-1 الأجنة ساعة قديمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ بها لوحات في نهاية جمع 1 ساعة. استبدال لوحات جديدة 2 إذا كان هناك حاجة جولة أخرى من المجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية كافية من الماء لتغطية لوحات و resuspend الأجنة برفق باستخدام فرشاة الطلاء بشكل جيد. صب الأجنة معلق من خلال غربال اثنين من طبقة مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة أسلاك الفولاذ. ملاحظة: تتكون الطبقة العليا من متوسطة حجم المسام (850 ميكرون) عيون الذي يجمع أجزاء كبيرة ذبابة حين السماح من خلال الأجنة. تتكون طبقة السفلي من شبكة غرامة (75 ميكرون) الذي يجمع أجنة في حين ترك من خلال الخميرة والماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فرشاة الطلاء غرامة لنقل الأجنة التي تم جمعها في سلة جمع مصنوعة من أنبوب 50 مل وغرامة شبكة من النايلون. شطف الأجنة لفترة وجيزة مع الماء ثم صمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة في التبييض 50٪ مع يحوم طيف لمدة 3 دقائق. شطف شامللاي بالماء لإزالة أي مواد التبييض المتبقية. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة dechorionated في الأيزوبروبانول مع الإثارة لطيف لمدة 15 ثانية أو حتى انهيار كتل متعددة الجنين (هذا لا ينبغي أن تستغرق وقتا أطول من 30 ثانية). وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الأجنة في هيبتان لمدة 5 دقائق أثناء استخدام ماصة لتيار هيبتان أكثر من الأجنة لابقائهم معلق. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة مع تيارات من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS) تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (PBST) لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك سلة جمع ونقل الأجنة إلى جانب شبكة لأنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل PBST. عكس الأنبوب برفق لغسل الأجنة خارج شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شبكة من الأنبوب. وضع أنبوب في وضع عمودي، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية. ملاحظة: ما يقرب من 100-300ومن المتوقع لمجموعة 1 ساعة من قفص واحد ميكرولتر من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBST والاستمرار في أداء يشابك على الفور. </li></ol> 3. في الجسم الحي يشابك من الأجنة التي يتم جمعها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.2٪ الفورمالديهايد في PBST فورا قبل الاستخدام. إضافة 10 مل من تثبيتي الفورمالديهايد إلى الأجنة واحتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 10 دقيقة. تجاهل تثبيتي غير المستخدمة في نهاية اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد رد فعل يشابك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية يشابك، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل الفورمالديهايد. إضافة على الفور 10 مل من 0.25 M الجلايسين في PBST لإرواء رد فعل يشابك. احتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب. إزالة الحل إخماد. غسل الأجنة مع 10 مل من PBST ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما إزالة Pالحل غسل BST باستخدام ماصة. متجر الأجنة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol></li></ol> 4. إعداد نموذج البروتين ومناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس 500 ميكرولتر الأجنة crosslinked باستخدام الخالط Dounce في 2 مل العازلة تحلل (0.5 M اليوريا، 0.01٪ SDS، 2٪ تريتون X-100، 2 مم phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF] ومثبط البروتياز كوكتيل في برنامج تلفزيوني). ملاحظة: تنفيذ هذه والخطوات التالية في RT ما لم ينص على خلاف ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي والصخور بلطف على منصة دوارة لمدة 15 دقيقة لضمان تحلل شامل. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوية. حفظ طاف في أنبوب 15 مل نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر الخرز الاغاروز مكافحة HA الطين لطاف واحتضان على منصة دوارة لمدة 2.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ولكن ترك APPROximately 250 ميكرولتر في الأنبوب. resuspend والخرز في طاف المتبقية ونقل إلى عمود الدوران 1.5 مل مع 10 ميكرون فلتر المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران في 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل من خلال تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات بإضافة 200 ميكرولتر غسل العازلة (0.1 M الجلايسين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1٪ IGEPAL CA-630، 0.1٪ توين 20، في برنامج تلفزيوني). أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل غسيل. تكرار غسل مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر العازلة شطف (2 ملغ / مل HA-الببتيد في برنامج تلفزيوني) إلى الخرز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف كل 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وجمع شطافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد شطف للمجمع عن طريق التحليل الغربي لطخة استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة HA 13. </li></ol>

<ol>
	<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq.">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li><li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis.">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li><li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture.">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li><li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster.">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li><li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification,+but+not+for+posterior+patterning.">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li><li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+RNA-protein+granules:+insight+from+the+germline.">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li><li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organelles:+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline.">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor.">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes &amp; development. 24, 1876-1881 (2010).</li><li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+(U)-rich+motif+in+its+3.">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes &amp; development. 23, 2742-2752 (2009).</li><li>Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins.">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li><li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry.">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li><li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1.">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694 (2006).</li><li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation.">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد الفورمالديهايد يشيع استخدامها بوصفها كاشف يشابك لتحديد البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. حسن الذوبان ونفاذية غشاء الخلية، جنبا إلى جنب مع التوافق مع الإجراءات مطياف الكتلة المصب، وجعل الفورمالديهايد وكيل المرشح المثالي لتطبيقات الخلايا يشا...

يتم تنفيذ عزل التجمعات البروتين multisubunit والمجمعات الحمض النووي RNA أو البروتين لتحديد المجمعات البروتين، ومواضع الجيني معترف بها من قبل البروتينات التنظيمية ملزمة الحمض النووي RNA أو أهداف من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي. طرق مختلفة تسمح تحديد على نطاق الجينوم الحمض النووي من المواقع المعترف بها من قبل عوامل النسخ أو البروتينات لونين (رقاقة وما يليها) 1 وأهداف RNA يرتبط مع بروتين ملزمة الحمض النووي الريبي معين (CLIP وما يليها) 2. ثم يتم التسلسل عميق مكتبات cDNAs المستمدة من الحمض النووي الريبي DNA أو أهداف. استخدام هذه الأساليب الكيميائية أو عبر ربط لتحقيق الاستقرار في المجمعات تليها مناعي (IP) مع الأجسام المضادة ضد أحد مكونات البروتين من مجمع درس الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية. خلال تطوير كائن حي، وكثير من المجمعات البروتين تشكيل عابر. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحليل تكوين وظيفة هذه المجمعات في الجسم الحي لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديفelopment. ان مثل هذا التحليل في الجسم الحي تكون متفوقة على النهج في المختبر لأنه يكاد يكون من المستحيل لإعادة إنتاج تركيزات مواطن من مكونات التفاعل والبيئة البيوكيميائية الخلوية في المختبر. نحن هنا إثبات وجود في الجسم الحي النهج التي نستخدمها بنجاح لعزل البروتين المجمعات الكبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة. في هذه الطريقة، crosslinked المجمعات البروتين في الأجنة الحية مع تركيز منخفض من الفورمالديهايد، وبعد ذلك يتم عزل المجمعات البروتين من الفائدة عن طريق IP مع الأجسام المضادة ضد عنصر معروف من المجمعات تليها هلام تطهير المجمعات وتحليل الطيف الكتلي ل تحديد مكونات معقدة غير معروفة. منذ الفورمالديهايد قادرة على تتخلل غشاء الخلية ويبلغ مداه يشابك من 2،3-2،7 Å 3، مجمعات البروتين يمكن crosslinked في الجسم الحي، ويحتمل أن تكون قريبة من بعضها البعض في مكونات معقدة. في هذه المادة ونحنتصف هذه الطريقة باستخدام عزلة تيودور (TUD) بروتين معقد كمثال على ذلك. TUD هو بروتين سلالة الجرثومية وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية 4-7. هذا البروتين يحتوي على 11 المجالات TUD معروفة للتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينية الأخرى 8-10. في السابق، ونحن قد ولدت خط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر HA الموسومة الوظيفية TUD 5 وبالتالي، يتم استخدام محددة لمكافحة HA الأجسام المضادة لهدم مجمع TUD بعد يشابك. بالإضافة إلى crosslinks البروتين البروتين، يمكن أن الفورمالديهايد توليد النووي crosslinks حمض البروتين ويستخدم في التجارب رقاقة وما يليها. علاوة على ذلك، في ذبابة الفاكهة، في الجسم الحي مع يشابك الفورمالديهايد سمحت تحديد هدف الحمض النووي الريبي من البروتين RNA helicase فاسا 11. بينما في هذه المادة ونحن تصف طريقة لفي الجسم الحي يشابك وبورification المجمعات البروتين من أجنة ذبابة الفاكهة، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للكائنات والأنسجة الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Drosophila agar</td>
			<td style="width:235px;">Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">FLY-8020-1</td>
			<td style="width:289px;">Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">H5501</td>
			<td style="width:289px;">Other name: TEGOSEPT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Population cage</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">59-104</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fine nylon mesh</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">57-102</td>
			<td style="width:289px;">When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">D8938-1SET</td>
			<td style="width:289px;">Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td style="width:289px;">PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-HA agarose beads</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">The kit also includes HA-peptide and spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HA-peptide</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Prepare to 2 mg/ml with PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spin Column</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Spin columns are included as part of the kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP26324</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP151-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heptane</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">H350-4</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td>
			<td style="width:119px;">AM9625</td>
			<td style="width:289px;">Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP531-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0301</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0730</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">P7626-1G</td>
			<td style="width:289px;">Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">I8896-50ML</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP337-100</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">1475-0511</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:235px;">Clorox brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:289px;">Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Top layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1AK</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bottom layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1BA</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo crosslinking approach to isolate protein complexes from drosophila embryos

يتم التحكم في العديد من العمليات الخلوية عن طريق المجمعات البروتين multisubunit. كثيرا ما تشكل هذه المجمعات عابر وتتطلب البيئة المحلية لتجميع. لذلك، لتحديد هذه المجمعات البروتين وظيفية، من المهم لتحقيق الاستقرار لهم في الجسم الحي قبل تحلل الخلايا وتنقية لاحقة. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل كبير مجمعات البروتين حسن النية من أجنة ذبابة الفاكهة. ويستند هذا الأسلوب على permeabilization الجنين والاستقرار في المجمعات داخل الأجنة في الجسم الحي بواسطة يشابك باستخدام تركيز منخفض من الفورمالديهايد، والتي يمكن بسهولة عبر غشاء الخلية. في وقت لاحق، وimmunopurified مجمع البروتين من الفائدة تليها تنقية جل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. نحن لتوضيح هذه الطريقة باستخدام تنقية مجمع البروتين تيودور، وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية. تيودور هو بروتين كبيرة، والذي يحتوي على مجالات متعددة تيودور - الصغيرةالوحدات التي تتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينات المستهدفة. هذه الطريقة يمكن تكييفها لعزل المجمعات البروتين الأصلي من الكائنات الحية والأنسجة المختلفة.

وقد تم تحليل فعالية يشابك وتنقية الناجح للبروتين معقد TUD crosslinked بواسطة SDS-PAGE على 3٪ - 7٪ خطوة هلام (موضح في الشكل 1)، يليه لطخة غربية (الشكل 2). ويستند 7٪ هلام خطوة على الفصل الفعال للcrosslinked بروتين معقد TUD من البروتين ال...

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos at JoVE.com

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة.

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Research

JoVE Journal

Biology

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

16.6K Views.  Murray State University.  مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة. ...

Video: An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated بعد صفيف ، للكشف عن (mPADs) : نهج لعزل القوات الميكانيكية

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...