نشكر Gerbi سوزان سميث هايدي ، وديفيد لامبرت لتوريد مواد لاختبار داخل الجسم الحي على الطرد المركزي وcoprophila Sciara obsoleta Ilyanassa ، على التوالي. نشكر أعضاء Welte مختبر للتعليقات على هذه التقنية والمخطوطة. وأيد تطوير وصقل للفحص الطرد المركزي في الجسم الحي ، من خلال منح NIGMS GM64687 إلى MAW. الصور المبينة في الشكل. (1) والشكل. 5E ، نشرت سابقا F 2 ويتم طبع هنا بإذن.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

خطوات حاسمة تأكد من أن تركيز آغار مرتفع بما يكفي ، وإذا كان منخفضا جدا ، سوف تتفكك آغار خلال الطرد المركزي ، وسوف تنفجر الأجنة أو تكون موجهة بشكل عشوائي. إذا كان تركيز أغار قليلا فقط منخفضة جدا أو إذا كان آغار الرطب (إزالة المجفف غير كاف أو غير كاف لخدمات الدعم التقني في خطوة تتجاوز 4.3) ، سوف تطفو على الأجنة من جحورهم خلال الطرد المركزي وتصبح موجهة بشكل غير صحيح. إذا تم سكب آغار رقيقة جدا ، فإنه سيتم أيضا انهيار أو الكراك خلال الطرد المركزي. تأكد من أن الأجنة لم يتجاوز مراحل متقدمة cellularization ، وإلا سيتم فصل العضيات لا تعمل (الشكل 5C) منذ العضيات سيصبح معزولا داخل الآلاف من الخلايا الفردية. الأصغر في الأجنة في مرحلة خلية واحدة ، والعضيات أحرار لترحيل مسافات كبيرة وتتراكم وفقا لكثافتها مميزة. لتجنب تحليل الأجنة التي أصبحت قديمة جدا ، للتأكد من (ط) وتشمل مجموعة مسبقا للسماح للإناث لوضع البيض القديم (الخطوة 2.4) ، (ب) جمع الأجنة لمدة 3 ساعات أو أقل (الخطوة 2.5) ، (الثالث) حدد بصريا الأجنة قبل مراحل cellularization لتضمين في آغار (الخطوة 4.2) ، (د) الحفاظ على تضمين وقت قصير لمنع تطوير حتى نهاية cellularization (الخطوة 4.6) ، و (ت) تجاهل الأجنة التي لم طبقة بشكل صحيح (الخطوة 5.6) . لا تبخل على الوقت الطرد المركزي. الرغم من أن بعض الأجنة سوف تظهر طبقات لطيفة حتى بعد 10 دقائق فقط من الطرد المركزي ، والفصل غير متناسقة من الجنين الى الجنين. يدور 30 ​​دقيقة تعطي نتائج متسقة للغاية. أيضا ، كلما طال الوقت الطرد المركزي ، ويعد طبقات مستقرة بعد الطرد المركزي قد انتهت. وهذا أمر مهم لتلك التطبيقات التي يستغرق وقتا لمعالجة أجنة أخرى قبل استخدامها (على سبيل المثال ، إذا كانت بحاجة إلى معالجتها للتجارب زرع أو منصة لتحليل مبائر). التعديلات الممكنة البيض جمع وإزالة المشيماء بروتوكولات مختلفة وتوجد العديد من الخطوات ل2 و 3 1 ، 3 ، 9 ، وسيعمل كذلك على تلك الموصوفة هنا طالما ان الاجنة المستخدمة هي الشباب ، والغلة البيض عالية ، وجزء من سوء تم تصغير الأجنة مراحل. المحاذاة الأمامي الخلفي البروتوكول يوجه جميع الأجنة بحيث يتم دفن في نهاية الخلفي آغار ونهاية الأمامي متروك (الشكل 3). هذا التوجه هو جيد لالاتساق ، بحيث يصبح من الممكن استخدام micropyle كمعلم هذه الغاية وأشار في أثناء الطرد المركزي (الشكل 1 ، 5). ولكن مع الممارسة ، فمن السهل على اقتطاف التوجه للأجنة طرد من مظهر متميز للالحبرية ، وطبقات الدهون صفار بواسطة مشرق الميدان المجهري. ثم يصبح من الممكن تحميل الأجنة مع إما في نهاية المطاف ، وهذا يسرع من المرونة في عملية التركيب. Unoriented الطرد المركزي والجانب الأكثر استهلاكا للوقت وتحديا من الناحية التقنية من البروتوكول هو تركيب الأجنة في آغار (الخطوة 4). فهو يتطلب لمس كل جنين مرتين (مرة واحدة لإدراجه في حفرة واحدة لاستعادتها بعد الطرد المركزي). كبديل ، يمكن للمرء أن نقل الأجنة في الخطوة 4.1 في أنابيب مملوءة microcentrifuge خدمات الدعم التقني. عندما يتم طرد هذه الأنابيب في microcentrifuge (13،000 دورة في الدقيقة ، 10-30 دقيقة) ، والأجنة أيضا طبقة جيدا عادة 10-13. هذا الاختلاف يسمح احد لعملية مئات من الأجنة في الوقت نفسه بسرعة كبيرة. ومع ذلك ، طبقات ليست كما متسقة ؛ جزء من الأجنة لا تتطور طبقات متميزة على الرغم من قوى الطرد المركزي أعلى من ذلك بكثير (~ 16000 ز) من البروتوكول المعمول بها في أعلاه. أكثر تحديا يتمثل في حقيقة أن التوجه للأجنة غير متغير ، ويمكن للمرء ملاحظة الفصل في زوايا مختلفة لمحور الجنين كبيرا. هذا التغير يتطلب المجرب لفرز بعد الطرد المركزي كيف تم ترتيب خاص الجنين في أنبوب الطرد المركزي. مع استخدام صفار تألق ذاتي كعلامة للجزء الأكثر كثافة من الجنين ، وهذا غالبا ما يكون ممكنا ، على الرغم من أنه يتطلب قدرا كبيرا من التدريب ومزيد من الحكم على القيام بذلك بشكل صحيح. إذا كان هناك ما يكفي من الأجنة في العينة ، يمكن للمرء أن يكون قادرا على فرز تلك الحالات التي حدث لأجنة يتم ترتيبها كما في الشكل. 1. الطرد المركزي للأجنة في قشرة البيضة التي من الممكن تضمين الأجنة في الخطوة 4 للأجار دون إزالة المشيماء أول 2. في هذا النهج ، وتغطي الأجنة على لوحة جمع بزيت الهالوكربون بدلا من التبييض 50 ٪ في خطوة 3.2 (الهالوكربون يحول شفافة المشيماء). ويتم اختيار الأجنة في المراحل المناسبة ونقلها إلى لوحة آغار جديدة باستخدام الملقط ، عن طريق الاستيلاء فقط شعيرات بيض مع ملاقط ، الأضرار التي لحقتيتم تجنب المناسبة الجنين. هي جزء لا يتجزأ الأجنة كما في الخطوة 4.4 من خلال 4.8 ، مع شعيرات بيض الأمامية الشائكة للخروج من المأزق في أجار. إزالة قشرة البيضة قبل العلاج التبييض 50 ٪ بعد أن تم طرد الأجنة وحفرت من آغار كما في الخطوة 5.4. قد الطرد المركزي في وجود قشرة البيضة تحسين معدل devitellinization بعد التثبيت (الخطوة 6.2) ، ولكن اختيار الصحيح لمراحل الطرد المركزي (الخطوة 4.2) هو أكثر تحديا. تطبيقات الطرد المركزي جنين مفيد بشكل خاص للتجارب colocalization ، أي لاختبار ما إذا كان بروتين معين يموضع لعضية رئيسية معينة. على سبيل المثال ، كلار بروتين موجود فى وقت مبكر من قطرات الدهون الجنينية ، ولكن هذا التعريب هو تحدي لإثبات في أجنة سليمة. في جزء منه ، وذلك لأن كلا نقاط وكلار وقطرات الدهون وفيرة في محيط جنين 10 ، مما يجعل من الصعب colocalization زائفة يستبعد. ومع ذلك ، يركز الطرد المركزي قطرات الدهون في طبقة متميزة ، وبالتالي ، مع إشارة colocalization كلار يصبح من الواضح 10. وقد أثبت تحليل مماثل لا لبس فيه توطين بروتينات أخرى إلى قطرات الدهون 8 ، 13-15 ، بما في ذلك أمثلة من المستغرب مثل 2 و histones معينة في الحالات التي يكون فيها البروتين موجود بتواجد مطلق ولكن التخصيب على قطرات الدهون 8. كما يمكن اختيار الأجنة بصريا حسب المرحلة التنموية (الخطوة 4.2) ، فمن الممكن حتى للكشف عن تجنيد تنظيم تنمويا من البروتينات الشحمية إلى قطرات 8 و 15. مطلوب اختبار colocalization مع قطرات الدهون سهلة خصوصا منذ قطرات الدهون تتجمع في &quot;سقف&quot; متميزة بصريا ، لذلك لا مزيد من علامة أو وصمة لتحديد هذه الطبقة. في الواقع ، نظرا لسهولة ونتائجها المحتملة ضرب البصرية (الشكل 1 ، الشكل 5 D ، E) ، مختبرنا توظف هذه التقنية بشكل روتيني كما هو الحال الآن أول اختبار ما إذا كان بروتين المترجمة مرشح لقطرات الدهون. من حيث المبدأ ، يجب أن دراسات مماثلة colocalization عمل العضيات الأخرى المبينة في الشكل. 1 ، وعلى الأرجح للآخرين (بما في ذلك الطفيليات داخل الخلايا) الذي طرد في الأجنة التوزيع لم يتم توثيقها. منذ الطرد المركزي يركز العضيات في نطاقات ضيقة ، فإنه يسهل عزل جزء المخصب في هذه العضيات. وقد تم بالفعل استخدام هذا الأسلوب لاسترداد قطرات الدهون لزرعها في أجنة المانحة 2. قد يكون من الممكن أيضا أن تحليل كيميائيا الكسر المخصب (على سبيل المثال ، عن طريق خفض طبقات قبالة الأجنة بعد تثبيت 15). وصف الأسلوب هنا التطبيقات خارج أجنة ذبابة الفاكهة ، كما يمكن استخدام الطرد المركزي لتطبق على بيض الكثير من مختلف الأنواع (بما في ذلك الضفادع والديدان الخيطية ، الزقيات ، الحلقيات ، قنافذ البحر والرخويات ، والكائنات المجوفة) 16. في المختبرات الخاصة بنا ، ولقد استخدمنا بروتوكول أعلاه للحصول على أجنة للdomestica الذبابة الذبابة (2) واستخدمت الطرد المركزي unoriented في تحليل الأجنة من الفطريات coprophila Sciara قرسة (17) والقواقع Ilyanassa obsoleta 17. أخيرا ، لا يقتصر هذا الأسلوب على الأجنة : الطرد المركزي يمكن أن يكون من المفيد أيضا أن تطبق الخلايا الكبيرة الأخرى ، مثل البويضات (مثل ذبابة الفاكهة في 2 و 18 والصقلاب الشوائب Oncopeltus الحزمية 17). لعينات مختلفة ، وظروف الطرد المركزي الدقيق ضرورة أن يكون الأمثل : على سبيل المثال ، 10 دقيقة في 3000 ز كافية لتطبق بكفاءة أجنة domestica الذبابة 2 ، وإذا كان طرد لفترة أطول ، وتميل إلى الأجنة يتفكك خلال التثبيت وimmunostaining.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

استراتيجية كبرى لتنقية وعزل أنواع مختلفة من الخلايا والعضيات لفصلها عن بعضها البعض على أساس الاختلافات في كثافة مرتفعة. ومع ذلك ، عندما تتعطل الخلايا السابقة للبروتينات ، والعضيات الطرد المركزي في هذه البيئة غير الأصلية في كثير من الأحيان بشكل غير لائق عصا لبعضها البعض. نحن هنا وصف الأسلوب لالعضيات منفصلة في كثافة سليمة ، وأجنة ذبابة الفاكهة المعيشة. ويتم حصاد الأجنة في وقت مبكر قبل cellularization من الأقفاص السكان ، وتتم إزالة قواقعها البيض الخارجي عن طريق العلاج مع التبييض 50 ٪. ثم يتم نقل الأجنة إلى لوحة آغار الصغيرة وإدراجها في نهاية الخلفي الأولى ، إلى ثقوب صغيرة في رأسي آغار. وطرد لوحات تحتوي على أجنة مضمن لمدة 30 دقيقة في 3000g. وأغار يدعم الأجنة ويبقيهم في اتجاه محدد. بعد ذلك ، يتم حفرها الأجنة من آغار بإبرة حادة. الطرد المركزي يفصل العضيات الرئيسية في طبقات متميزة ، وهي الطبقات مرئية بسهولة عن طريق الحقل المجهري مشرق. وهناك عدد من علامات الفلورسنت متاحة لتأكيد نجاح الطبقية في الأجنة الحية. وسيتم إثراء البروتينات المرتبطة عضيات معينة في طبقة معينة ، مما يدل colocalization. يمكن استرداد طبقات الفردية للتحليل أو البيوكيميائية في زرع البيض المانحة. هذه التقنية قابلة للتطبيق لفصل عضية في الخلايا الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك البيض والبويضات من الأنواع المختلفة.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

نحن تصف طريقة لكثافة العضيات منفصلة في العيش<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة. هي جزء لا يتجزأ الأجنة في آغار وطرد. هذه التقنية غلة استنساخه فصل العضيات الرئيسية على طول المحور الأمامي الخلفي الجنين. هذه الطريقة تسهل التجارب colocalization والغلة الكسور عضية البيوكيميائية للتحليل والتجارب الزرع.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.4K Views.  University of Rochester. نحن تصف طريقة لكثافة العضيات منفصلة في العيش ذبابة الفاكهة الأجنة. هي جزء لا يتجزأ الأجنة في آغار وطرد. هذه التقنية غلة استنساخه فصل العضيات الرئيسية على طول المحور الأمامي الخلفي الجنين. هذه الطريقة تسهل التجارب colocalization والغلة الكسور عضية البيوكيميائي...

Video: In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...