وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي في الولايات المتحدة (CFF) من خلال اتحاد CFTR 3D هيكل. وقد تم تمويل TR قبل studentship المملكة المتحدة CF الثقة، وNC قبل studentship المملكة المتحدة BBSRC. نحن نعترف زملائنا في هيكل اتحاد CFF CFTR 3D لمساعدتهم وتقديم المشورة وللتصميم الدجاج تسلسل CFTR وتنقية به الأمثل كودون.

<ol>
	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية ولا المصالح المتضاربة المتنافسة الأخرى فيما يتعلق بهذا العمل.

وصفناها سابقا وسيلة لoverexpression من CFTR الفئران 14. منذ نشر هذا البروتوكول، أبدينا وتنقيته عدة orthologs مختلفة من CFTR باستخدام نفس النظام. جميع orthologs اختبار تنقيته حتى الآن بشكل جيد في المنظفات غاز البترول المسال، في حين أظهرت تنقية DDM مزيد من التباين عبر orthologs مختلفة (لا تظهر البيانات). يوضح هذه المرونة قوة النهج الخميرة: من الممكن أن يحجب العديد من بنيات مع سرعة النسبية في النظام لاختيار واحد لغرض معين. غسل microsomes الخميرة مع العازلة التي تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم قبل الإذابة مع نتائج DDM في إعداد صغرور أنظف ويقلل من الملوثات في مراحل لاحقة. هذه الخطوة غير ضرورية في البروتوكول غاز البترول المسال كما العينة CFTR النهائي هو&gt; 90٪ نقية دون غسل صغرور. وعلاوة على ذلك، وتنقية في DDM يتطلب عدة تعديلات على مخازن للذوبان وتنقية الثانية، وهي إضافة الجلسرين الزائدة والملح. معا، وهذه الإضافات زيادة كبيرة الربط من البروتين DDM solubilized إلى العمود. منهجية تنقية DDM لديه مجال للتحسين، لا سيما إزالة الملوثات الرئيسية 40 كيلو دالتون أن يحكم عليها مطياف الكتلة هو، وذلك بسبب الوحيدات الريباسي L3 الخميرة، والذي يظهر أن يكون هناك تقارب المتأصلة للالراتنج النيكل. ليس هناك تسلسل واضح في polyHis البروتين L3، ولكن فحص هيكل 3D به عند منضمة إلى الريبوسوم (PDB = 1FFK) يدل على أن L3 الوحيدات مطوية لديه كتلة polyHis المحتملة. أن هذه الفرقة هي أقل إثارة للمشاكل في مواد تنقية غاز البترول المسال قد يكون راجعا إلى أقسى المنظفات غاز البترول المسال. على الرغم من أن تنقية في DDM يبدو أن أفقر من أن في غاز البترول المسال والمنظفات أكثر اعتدالا مثل DDM قد يكون أكثر توافقا مع التحليلات الفنية والهيكلية وبالفعل تم استخدامها في العديد من البلورات بالأشعة السينيةدراسات ographic من البروتينات الغشاء 15-21. وعلاوة على ذلك، أشارت نتائجنا إلى أن استخدام غاز البترول المسال يؤدي إلى فقدان وظائف في أتباز CFTR النسبية لتنقية في DDM. وبالتالي فإننا نوصي بروتوكول تنقية القائمة على غاز البترول المسال لتوليد CFTR حيث نقاء أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال في تطبيقات مثل توصيف التعديلات بعد متعدية، أو في توليد الأجسام المضادة، وسيتم اختيار البروتوكول القائم على غاز البترول المسال . من ناحية أخرى في التطبيقات حيث النشاط والدولة الأم بالكامل من البروتين ضروري، فإننا نقترح البروتوكول القائم على DDM كخيار أفضل. على أن تبرم، يصف هذا البروتوكول طريقة استنساخه لعزل CFTR في المنظفات ثنائي الشحنة وهو LPG-14 أو المنظفات غير الأيونية DDM. على هذا النحو فإنه يشير إلى مجموعة أكبر من الظروف تنقية للCFTR من سبق وذكرت 10-13. بالإضافة مليغرام كميات CFTR تنقيته يمكن أن يكونتم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات عند دمجها مع نظام نمو الخميرة ارتفاع حجم مثل تخمير 20 L وقدرة عالية نظام حصاد الخلايا مثل 6 L سرعة منخفضة الطرد المركزي الدوار. وCFTR حصلت لديه علامة GFP شطورة الذي يسمح رصد سهل من البروتين في مختلف المقايسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. كاشف الموضحة في هذه المخطوطة (الدجاج المحتوية على البلازميد CFTR أو خلايا الخميرة المجمدة) ويمكن الحصول عليها من خلال مؤسسة التليف الكيسي (الولايات المتحدة الأمريكية).

التليف الكيسي (CF) هو اضطراب وراثي الأكثر شيوعا في أوروبا وأمريكا الشمالية مع حدوث حوالي 1 في 2،500 ولادة حية. يحدث عندما CF الطفرات في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) بروتين يسبب فقدان وظيفتها في الغشاء البلازمي للخلايا الظهارية 1. نتيجة أخطر من هذا العيب هو الضرر الرئة لا رجعة فيه، والذي يقصر العمر المتوقع للمرضى إلى &lt;40 سنة من العمر 2،3. CFTR هو الكاسيت ATP ملزم (ABC) نقل التي تطورت لتصبح 1،4 القناة الايونية. على الرغم من وظيفتها غيرت تماما في غشاء البلازما من الخلايا، فإنه لا يزال يحتفظ تناظر تسلسل كبيرة مع النقل ABC الأخرى. يثير الاهتمام والفضول، وأجزاء المتخصصة CFTR (أي منطقتها التنظيمية والتي وN-C-تيرميني) تبادل جود تشابه كبير مع تسلسل metazoan أخرى نقل ABC، وبالتالي ليست هناك أدلة إلى الأصول (ه) من هذه المتتاليات في CFTR. على أساس الهيكل الأساسي، وتصنف CFTR كعضو C-عائلة من عائلة نقل ABC، ولكن ليس هناك أدلة قوية على وجود صلة وظيفية المتبقية لهذه الأسرة الفرعية. كانت هناك بعض التقارير عن نشاط النقل الجلوتاثيون لCFTR 5-7، والتي سيكون متسقا مع أدوار أعضاء الأسرة الآخرين C-8،9، على الرغم من أن تقارير أخرى تشير إلى أن انخفاض الجلوتاثيون قد تمنع نشاط CFTR أتباز، بدلا من إظهار التحفيز التي يسببها الركيزة التي تميز النقل ABC 10. قياس أيون تصرف حساسة بما فيه الكفاية للسماح للقناة النشاط من الجزيئات CFTR واحد لدراستها 1 وتم رصدها خصائص القناة CFTR بوصفها وظيفة من الوقت ودرجة الحرارة، وتركيز ATP، غشاء المحتملة، والدولة الفسفرة، وكذلك في بحضور مجموعة من مثبطات جزيء صغير، potentiators، والمعدلات. هؤلاءوأضافت الدراسات أيضا إلى حد كبير في معرفتنا كيف تعمل شركات النقل ABC. ومع ذلك، فقد ثبت التعبير عن CFTR بكميات كبيرة وتنقية لاحقة لتكون تحديا من نوع خاص، وقد تم نجاح تقتصر على عدد قليل من المختبرات 10-13. الحاجة إلى تطوير عقاقير أكثر فعالية والضغط، ولكن تم عرقلة هذه العملية من خلال عدم وجود CFTR تنقيته لفحص الجزيئات الصغيرة. أن حل مشكلة التعبير CFTR وتنقية تمكين فحص المخدرات عالية الإنتاجية التي تهدف إلى تصحيح الخلل الأساسي في CF وسيفتح أيضا طريقا للدراسات الهيكلية عالية الدقة لإبلاغ تصميم الأدوية العقلاني. وعلاوة على ذلك، لا تزال حتى الخصائص الكيميائية الحيوية الأساسية نسبيا من البروتين، مثل حالته من oligomeric وظيفية، والبروتينات التفاعل والنشاط أتباز سيئة تتميز. لقد ذكرت سابقا بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من GFP وصاحب الموسومة CFTR الفئرانفي S. الخباز 14 والآن مزيد تصف بروتوكولات لتنقية CFTR. وقد استخدمنا هذه الطرق لتنقية خمسة orthologues من CFTR، والبيانات الحالية لتنقية CFTR الدجاج كمثال على ذلك. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا اثنين من المنظفات المتناقضة لاستخدامها في تنقية. دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) هو المنظفات غير أيوني التي استخدمت على نطاق واسع للدراسات الهيكلية والوظيفية على حد سواء من بروتينات الغشاء 15-21. المنظفات الأيونية 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1&#39;-RAC-الجلسرين) (LPG-14) هو كفاءة عالية في الانحلالية من CFTR وسبق استخدامها في تنقية البروتينات الغشاء وظيفية 10، 22،23، بما في ذلك تنقية CFTR من S. الخباز 24. &lt;/ ع&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

عيوب في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) البروتين يسبب التليف الكيسي (CF)، وهو مرض وراثي جسمي مقهور التي تحد حاليا متوسط ​​العمر المتوقع للمرضى إلى &lt;40 سنة من العمر. تطوير جزيئات المخدرات رواية لاستعادة النشاط من CFTR هو هدف مهم في CF العلاج، وعزل CFTR نشطة وظيفيا هو خطوة مفيدة نحو تحقيق هذا الهدف. نحن تصف طريقتين لتنقية CFTR من نظام تعبير مغايرة حقيقية النواة، S. الخباز. مثل أنظمة بدائية النواة، S. خميرة يمكن زراعتها في المختبر بسرعة وبتكلفة منخفضة، ولكن أيضا حركة المرور وposttranslationally يمكن تعديل البروتينات الغشاء كبيرة. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا رئيسينntrasting المنظفات لاستخدامها في تنقية تسمح إعداد CFTR النهائي ليكون متلائما مع التجارب المخطط لها في وقت لاحق. في هذه الطريقة، ونحن نقدم مقارنة تنقية CFTR في دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) و 1 tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1&#39;-RAC-الجلسرين) (LPG-14). البروتين المنقى في DDM بهذه الطريقة يظهر النشاط أتباز في المقايسات الفنية. البروتين المنقى في LPG-14 يظهر نقاء عالية والغلة، ويمكن استخدامها لدراسة التعديلات بعد متعدية، ويمكن استخدامها لأساليب الهيكلية مثل زاوية صغيرة تشتت الأشعة السينية والمجهر الإلكتروني. ومع ذلك فإنه يعرض أقل بكثير النشاط أتباز.

بروتوكول الموصوفة أعلاه هو وسيلة فعالة لعزل microsomes التخصيب CFTR، مع الانتعاش الكامل تقريبا CFTR خلال الكسر الخلية وإعداد microsomes الخام (الشكل 1). ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب الكسر الخلايا الأخرى على نحو فعال. لقد استخدمت خلية الفرنسية الضغط، وأجهزة high-pressure/cavitation الأخرى (كما في تركيبة مع التأثير ضد هدف روبي) مع كفاءة متساوية. لراحة والتكلفة الأولية المنخفضة من المعدات، نجد طريقة حبة الضرب أفضل. استخدام غاز البترول المسال إلى ذوبان وتنقية البروتين CFTR أسفرت عن 80 ميكروغرام / لتر في الثقافة&gt; 90٪ النقاء (الشكل 2). كانت عالية الغلة بسبب الانحلالية كفاءة CFTR بواسطة غاز البترول المسال (قارن الشكل 2B، ممرات 2 و 4). بالإضافة إلى ذلك، أدت كفاءة وضيق ملزمة لعمود في فقدان الحد الادنى من CFTR في جزء غير منضم وعدم وجود CFTR في الكسور غسل (الشكل 2، الممرات 3، 5، و6). كان البروتين مزال نقاء&gt; 90٪، حسب تقدير Coomassie الملون والمواد الهلامية SDS-PAGE واستخدام قياس كثافة من CFTR والعصابات الملوثة. هلام اللوني تخلل (المؤتمر الشعبي العام) فصل CFTR-تنقية غاز البترول المسال من الملوثات منخفضة الوزن الجزيئي (الشكل 4، اللوحة السفلى). بروتوكول لتنقية CFTR باستخدام DDM يعطي نقاء حوالي 60٪ والعائد من ما يقرب من 50 ميكروغرام / لتر (الشكل 3). وأظهرت الإلكترون المجهري (EM) الكسور ملطخة سلبا من المؤتمر الشعبي العام يبلغ حجمه حوالي 10 مل (الشكل 4) أن CFTR DDM تنقيته-يحتوي على مجاميع من 20-30 نانومتر قطر فضلا عن جسيمات أصغر من 10 نانومتر قطرها (لا تظهر البيانات). فمن الممكن أن المجاميع الصغيرة يمكن ربط عكسية وفصل كما الفائق مع 1 MDA وقف انتاج المواد الانشطارية تصفية فشلت في إزالة الركام EM-كشفها. لم مواد تنقية غاز البترول المسال لا كثف لشبكة-تفريغها توهج، وبالتالي تم دراستها من قبل البرد EM الكسور غير ملوثين. وأظهرت هذهيبلغ عدد سكانها الجسيمات متجانسة جدا من حجم صغير نسبيا (6-8 نانومتر قطر، لا تظهر البيانات). أخيرا، تم قياس النشاط أتباز من البروتينات تنقيته (الشكل 5). كعضو في الأسرة البروتين ABC، CFTR اثنين من المجالات ملزمة النوكليوتيدات (NBDs) قادرة على الربط و / أو hydrolyzing ATP. وتشير البيانات إلى أن البروتين النقي لم يكن قادرا على يتحلل ATP في دولة LPG solubilized وأظهرت ضعف النشاط أتباز بحضور DDM (الشكل 5 والحانات شاغرة). بعد إضافة الدهون، وإزالة المنظفات، كان النشاط أتباز 4 أضعاف للعينات التي تم تنقيته في DDM (13 نانومول ATP / دقيقة / ملغم بروتين). إضافة الدهون وإزالة غاز البترول المسال النشاط استعادة بالمثل لCFTR التي تم عزلها باستخدام غاز البترول المسال، ولكن مع انخفاض سعر النهائي (1.5 نانومول ATP / دقيقة / ملغم بروتين) من المادة DDM تنقيته والمعاد. <img alt="الشكل 1"FO: محتوى العرض = &quot;5IN&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. رصد مستويات CFTR الدجاج في المحللة الخلية (CL)، supernatants (S) والكريات (P) خلال مختلف الخطوات الطرد المركزي المستخدمة لعزل صغرور والغسيل. كانت تصور المواد الهلامية SDS-PAGE باستخدام مضان في جل من GFP العلامة. طاف بعد الكسر الخلية والطرد المركزي في 14،000 XG يحتوي تقريبا كل CFTR (بما في ذلك المنتجات تدهور). تنبيذ فائق في الرواسب 200،000 x ج جميع بالطول CFTR ترك بعض شظايا في طاف. تنبيذ فائق في 100،000 x ج لغسلها الملح microsomes الكريات ما يقرب من جميع CFTR مع إزالة بعض أجزاء أخرى. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> وقد تم تحليل الشكل 2. تنقية CFTR الدجاج في غاز البترول المسال من قبل يجمد اللوني المعادن أيون تقارب. الكسور بواسطة SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie (اللوحة العليا) والكشف عن مضان من العلامة GFP (اللوحة السفلى). المسارات: (1) Microsomes. (2) microsomes-solubilized LPG. (3) مواد غير منضم. (4) المواد غير القابلة للذوبان. (5) &amp; (6) 40 و 100 ملي إيميدازول يغسل. (7) مزال المواد مع 400 ملي إيميدازول. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> وقد تم تحليل الشكل 3. تنقية CFTR الدجاج في DDM بواسطة يجمد اللوني المعادن أيون تقارب. الكسور بواسطة SDS-PAGE تليها Coomassie تلطيخ. يظهر لوحة اليد اليسرى الكسور قبل شطف. وتظهر العديد من الكسور شطف متتالية في لوحة اليد اليمنى مع CFTR فيdicated بواسطة السهم. يتم إثراء الكسور في وقت لاحق في 40 كيلو دالتون الملوثات، والتي تم تحديدها من قبل مطياف الكتلة كما البروتين الريباسي L3. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> وكان الرقم 4. تنقية CFTR الدجاج هلام تخلل اللوني مركزة. CFTR تنقيته بواسطة ني تقارب اللوني وتطبيقها على عمود المؤتمر الشعبي العام. الملف الشخصى للشطف CFTR (اللوحة العليا) في تنقية العازلة التي تحتوي على غاز البترول المسال-14 (خط الصلبة) أو DDM (خط متقطع) يتم مضافين. كشفت SDS-PAGE (اللوحة السفلى) أن CFTR مزال ما بين 8 و 11 مل. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> الرقم 5. activit أتبازكان يعاير ذ تنقية الكسور CFTR الدجاج. البروتين المنقى في DDM أو غاز البترول المسال باستخدام مقايسة تعديل شيفليت 26 في وجود مزيج من مثبطات أتباز للقضاء على أي نشاط أتباز الخلفية من نوع V-ATPases (الحانات شاغرة F، P-و ). كما تم قياس معدل ATP التحلل بعد إزالة المنظفات وإضافة الدهون (تملأ القضبان). يظهر المؤامرة الانحراف المتوسط ​​والمعياري (ن = 3). الاختلافات بين القيم المتوسطة للنشاط أتباز في حضور وغياب الدهون، والفرق بين النشاط في DDM وغاز البترول المسال هي كبيرة ع &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

تعبير مغايرة وتنقية التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) هي تحديات كبيرة والعوامل التي تحول دون تطوير علاجات المخدرات للكشف عن التليف الكيسي. يصف هذا البروتوكول طريقتين لعزل كميات مليغرام من CFTR مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية.

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K Views.  University of Manchester.  تعبير مغايرة وتنقية التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) هي تحديات كبيرة والعوامل التي تحول دون تطوير علاجات المخدرات للكشف عن التليف الكيسي. يصف هذا البروتوكول طريقتين لعزل كميات مليغرام من CFTR مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية. 

Video: Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...