ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kerscher لدعمهم. نشكر كافة Hochstrasser للخميرة سلالة MHY3765. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1051970 (إلى OK) ومعهد هوارد هيوز الطبي الجامعية منحة السفر ومونرو علماء برنامج منح (لES).

تنقية البروتينات 6xHIS الموسومة أعرب في خلايا الخميرة في مهدها في ظل ظروف الأم 1. نمو خلايا الخميرة وتحريض من بروتين تعبير (تم التعديل من 2) اختياري: استخدم غاريثمي تزايد الثقافات الخميرة معربا عن بروتين من الفائدة بدلا من الثقافات الجالاكتوز التي يسببها هو موضح أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا من غال + سلالة الخميرة مع ترميز البلازميد والجالاكتوز محرض 6xHIS الموسومة البروتين في الاختيار. على سبيل المثال، انظر قائمة الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم transformants في 5 مل من وسائل الاعلام انتقائية مناسبة (مثل SD-اليوراسيل) التي تحتوي على 2٪ سكروز. احتضان عند 30 درجة CO / N، بالتناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع O / N الثقافة بحيث الكثافة البصرية في 600 نانومتر يقيس 0.3 (OD 600 = 0.3) في 33 مل من وسائل الإعلام الانتقائي مع 2٪ سكروز. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية، والهز (Δ150 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى ثقافة OD 600 = 0.8<html> -1.5، لحث تعبير عن البروتين المطلوب وذلك بإضافة 17 مل من YEP 3x مع اللبن 6٪ (وصفة في الجدول رقم 1)، لتركيز النهائي من 1X YEP مع 2٪ سكر اللبن. اجمالى حجم الثقافة هي الآن 50 مل. احتضان، والهز، عند 30 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة إضافية. ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم الثقافة. في الخطوة 1.3، مخفف إلى ثلثي الحجم النهائي المطلوب. في الخطوة 1.4، إضافة ثلث الحجم النهائي من 3X YEP / 6٪ سكر اللبن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من ثقافة يسببها وأجهزة الطرد المركزي Δ150-200 OD 600 وحدة من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة PBS 1X 1X مع البروتيني كوكتيل المانع ونقل إلى 2 مل المسمار أنبوب الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. طاف صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل، تليها تحلل فوري الخلية أو تخزين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol>&gt; 2. تجانس خلايا الخميرة واستخراج البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الخلية بيليه المجمدة من الخطوة السابقة، إضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي حمض غسلها و 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الجليد الباردة (وصفة في الجدول 1 أو استخدام العازلة تحلل الخلية من خيار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة. غير مطلوب ل resuspend تماما بيليه الخلية. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات. ملاحظة: قد يكون خفض نهاية غيض ماصة قبالة قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 4 درجات مئوية، ووضع أنبوب (s) مع الخلايا في مطحنة حبة، والتوازن، وقفل، وتشغيل الجهاز وفقا للتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الخافق حبة تحتوي على أنبوب (ق) لمدة 20 ثانية في 5.5 متر / ثانية، ثم ضع على الجليد ذائب لمدة 1 دقيقة. كرر 6X في المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح البروتينات المستخرجة بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. اختياري: إزالة الجسيمات الصغيرة بواسطة الطرد المركزي من خلال مرشح SPINX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينة من كل خلية هxtract (WCE) لتأكيد وجود هذا البروتين من الفائدة عن طريق البقعة الغربية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة WCE المقابلة مع 2 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال 5 ميكرولتر من استخراج تطهيرها إذا كانت تحصد 200 OD 600 وحدة من الخلايا) إلى 800 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور 20٪ (TCA). دوامة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 800 ميكرولتر من 2٪ TCA لبيليه ودوامة الأنبوب، تليها الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من عينة العازلة TCA (وصفة في الجدول رقم 1)، دوامة بحل بيليه. ملاحظة: إذا أصبح عينة العازلة الحمضية (يتحول إلى اللون الأصفر) بعد بالإضافة إلى بيليه، إضافة aliquots من Δ10 تريس قاعدة ميكرولتر [1M] حتى تكون العينة الأزرق مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في ° C بلوك 100 حرارة لمدة 2-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة AGعين بحل تماما إذا بقايا بيليه لا تزال موجودة. الكريات بواسطة هذه الطريقة هي إعداد المعروف أن من الصعب حل تماما. قد يستغرق Δ10 دقيقة من vortexing للتذوب تماما الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة تجميد aliquots من المتبقية WCE تطهيرها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol> 3. تنقية البروتينات من دفعة الخليط خلية الخميرة ملاحظة: تم تحسين هذا الأسلوب تنقية لتنقية البروتينات 6xHIS الموسومة على التعاون 2 + راتنج تقارب المعدن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة الراتنج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينة من WCE تطهيرها أعدت من Δ20 OD-40 600 وحدة من الخلايا، إضافة 50-100 ميكرولتر من الراتنج التقارب إلى أنبوب microcentrifuge. البروتينات المستخرجة من الخلايا التي لم تعبر عن البروتين المطلوب أو الراتنج غير محددة، مثل أميلوز، ويمكن استخدامها لمكافحةو للربط غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج 5X مع 1 مل من غسل العازلة: عكس من أعلى إلى الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، ثم تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف. ملاحظة: إذا كان أداء استخراج وتنقية في نفس اليوم، موازنة الراتنج يمكن أن يؤديها قبل الاستخراج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجليد البروتين لتنقية تقارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100-200 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (Δ20 OD-40 600 وحدة) إلى 50-100 ميكرولتر الخرز غسلها، وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 مل مع العازلة تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الإيماءة أو الهزاز في 4 درجات مئوية لمدة 2-5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، توفر عينة من طاف المتبقية لتحليلها لاحقا من البروتينات غير منضم. TCA تترسب على النحو المفصل أعلاه لWCE (الخطوة 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع بروتينات محددة 5X مع 1 مل من غسل العازلة، تليها تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في4 ° C. الاحتفاظ بعينات الباردة خلال يغسل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف من البروتينات ملزمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر العازلة شطف إلى الراتنج، nutate عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف في أنبوب جديد. اختياري: كرر 2X وelutions بركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينة مزال لطخة غربية: ل25 ميكرولتر من البروتينات مزال، إضافة 25 ميكرولتر 2X ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS) عينة العازلة مع 2 ميكرولتر β-المركابتويثانول (BME)، واحتضان في درجة مئوية كتلة الحرارة 100 لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: يمكن أيضا معيار 2X Laemmli العازلة عينة يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة تجميد الزائدة بروتين مزال في النيتروجين السائل. اختياري: قطاع المتبقية البروتينات من راتنج مع حجم مساو من 2X العازلة عينة LDS عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة البروتينات LDS-مزال إلى أنبوب جديد، ثم إضافة 2 ميكرولتر BME إلى البروتينات مزال، وليس على الراتنج. هذا النظام هو لمنع إزالة أي الأيونات أو الأجسام المضادة التي هي conjugaتيد لالخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات في مخزن -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطخة غربية والتحقيق مع الأجسام المضادة المناسبة لتصور البروتينات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10-20 ميكرولتر (Δ1-3 OD 600 وحدة) لكل عينة و3-10 ميكرولتر من سلم البروتين في هلام SDS-PAGE في الاختيار. المواد الهلامية تستخدم بشكل روتيني لهذا البروتوكول وتشمل 4-12٪ مكرر تريس و 8٪ تريس، جليكاين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام في 200 V لمدة 50 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء PVDF عن طريق التحويل شبه الجافة في 19 فولت لمدة 20-30 دقيقة (وصفة في الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء كتلة في 4٪ milk/1x تريس مخزنة المالحة توين (TBST) لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C (وصفة في الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية للبروتين حاتمة الموسومة من الفائدة في 4٪ milk/1x TBST لمدة 1-3 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل غشاء 3X لمدة 5 دقائق مع كل TBST 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع المناسبةالبيروكسيداز الفجل الثانوية (HRP)، مترافق الضد لمدة 1-3 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل غشاء 3X لمدة 15 دقيقة في كل من كمية كبيرة من TBST 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي الغشاء مع الركيزة ECL والتفاف ساران في التفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح غشاء لفيلم وتطوير لتصور البروتينات. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويركز هذا البروتوكول على إعداد سليمة، والأم، وتعديلها بعد translationally البروتينات من خلايا الخميرة في مهدها لتطبيقات أسفل تيار. قبل محاولة هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف عن البروتين بسهولة في مقتطفات أعدت في ظل ...

قوة رهيبة من الخميرة علم الوراثة هو الأسطوري، ولكن إعداد وتحليل البروتينات الأم من الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، غالبا ما يكون محفوفا بالمشاكل. ويرجع ذلك إلى قوة ميكانيكية كبيرة ومرونة جدار خلية الخميرة 1 هذا الأخير. وقد وصفت وسائل مختلفة لالأنزيمية والكيميائية والميكانيكية، والقائم على الضغط تعطيل خلايا الخميرة للحصول على مستخلص بروتين كامل الخلية 2-6. هذه التقنيات تختلف على نطاق واسع في فعاليتها لانتاج الخلايا ممثل وعصائر البروتين الأصلية التي يمكن استخدامها لتحليلات لاحقة أو خطوات تنقية. على سبيل المثال، يمكن إزالة جدار خلية الخميرة مع الانزيمات التحللي (على سبيل المثال zymolyase) والناتجة spheroblasts يمكن أن تتعطل عن طريق القص والمنظفات، أو تحلل التناضحي للافراج عن البروتينات. واستخدمت هذه الطريقة بنجاح كنقطة انطلاق لكثير من fractionations التحت خلوية ولكنه يتطلب حضانات مطولةغير متوافقة مع استقرار بعض البروتينات 7. الملكية الكواشف تحلل الخميرة (مثل المنظفات) لاستخراج المواد الكيميائية للبروتينات من خلايا الخميرة متاحة تجاريا ولكن فعالية هذه الكواشف في استخراج البروتين وتأثيرها على توصيف البيوكيميائية لاحقة من البروتينات ليست دائما واضحة 8. المجانسة ارتفاع الضغط، وغالبا ما يشار الى المطابع الفرنسية، وكسر على نحو فعال خلايا الخميرة عن طريق إخضاع الأول لهم لضغط عال ومن ثم ينبثق منها من خلال فتحة صغيرة في خلية الضغط. هذه التقنية تنتج مقتطفات جودة عالية ولكن معدات مكلفة للغاية، وربما لا تكون مناسبة لكميات صغيرة من الخلايا أو عينات متعددة 9. ولذلك، تعطل ميكانيكي لخلايا الخميرة في طاحونة حبة وغالبا ما يكون الأسلوب المفضل لأصلي الاستعدادات بروتين الخميرة 10. هذا الأسلوب الذي ينطوي على اضطراب الميكانيكية للجدار خلية الخميرة مع حمض واتسليط الخرز الزجاجي، والتي يمكن أن تتم مع مجموعة متنوعة من الهزازات، vortexers أو المطاحن حبة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في وقت واحد لمعالجة عدة عينات أصغر (1 مل من الخلايا أو أقل). العديد من حبات مختلفة أو حبة مصفوفات اضطراب مطحنة هي الآن متاحة تجاريا لتعطيل أي تقريبا نوع من نوع من الخلايا في أنابيب 2 مل. النظر في التقنيات والمعدات الأخرى، طاحونة حبة لديه ميزة إضافية أن تعطل من خلايا الخميرة يحدث سريع جدا، مما يساعد على الحفاظ على التعديلات بعد متعدية مثل sumoylation، وخصوصا عندما تستخدم المخازن المؤقتة المناسبة مع الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات proteasome و ويتم التحكم في درجة الحرارة من مقتطفات. ويركز هذا البروتوكول على استخراج سريع، فعال، وموثوق بها من البروتينات الذاتية والإفراط في المعبر عنه في ظروف لطيف مع الهدف النهائي المتمثل في الحفاظ على وظيفة البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية. وسائط النمو، العازلة تحلل الخليةيتم تحسين التراكيب، وإعدادات طاحونة حبة للحفاظ على تفاعلات البروتين والتعديلات بعد متعدية مثل sumoylation وubiquitylation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

التجانس بالضرب حبة هو وسيلة سريعة وفعالة لإطلاق سراح DNA، RNA، البروتينات، ونواتج الأيض من خلايا الخميرة في مهدها، والتي من الصعب بمكان أن يتم تعطيل. نحن هنا وصف استخدام الخالط طاحونة حبة لاستخراج البروتينات في مخازن الأمثل للحفاظ على وظائف، والتفاعلات والتعديلات بعد متعدية من البروتينات. تزرع الخلايا المتنامية غاريثمي التعبير عن بروتين من الفائدة في وسائط النمو السائل في الاختيار. يمكن استكمال وسائل الاعلام النمو مع الكواشف للحث على التعبير البروتين من المروجين محرض (مثل اللبن)، وتزامن مرحلة دورة الخلية (مثل نوكودازول)، أو تثبيط وظيفة proteasome و(على سبيل المثال MG132). الخلايا ثم مكعبات ومعلق في منطقة عازلة مناسبة تحتوي على الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات إنزيم الفوسفاتيز وإما معالجتها فورا أو تجميدها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ويتم إنجاز تجانس من قبل ست دورات من 20 ثانية BEAD-الضرب (5.5 متر / ثانية)، تليها كل واحد الحضانة دقيقة على الجليد. يتم مسح جناسة الناتجة بواسطة الطرد المركزي، ويمكن إزالتها عن طريق الترشيح الجسيمات الصغيرة. وعجلت الناتجة تطهيرها استخراج خلية كاملة (WCE) باستخدام 20٪ TCA للتحليل المباشر من مجموع البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الغربية النشاف. مقتطفات هي أيضا مناسبة لتنقية تقارب من بروتينات معينة، والكشف عن التعديلات بعد متعدية، أو تحليل البروتينات شارك في تنقية. كما هو الحال بالنسبة لمعظم بروتوكولات تنقية البروتين، قد تكون بعض الانزيمات والبروتينات تتطلب الظروف الفريدة أو التراكيب العازلة لتنقية والبعض الآخر قد يكون غير مستقر أو غير قابل للذوبان في إطار الشروط المنصوص عليها. في الحالة الأخيرة، يجوز للبروتوكول المعروضة توفير نقطة انطلاق مفيدة لتحديد تجريبيا أفضل استراتيجية حبة الضرب لاستخراج البروتين وتنقية. نقدم لك مجموعة من استخراج وتنقية حاتمة الموسومة السومو E3 يغاز، Siz1، دورة الخليةتنظم البروتين الذي يصبح كلا sumoylated وفسفرته، فضلا عن السومو استهداف اليوبيكويتين الوحيدات يغاز، Slx5.

نتائجنا ممثل تكشف عن أن بروتوكول استخراج حبة الضرب والبروتين وصف مفيد لإعداد استنساخه من البروتينات لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب (تلخيصها في الجدول رقم 2). SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie من WCEs تبين أن مجموعة واسعة من البروتينات (~ 12 ل&gt; 250 كيلو دالتون) ويمكن استخر...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  The College of William & Mary.  إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متع?...

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

البروتين تنقية تقنية تسمح الكشف عن Sumoylation وUbiquitination من الناشيء الخميرة الحيز الحركي البروتينات Ndc10 وNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...