يحدد هذا البروتوكول تحضير الصفائح الزجاجية لخلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. وهذا يتيح المراقبة المباشرة للمعلومات الهيكلية التفصيلية حول كيفية تسبب الطفيلي في الملاريا. يسجل التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد معلومات عالية الدقة حول الدواخل الداخلية.
إنه قوي بما يكفي لمراقبة مجمعات البروتين المفردة في الموقع ، والتي يمكن استخلاصها حسابيا ومتوسطها للكشف عن معلومات هيكلية ثلاثية الأبعاد حول البروتينات. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع أنواع الخلايا المختلفة ويمكن أن يكون نقطة انطلاق لشخص جديد في إنتاج الصفائح الزجاجية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. هذه هي أليخاندرا كارباجال، التي ستنفذ البروتوكول اليوم.
للبدء ، قم بفحص الشبكات النحاسية المجمدة باستخدام CryoStage للحصول على مجهر ضوئي مع إيلاء اهتمام خاص لتدرج الجليد عبر الشبكة. تحقق من مربعات الشبكة الفردية لتغطية الخلايا في المناطق الرقيقة من الجليد. استخدم علامة سوداء لا تمحى لتحديد الجزء الأمامي والجانب الآخر من جنوط Autogrid الخاصة ب Cryo-FIB-SEM.
قم بتحميل الشبكة المقطوعة في مكوك Cryo-FIB-SEM مع رفع جانب الكربون لأعلى ، وقم بتطبيق طبقة دوارة من الكربون أو البلاتين بسمك أربعة نانومتر على سطح الخلايا. قم بتحميل المكوك في Cryo-FIB-SEM وقم بتقييم توزيع الخلايا على كل شبكة بواسطة SEM عند خمسة كيلوفولت. ألق نظرة عامة على التكبير المنخفض عند 100 طاقة لإلقاء نظرة على التدرجات الجليدية عبر الشبكة.
ثم التقط صورا تكبيرا أعلى عند طاقة 5000 للنظر إلى مربعات الشبكة الفردية. ضع طبقة من البلاتين العضوي 2 ميكرومتر على سطح كل شبكة عن طريق إدخال إبرة نظام حقن الغاز في الغرفة فوق الشبكة وتسخين مصدر البلاتين العضوي إلى درجة حرارة محددة لفترة محددة لإنتاج تدفق بخار. لمراقبة العينة ، قم بإمالة العينة بحيث يكون مستوى الشبكة حوالي 10 درجات من زاوية سقوط الحزمة الأيونية ، وحرك مركز مربع شبكة مناسب ليتم رؤيته في كل من صور SEM و FIB.
باستخدام الحزمة الأيونية عند التيار المنخفض ، مسح الشبكة عند تكبير عال لتصور الخلايا في مركز مربع الشبكة. حدد نمطين مستطيلين للطحن ، أحدهما فوق والآخر أسفل منطقة محمية بسمك ثلاثة ميكرومترات. ثم اختر إعدادات الشعاع وقم بتصحيح الاستجماتيزم عن طريق ضبط السطوع والتباين.
بعد اكتمال الإعداد ، ابدأ الطحن بتيار 300 بيكوأمبير أثناء مراقبة التقدم المباشر في عرض الحزمة الأيونية وبشكل متقطع بواسطة SEM. يتم فحص العينة في عرض SEM ، وبعد الطحن الأول ، إذا لم يخترق شعاع الأيونات العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية ، فقم بإزالة المزيد من المواد عن طريق زيادة ارتفاع الأنماط المستطيلة. توقف عن الطحن عندما يكون السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما في عرض الحزمة الأيونية.
كرر عملية الطحن خطوة بخطوة ، مع تقليل تيار الحزمة الأيونية في كل مرة حتى يتم الوصول إلى سمك 300 نانومتر. سجل موضع X Y Z لكل صفيحة. لتلميع الصفائح في نهاية التجربة ، استخدم نظرة عامة على SEM منخفضة التكبير لتحديد مجموعة من الصفيحة المراد صقلها ووضع علامة على جذر التلميع.
بمجرد وضع علامة على جذر التلميع ، قلل المسافة بين النمطين المستطيلين إلى 100 إلى 200 نانومتر وابدأ التلميع عند تيار شعاع أيوني يبلغ 30 بيكوأمبير. مراقبة التقدم من قبل SEM في اثنين إلى ثلاثة كيلوفولت. توقف عن التلميع عندما يفقد التباين في الصفيحة بواسطة SEM أو عندما يبدأ معطف البلاتين العضوي أو الصفيحة نفسها في فقدان النزاهة.
احصل على صور SEM منخفضة التكبير لكل صفيحة واحفظها. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة المكوك من المجهر. إزالة الشبكات مع الصفائح وتخزينها تحت النيتروجين السائل.
تعامل مع الشبكات بعناية. لدراسة التشكل ، تم إيقاف الفصام في مراحل مختلفة من الخروج باستخدام المركب الثاني في مثبطات E-64. في وجود المركب الثاني ، كانت الحدود بين الأغشية الطفيلية والهيموجلوبين المحيط في خلية الدم الحمراء المضيفة محددة جيدا.
كانت الفجوة الطفيلية السليمة ، أو PVs ، معبأة بالميروزويتات في مجموعة واحدة من بلورات الهيموزوين. عندما تم غسل مركبين متزامنين في E-64 ، تمزق الغشاء الكهروضوئي وانتشرت الميروزويتات داخل كرات الدم الحمراء. يوضح مثال نموذجي للتوزيع الجيد للخلايا على شبكة نحاسية خلايا دم حمراء كبيرة ذات محيط محدد جيدا وغشاء فجوة عصاري سليم.
داخل خلية دم حمراء مضيفة منهارة جزئيا ، تم تصور الميروزويتات الفردية على أنها مجموعات خلايا صغيرة. كان لكل شيزونت بقعة سوداء في مركزها تشير إلى موضع بلورات الهيموزوين. بعد الطحن ، تم تحميل الشبكات في TEM لتحديد مواقع الصفائح وإيجاد مناطق مناسبة لاستهدافها بالتصوير المقطعي.
في الصورة المجهرية للعينة ، يمكن رؤية كرات الدم الحمراء التي غزاها الميروزويت مؤخرا. يمكن رؤية الميروزويت المحاط بالغشاء المشتق من الخلية المضيفة داخل حدود كرات الدم الحمراء. في النهاية القمية للميروزويت، كان الأغشية المحيطان بالخلية والأغشية الأربعة المكدسة في قمة الميروزويت المرتبطة بميزة كثيفة الإلكترون على شكل فطر مرئية بوضوح.
داخل سيتوبلازم الميروزويت ، تم تحديد حدث اندماج بين غشاء بلازما الميروزويت وحويصلة متعددة الطبقات. في تحليل TEM إضافي لصحيلة بسمك 230 نانومتر ، لوحظ التشكل النموذجي للميروزويت الناضج المعالج ب E-64. داخل غشاء خلايا الدم الحمراء ، يمكن رؤية غشاء بلازما الميروزويت مع عضيات مثل مركب الغشاء الداخلي ، والحلقات القطبية ، والميكرونيمات ، والجذور ، والغلاف النووي.
الجزء الأكثر أهمية في هذه التقنية هو تحسين الشبكات لتمكين الإنتاج القابل للتكرار والفعال للصفائح الرقيقة. وسيمكن المزيد من التطوير لهذه التقنية الباحثين من تصور جزيئات البروتين الواحد داخل طفيليات الملاريا وتحديد دورها في خروج الملاريا.
