تم توفير التمويل من قبل &quot;PROGETTO على كونكورسو FONDAZIONE IRCCS أسبيدال ماجيوري Policlinico 2009-2010&quot; لدكتوراه في الطب، وAssociazione بامبينو Nefropatico ABN ONLUS، ميلانو

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح الحالية الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية وتم مراجعتها والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية من جامعة ميلان والوطنية. 1. عزل بانيات الابتدائية الأسلوب، مع تعديلات طفيفة، يتبع الإجراء التي وصفها دوديج وآخرون 14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هضم المتوسطة، وذلك بإضافة 0.1٪ كولاجيناز P و 0.05٪ التربسين (بدءا من 2.5٪ التربسين 10X، لا أحمر الفينول) لHBSS المتوسطة (هانكس محلول الملح المتوازن، لا الكالسيوم، المغنيسيوم، أو أحمر الفينول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفئران القديمة 3-4 يوم (يمكن تطبيق الإجراء لبضعة مثل الماوس 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية بقطع الرأس. رذاذ الرأس مع الايثانول 70٪ والحفاظ على الجليد. إزالة طبقات الجلد والعضلات بواسطة ملاقط وتشريح / مقص جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة العظام الجداري وتفصل بينهما باتباع الدرز السهمي إلى نصفين. تأكد من العظام هي خالية من أي نوع من الأنسجة والخيوط ملتصقة ووضع قطعة عظم الفردية في جيدا لوحات تحتوي على HBSS متوسطة حتى يتم الانتهاء من الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل HBSS وإضافة إلى كل بئر المتوسطة هضم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مرة أخرى وسيلة هضم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه المرة حفظ طاف ووضعه في ألفا MEM (الحد الأدنى متوسطة الأساسية) تستكمل مع FBS 10٪ (مصل بقري جنيني) و 1٪ الستربتوميسين / البنسلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.7 و 1.8 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الكسور التي جمعت ثلاثة، تدور الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 425 غ لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف، إضافة 3 مل من MEM تستكمل ألفا إلى resuspend الكرية الخلية، ونقل إلى 25 سم 2 القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة لإزالة الحطام والخلايا الميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك (AA) و 3 ملي الغليسينcerol 2 فوسفات ثنائي الصوديوم هيدرات الملح (GP) إلى المتوسطة ألفا MEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، قم بتغيير المتوسطة (ألفا MEM بالإضافة إلى AA / GP) كل يوم. </li></ol> 2. البروتوكول ATRA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء جميع التجارب مع ATRA (جميع العابر حمض الريتينويك) في غرفة مظلمة لمنع تعطيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول التربسين 1X في HBSS المتوسطة والحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة من الخلايا subconfluent وبعناية غسلها مع HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل التربسين، وتناوب بلطف القارورة للسماح لجميع الخلايا لتكون مشمولة التربسين، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من وجود مفرزة الفعلي من الخلايا تحت مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من MEM ألفا المتوسطة لتعطيل التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد خلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 425 غرام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة في غرفة عدادة الكريات العد، والسماح لتسوية لبضع دقائق وعد معدد يرة لبنانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا المكان في 25 سم 2 القوارير في مناطق ذات كثافة من 10،000 خلية / سم 2 مع ألفا MEM بالإضافة إلى AA / GP. تكون على علم بأن كثافة الخلية ذات الصلة بتطوير الأمثل للعمليات الخلية والاتصالات بين الخلايا. A الكثافة انطلاق أعلى من 10،000 خلية / سم 2 يعوق التنمية السليمة للعمليات الخلية، ولكن أعداد الخلايا أقل يؤدي إلى موت الخلايا قبل الأوان، وذلك بسبب غياب الاتصالات بين الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرومتر ATRA إلى المتوسط ​​كل 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الخلايا اليومي لتقييم التشكل: لوحظ تغيرات شكلية عادة بعد 48 ساعة. إذا، وبعد ساعة 24-48 الأولى، وخلايا لا تزال تنتشر، replate في كثافة أعلاه. عدد السكان متجانسة من osteocytes ناضجة موجودا بعد 4-5 أيام. اعتمادا على الاحتياجات، واستخدام الخلايا في أي نقطة زمنية، تصل إلى 12-15 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ومطلي الخلايا على الدعم الأخرى (مثل coverslips أو جيدا لوحات)، تأكد من أن يتم الحفاظ على كثافة أعلاه والاستمرار في إضافة ATRA كل 24 ساعة حتى الاستخدام. ترك الخلايا التمسك دعم جديد لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التجربة. </li></ol> 3. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمناعية، لوحة خلايا coverslips على واتباع المنهجيات المقررة (انظر على سبيل المثال بيرى 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، لالمناعي غير المباشر، وإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ أو الأسيتون البارد، واحتضان بالتتابع مع الأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب، ثم مع الأجسام المضادة الفلورسنت ذات العلامات الثانوية في الظلام، في RT لمدة 30 دقيقة، في غرفة ترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دابي أو نظائرها لcounterstaining النووية، وجبل في مكافحة يتلاشى المتوسط. </li></ol> 4. الصبغ الأحمر الأحمر يلطخ واستخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا coverslips على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بغمر ساترة في الايثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الخلايا مع بعض قطرات من الآليزارين حل تلطيخ الحمراء (1 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 5.5)لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع مياه الحنفية. جبل مع قطرة من الجلسرين على الشرائح الزجاجية واتخاذ الصور باستخدام المجهر تستقيم في 10X 20X والتكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإجراء أعلاه، واستعادة لل coverslips بغمر الشرائح في مياه الحنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل ساترة في لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حمض البيركلوريك 60٪ (كمية يجب أن تكون كافية لتغطية تماما الخلايا) وترك O / N عند 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الكثافة الضوئية من طاف بواسطة القياس الطيفي عند 450 نانومتر الطول الموجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتطبيع القيم لعدد الخلايا، إضافة يانوس الأخضر (حل 0.2٪ في برنامج تلفزيوني) لتغطية إعداد الخلايا لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بعناية مع الماء عالى النقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حمض الهيدروكلوريك 0.5 N (كمية يجب أن تكون كافية لتغطية جميع الخلايا) ويهز بلطف باليد لبضع ثوانى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الامتصاصية في 615 نانومتر بواسطة القياس الطيفي. </li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network.">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li><li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis.">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte.">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+isolation+and+culture.">Osteocyte isolation and culture.</a> Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).</li><li>Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., J&#228;hn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+osteocytes+from+the+long+bones+of+skeletally+mature+and+aged+mice.">Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice.</a> Biotechniques. 52 (6), 361-373 .</li><li>Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte.</a> Bone. 54 (2), 296-206 .</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+osteocyte-like+cell+line,+MLO-Y4.">Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).</li><li>Mattinzoli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+in+vitro+osteocytogenesis+induced+by+retinoic+acid+treatment.">A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment.</a> Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).</li><li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+in+embryonal+development.">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li><li>Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+all-trans+retinoic+acid+in+neurite+outgrowth+and+axonal+elongation.">Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation.</a> J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).</li><li>Vaughan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRA+induces+podocyte+differentiation+and+alters+nephrin+and+podocin+expression+in+vitro+and+in+vivo.">ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo.</a> Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).</li><li>Dodig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+TAAT-containing+motif+required+for+high+level+expression+of+the+COL1A1+promoter+in+differentiated+osteoblasts+of+transgenic+mice.">Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice.</a> J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry.">Immunocytochemistry.</a> A practical guide for biomedical research. , (2010).</li><li>Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Boukhechba, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+osteocyte+differentiation+in+a+3D+culture+system.">Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system.</a> J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).</li><li>Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+vitro:+from+pre-osteoblasts+to+osteocytes:+a+contribution+from+the+Osteobiology+Research+Group,+The+Pennsylvania+State+University.">Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .</li><li>Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+mineralization+as+a+trigger+for+osteocyte+maturation.">Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .</li><li>Hirao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+is+an+important+mediator+of+the+transformation+of+osteoblasts+to+osteocytes.">Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes.</a> J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).</li><li>Brounais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+oncostatin+M+treatment+induces+an+osteocyte-like+differentiation+on+osteosarcoma+and+calvaria.">Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria.</a> Bone. 44 (5), 830-839 (2009).</li><li>Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+osteocyte-like+phenotype+by+fibroblast+growth+factor-2.">Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).</li><li>Poole, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sclerostin+is+a+delayed+secreted+product+of+osteocytes+that+inhibits+bone+formation.">Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation.</a> FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell and More.</a> Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في السنوات الأخيرة برزت باعتبارها الخلية خلية عظمية الأكثر مركزية في العظام. التقدم في البحوث ويكشف تدريجيا عدد من الخصائص خلية عظمية لم تكن متصورة أو غير مثبتة سابقا، والتي هي ذات قيمة هائلة لتصميم الرواية وعلاج أفضل لمجموعة متنوعة من أمراض العظام. ومع ذلك، والتحقي...

Osteocytes، والأكثر وفرة نوع من الخلايا العظمية، هي متباينة من شفائهم، وخلايا متشعبة للغاية وتقع عميقا داخل الهيكل العظمي. وترد خلايا الجسم من osteocytes ناضجة في الثغرات العظام ولها أشكال متنوعة؛ تم العثور على osteocytes مع الهيئات الخلية ممدود في العظام القشرية، في حين osteocytes مدورة هي أكثر شيوعا في العظام تربيقي 1. تمديد التشعبات متفرعة من جسم الخلية ويقيم في قنوات صغيرة تسمى نفيق، وتشكيل شبكة معقدة تجعل عدة جهات اتصال ليس فقط مع osteocytes الأخرى، ولكن أيضا مع أنواع أخرى خلايا العظام ونخاع العظام والأوعية الدموية وpericytes المرتبطة بها. من خلال السائل الخلالي الواردة في الثغرات ونفيق، osteocytes هي أيضا مرتبطة في نهاية المطاف إلى نظام تداول، وبالتالي فإنها يمكن أن تؤثر المحلي فحسب، بل أيضا الأحداث النظامية، والعكس بالعكس سلوكهم يمكن أن ينظم من قبل كل من التغيرات المحلية والنظامية 2. الاكتسبت دراسة osteocytes مؤخرا الزخم، وذلك بفضل العديد من التطورات التقنية، مثل توليد الأنسجة والخلايا محددة الحيوانات المعدلة وراثيا، واستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية وعالية الإنتاجية الفحص الجزيئي 3،4. ومع ذلك، ومعرفة هذه الخلايا لا تزال غير مكتملة، ويرجع ذلك أساسا إلى الندرة النسبية للنماذج كافية في المختبر. في الواقع، كانت osteocytes دائما من الصعب الحصول على والحفاظ في الثقافة نظرا للموقع العميقة، وانخفاض مستوى انتشار الذي يميز هذا نوع من الخلايا المتمايزة. على طول السنين، وقد وضعت عددا من الأساليب لعزل osteocytes الأولية 5-7، على الرغم من أنها تنتج عادة غلة الخلية منخفض وتحمل المخاطر التي حتى عدد قليل من الخلايا الليفية تلويث سوف اكتسى بسرعة osteocytes 8. لهذا السبب، وقد أجريت معظم التجارب في المختبر حتى الآن العمل على راسخة خلية خلية عظمية لالمعهد الوطني للإحصاء MLO-Y4 9. في المختبر منهجيات إضافية يمكن أن تعزز إمكانية دراسة هذه الخلايا ويمكن تحسين تحليل البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية خلية عظمية. أن يعتمد إلى حد كبير، وينبغي أن تكون مثل هذه الأساليب من السهل على الإنجاب، ولن تتطلب أجهزة خاصة أو أوقات طويلة جدا للوصول إلى نضوج الخلية. الأهم من ذلك، إن وجدت إلى الخلايا الأولية، فإنها تجعل من الممكن الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا. وصفنا مؤخرا أن العلاج من خط الخلايا العظمية MC3T3-E1 وبانيات الأولية مع حمض الريتينويك يؤدي الى تغيير النمط الظاهري السريع الرائدة في تطوير مجموعة من السكان متجانسة من الخلايا متشعبة تحمل الميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes 10. جميع العابر حمض الريتينويك (ATRA) هو منتج الأيض نشطة من فيتامين (أ) الذي ينظم النسخ الجيني بواسطة ربط مستقبلات حمض الريتينويك النووية (RARS). RARSربط الحمض النووي كما heterodimers مع ريتينويد X مستقبلات (RXRS)، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى التشكيل من حمض الريتينويك (RA) استجابة الجينات المستهدفة 11. وقد تبين ATRA لتعديل التمايز والنضج العديد من أنواع الخلايا، ومن بينها الخلايا المتشعبة الأخرى مثل الخلايا العصبية 12 و 13 podocytes. طريقة وصفها هنا يقوم على إضافة ATRA لبانيات الأولية. لكي تكون فعالة، يجب أن ATRA أن تضاف في مرحلة النضج دقيقة على الخلايا مطلي في مناطق ذات كثافة محددة؛ في تجربتنا هذه الظروف الحرجة للحصول على مفتاح النمط الظاهري من بانيات لosteocytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:923px;" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:283px;">Name</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:219px;">Cat #</td>
			<td style="width:183px;">comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11213857001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14175129</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-MEM</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td>22571038</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin/Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATRA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Protect ATRA from light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td>Can be added to the secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Janus Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176745</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fluorsave</td>
			<td>Calbiochem - Merck</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting Scissors, straight,10cm curved</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Well-plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermanox coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>12-565-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Zeiss Apotome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">spectrometer</td>
			<td>Safas Xenius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of retinoic acid to obtain osteocytes cultures from primary mouse osteoblasts

<html> الحاجة إلى الثقافات خلية عظمية هو معروف جيدا للمجتمع من الباحثين العظام؛ عزل osteocytes الأساسي هو صعبة وتنتج أعداد الخلايا منخفضة. ولذلك، فإن نظام الهاتف الخلوي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو خط الخلية MLO-Y4 مثل خلية عظمية. طريقة وصفها هنا يشير إلى استخدام حمض الريتينويك لتوليد السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة مع ميزات خلية عظمية المورفولوجية والجزيئية. بعد عزل الخلايا بانية العظم من calvaria الماوس، يتم إضافة حمض الريتينويك جميع العابر (ATRA) والمتوسطة الخلية، وتتم المراقبة اليومية الخلية تحت مجهر مقلوب. التغيرات المورفولوجية الأولى هي اكتشاف 2 بعد أيام من العلاج والتمايز اكتمال عموما في 5 أيام، مع التطوير التدريجي للالتشعبات، وفقدان القدرة على إنتاج مصفوفة خارج الخلية، بانخفاض التنظيم من علامات بناء العظم ويصل تنظيم جزيئات خلية عظمية محددة. المحتويات &quot;&gt; وهناك حاجة للرصد خلية يوميا بسبب تقلب المتأصل في الخلايا الأولية، والبروتوكول يمكن تكييفها مع الحد الأدنى من الاختلاف إلى الخلايا التي تم الحصول عليها من سلالات الفئران مختلفة وتطبيقها على النماذج المعدلة وراثيا. طريقة سهلة لتنفيذ و لا يتطلب أدوات خاصة، هو تكرار للغاية، ويولد بسرعة عدد سكانها خلية عظمية ناضجة في غياب كامل للالمصفوفة خارج الخلية، مما يتيح استخدام هذه الخلايا للتطبيقات البيولوجية غير محدود.

وتم الحصول على نتائج 5-10 تجارب مستقلة. مورفولوجيا الخلايا تعامل AA / GP الخلايا الأولية يكون في الغالب مثل الحصوه الميزات، سمة من بانيات ناضجة. الخلايا المتشعبة يتخلل (كما يتبين من السهام الحمراء في...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts at JoVE.com

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

علاج بانيات الماوس الأساسي مع حمض الريتينويك تنتج السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة التي تحمل ميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes. الأسلوب يتغلب على صعوبة الحصول على والحفاظ على osteocytes الأولية في الثقافة، ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة الخلايا المشتقة من النماذج المعدلة وراثيا.

تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

application-retinoic-acid-to-obtain-osteocytes-cultures-from-primary

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico.  علاج بانيات الماوس الأساسي مع حمض الريتينويك تنتج السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة التي تحمل ميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes. الأسلوب يتغلب على صعوبة الحصول على والحفاظ على osteocytes الأولية في الثقافة، ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة ال?...

Video: Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.