نشكر الدكتور ستيفن Austad لتزويدنا النسخة الأولى من هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الطبية لVG إليسون وAS

1. قبل بدء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقص وملقط تعقيم مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان مغناطيسي صغير داخل دورق 30 مل ، وتغطي مع اثنين من طبقات من احباط ، وموصدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 28 وحدة ونش / مل محلول المخزون من Blendzyme Liberase 3 في الماء المعقم. جعل aliquots 0.5 مل والتجميد في -20 درجة مئوية. أذاب a قسامة جديدة قبل كل استخدام. قد يبدو الحل غائما بعد الذوبان. دوامة الحل حتى يصبح واضحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء وسائل الإعلام ثقافة الخلية. </li></ol> 2. تحضير العينة الحيوانية الحذر : قد تحتوي على الحيوانات البرية مسببات الأمراض مثل فيروس داء الكلب. أن يكون دائما على بينة من الأدوات الحادة مفتوحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء والحيوانية ووضع الجثة في 4 درجات مئوية. فمن الأفضل لاستخدام الجثة على الفور ، ولكن ، إذا كان هذا ليس عمليا كما لو يتم جمع الحيوانات في الميدان ، قد يتم استخدام جثث خلال 24 ساعة. بعد 24 ساعة على هبوط العائد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الحيوان في الجناح الجراحي أو الكيميائي في غطاء محرك السيارة (وليس في الغطاء زراعة الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة الإبط هو موقع مناسب لجمع عينات من الجلد تحت الإبط والجلد أرق ، ويحتوي على كميات اقل من الدهون ، والفراء هو أقل كثافة. تنظيف الموقع مع شق الايثانول 70 ٪. تأكد من غارقة الفراء مع الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الفراء حول موقع شق مع مشرط حاد. حلق مساحة أكبر من موقع شق المطلوب. في محاولة لتقليل التخفيضات على الجلد. رش المنطقة مع 70 ٪ من الإيثانول واتركها لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع المكوس عينة الجلد جزء من حوالي 1 سم 2. قرصة الجلد مع ملقط الأنسجة ، وقطع مع مقص. ليس محاولة لخفض طبقة الدهون مع الجلد ، والدهون كما يتداخل مع عملية الهضم كولاجيناز. لجمع عينات من الرئة ، وغسل منطقة الصدر مع الايثانول 70 ٪ ، وفتح الجلد على صدره مع مقص عن طريق شق تي الشكل وسحب اللوحات بعيدا من الجلد. غسل المنطقة العضلات مع فتح 70 ٪ من الإيثانول وترك الجافة. قطع القفص الصدري باستخدام ملقط معقم والمقص (استخدام قواطع العظام للحصول على أكبر الحيوانات). استخدام تقنيات معقمة لتجنب تلويث الأعضاء الداخلية. لا تلمس الأعضاء الداخلية مع الصكوك التي مست فراء الحيوانات. قطع شظايا من الرئة حوالي 1 سم 2 باستخدام ملقط معقم والمقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شظايا الأنسجة مكان في 50 مل من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل السطح الخارجي للأنابيب سعة 50 مل مع شظايا الأنسجة مع الإيثانول ، وأخذها إلى الأنسجة هود الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص السليم من الذبيحة. </li></ol> 3. استخراج خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة شظايا في صحن 10 سم زراعة الأنسجة باستخدام مشرط معقم. لا نقل تلفزيوني مع الكثير من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الانسجة الى قطع ~ 1 ملم باستخدام اثنين من المشارط. استخدام اثنين من ريش باستخدام مقص العمل بدءا من الوسط وسحب إربا. الحفاظ على النسيج حتى تكور ، لا قطع قطعة قطعة. عندما قطع كافية في الجلد تشبه المعجون ، فإنه لن الى قطع منفصلة ولكنها ستمتد رقيقة. نسيج الرئة هو أسهل لقطع ، وأنه سيفصل الى قطع صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط ، ونقل الأنسجة يقتطع العقيمة الدورق 30 مل بقضيب العقيمة. غسل لوحة تستخدم لقطع الأنسجة مع 10 مل من وسائل الاعلام مع وحدات DMEM/F12 ونش 0.14 / مل Liberase Blendzyme 3 ، والمضادات الحيوية 1X / مضاد فطري ، وإضافة إلى حل الدورق 30 مل مع شظايا الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كأس بورق العقيمة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية ، واثارة ببطء ، لمدة 30 إلى 90 دقيقة. طول الحضانة يعتمد على نوع ونوع الأنسجة. الحرص على عدم الإفراط في هضم الأنسجة. ويتم الحصول على أفضل غلة عندما الأنسجة شظايا لا تزال موجودة في نهاية عملية الهضم. الجلد يستغرق وقتا أطول للهضم من الرئة. الجلد من الحيوانات الكبيرة وقتا أطول لهضمها. التحقق من عملية الهضم بعد 30 دقيقة ، ومن ثم كل 10 دقيقة. عند اكتمال عملية الهضم الجلد ، وسائل الإعلام يصبح غائما وشظايا الجلد منفصلة عن بعضها البعض ، وحواف القطع تصبح &quot;غامض&quot;. يجب أن تتوقف عملية الهضم الرئة عند تغيير لون الرئة شظايا من الأحمر إلى الأبيض والبدء في تشكيل الألياف اللزجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة في محلول يحتوي على شظايا النسيج صعودا وهبوطا لكسر كتل. الحل لنقل أنبوب 50 مل العقيمة. إذا كانت شظايا التحرك بسهولة من خلال قطع ماصة 10 مل والهضم وحسنا فعلت. شطف الكأس 3 مرات مع 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري وإضافة وسائل الإعلام للأنبوب 50 مل مع شظايا الأنسجة. إغلاق أنبوب 50 مل وتخلط بواسطة انقلاب عدة مرات. سوف FBS في وسائل الاعلام وقف Liberase الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري. الماصة مع تعليقأقصى قوة لكسر قطعة النسيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة آخر 30 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ، ومزيج الطرد المركزي في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. أكرر مرة أخرى لإزالة آثار Liberase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ونقل إلى صحن 10 سم ومكان زراعة الأنسجة في نسيج الثقافة الحاضنة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، O 2 3 ٪ . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار لوحات كل يوم لالليفية واللون وسائل الإعلام. إذا كانت العزلة قد تمت بنجاح ، الليفية الزحف للخروج من شظايا الأنسجة ونعلق على لوحة (الشكل 1). وتبدأ الخلايا الليفية للخروج شظايا الأنسجة في غضون 2-5 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان يتغير لونه إلى الأصفر وسائل الإعلام ، وهذا يشير إلى تلوث محتمل أو اكتظاظ الزنازين. فحص لوحات تحت المجهر في التكبير عالية. إذا البكتيريا والفطريات والديدان أو تجاهل الحاضر لوحات (وهذا نادرا ما يكون مسألة مع حيوانات المختبر ، ولكن قد تحدث عندما يتم جمع عينات من البرية). إذا لم يحصل أي تلوث موجود ولكن وسائل الإعلام تغيير اللون ، ويتسبب هذا إما عن طريق العديد من الخلايا أو الأنسجة شظايا كثيرة جدا وضعت في طبق واحد. إذا شملت أكثر من 60 ٪ من لوحة من قبل الليفية المرفقة ، وتغير وسائل الاعلام على لوحة ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. إن لم يكن الكثير من الخلايا الليفية التي تعلق على لوحة ، وتغيير وسائل الإعلام وتقسيم قطعة نسيج لوحات 2-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام ، إن وسائل الإعلام لم تتغير في وقت سابق ، وتغير وسائل الإعلام ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا الأنسجة وشظايا ل7 أيام إضافية. قبل 14 يوما قد خرجت عن الليفية قابلة للحياة شظايا الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 14 يوما من بداية العزلة الخلية ، تجاهل وسائل الإعلام القديمة وشظايا الأنسجة والخلايا والحصاد لوحة لهم على طبق من جديد في خلايا 5x10 5 / EMEM وحة FBS مع 15 ٪ ، 1X البنسلين / الستربتوميسين وغير الأحماض الأمينية الأساسية والبيروفات الصوديوم. وسائل الإعلام EMEM دعم نمو الخلايا الليفية أنواع الخلايا الأخرى فقط ، وسوف يموت أو وقف الانتشار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا 80-90 ٪ ، وتجميد an قسامة من الخلايا لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة زراعة الخلايا من خلال تقسيمها إلى خلايا 5x10 5 / لوحة عندما تصل خلايا التقاء 80-90 ٪. </li></ol> 4. ممثل النتائج الخلايا الليفية هي خلايا طبيعية واسعة مع نتوءات بارزة (lamellipodia) (الشكل 2). الليفية تنمو في أحادي الطبقة. ثقافة صحية متزايدة يحتوي على خلايا 1-10 ٪ في المرحلة M ، كما اعترفت تقريب خلايا مرتفعة على سطح اللوحة ، ولكن ليس بمعزل عن لوحة (الشكل 3). عادة ، طبق 10 سم مع خلايا المصنف 5 5x10 تصبح متكدسة في 3-4 أيام. الوقت مضاعفة يختلف كثيرا بين الأنواع ، وربما تكون أكبر بالنسبة لبعض أنواع القوارض طويلة الأمد 1. عندما الخلايا ملء طبق يعتقلون الانتشار في المرحلة G1. لوحة متموجة نموذجي يحتوي على الخلايا الليفية طبقة من الخلايا معبأة بإحكام (الشكل 4). عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا 90 ٪ انهم مستعدون لتقسيم. إذا رغبت في ذلك ، يمكن الحفاظ على الخلايا على لوحة an متموجة اعتقلوا لفترات طويلة من الزمن مع التغيرات وسائل الاعلام العادية (مرة أو مرتين في الأسبوع). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تم تغيير العزلة الليفية من جلد الفأر (A) والرئة (B) ، وسائل الإعلام لإزالة الخلايا غير مرتبط والحطام قبل اتخاذ الصور على يوم واحد 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الليفية الماوس الرئة. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. حقل من الخلايا الليفية تحتوي على خلايا الفأر في مرحلة - M وتصويرها على التكبير 10x. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. صفيحة متموجة من الخلايا الليفية الماوس وتصويرها على التكبير 10x.

<ol>
	<li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+.">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li><li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الليفية الأولية الطبيعية تقدم بديلا ممتازا لإنشاء خطوط الخلايا السرطانية في مجال البحوث البيولوجية. ميزة هامة من الخلايا الليفية هو أنها لا تحمل طفرات في الجينات المسرطنة والمكثفات ورم سليمة والحفاظ على نقاط التفتيش دورة الخلية. وهذا يجعل الخلايا الليفية العادي يف...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM/F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>01437-036</td>
<td>The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15420-096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Liberase TM Research Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05401127001</td>
<td>Replacement enzyme.</td>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.</td>
<tr>
<td>EMEM media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-203</td>
<td>The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Feathered #21 disposable, sterile scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multiple suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Three Gas Control incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Forma or Heraeus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

establishing primary adult fibroblast cultures from rodents

أهمية استخدام الخلايا الأولية ، بدلا من خطوط الخلايا السرطانية ، للدراسات البيولوجية أصبح من المسلم به على نطاق واسع. ويفضل الخلايا الأولية في دراسات الخلايا دورة الخلية ، والسيطرة ، وإصلاح الحمض النووي ، كما الخلايا السرطانية تحمل طفرات في الجينات المسؤولة عن هذه العمليات. لا يمكن أن يكون مثقف الخلايا الأولية اجل غير مسمى بسبب ظهور الشيخوخة أو تنسخي aneuploidization. وبالتالي ، ثقافات جديدة تدعو الحاجة إلى وضع بانتظام. راسخة الإجراء لعزل الخلايا الليفية القوارض الجنينية ، ولكن عزل الثقافات الليفية الكبار غالبا ما يقدم تحديا. قد الليفية القوارض الكبار معزولة عن نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان تكون السيطرة المفضل عند مقارنتها الليفية من المرضى من البشر. علاوة على ذلك ، لا أخلاقي الليفية هي المادة الوحيدة المتاحة عند العمل مع القوارض البرية التي لا يمكن فيها الإناث الحوامل يمكن الحصول عليها بسهولة. هنا نقدم بروتوكول للعزلة وثقافة الليفية الكبار من القوارض الجلد والرئتين. استخدمنا هذا الإجراء بنجاح لعزل الخلايا الليفية من أكثر أنواع القوارض العشرين من الفئران والجرذان المختبرية على القوارض البرية مثل القندس ، النيص ، والسنجاب.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents at JoVE.com

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

توضح هذه المقالة بروتوكول للعزلة وصيانة الثقافات الليفية الأولية من الجلد وأنسجة الرئة من القوارض البرية.

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

49.0K Views.  University of Rochester. توضح هذه المقالة بروتوكول للعزلة وصيانة الثقافات الليفية الأولية من الجلد وأنسجة الرئة من القوارض البرية.

Video: Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

إزالة الخلايا الليفية السريع من الكثافة البشرية العالية الجنينية الخلايا الجذعية الثقافات

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

تطبيق حمض الريتينويك الحصول الثقافات Osteocytes من الابتدائية ماوس خلايا الأوستيوبلاستس

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...