وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5KO8DK085136-02 لJY.

1. الحصول على الأنسجة القولون فأر بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، تبين بالتفصيل المنطقي وأهداف البحث، وقدمت والتي وافق عليها مكتب المؤسسية لدينا الحيوان بحوث الرقابة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس مع isoflurane واستنشاق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل خط الوسط شق بطني، سحب الأمعاء الدقيقة بعيدا وتحديد القولون. سحب المثانة والرحم (إذا كان موجودا) أفقيا وتحديد عظم العانة وقطع عليه مع مقص غرامة لفضح المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح مساريق الظهرية من المستقيم من القولون والقولون حشد من فتحة الشرج إلى الأعور، والقطع إلى قطع القولون من الأمعاء الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة في الفوسفات مخزنة المالحة الجليد الباردة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 10 مل مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة وطرد القولون التجويف عدة مرات لمسح محتوياته، ثم قص مكتب مستشار رئيس الوزراء القولونن طول الحكيم باستخدام المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القولون في أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على 20 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ليس لديها القولون لتوضع في أي اتجاه معين. غسل القولون عن طريق استبدال برنامج تلفزيوني حتى السائل واضح مع عدم وجود الجسيمات. </li></ol> بشري بروتوكول للحصول على الأنسجة البشرية من المرضى لعمليات جراحية، تتضمن تفاصيل عن أهمية الحصول على هذا النسيج فضلا عن تقييم المخاطر والفوائد المحتملة، قدمت والتي وافق عليها مكتب المؤسسية لدينا برنامج بحوث وقاية الإنسان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعاون البحثي مع جراح القولون والمستقيم هو ضروري لتكون قادرة على الحصول على الأنسجة البشرية لأغراض البحث الخاصة بك. وينبغي تقديم بروتوكول للحصول على أنسجة القولون الإنسان والتي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من المريض قبل إجراء العمليات الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف الجراح إجراء استئصال القولون في موقفأزياء ارض. مرة واحدة تمت إزالة القولون من المريض، يتم أخذ عينة فورا لعلم الأمراض. 0.5 في قسم كامل سماكة جدار القولون يست هناك حاجة لتقييم مرضية يتم توفير ويتم وضعها على الفور على PBS الجليد الباردة. لا ينبغي أن تشمل هذه العينة مساريق القولون، ويجب إزالة الزوائد الثربية كذلك، حيث إن وجود الدهون سوف يؤثر على عملية الهضم. </li></ol> 2. تعرية الخلايا الظهارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان القولون الماوس بأكمله في 25 مل من EDTA 5 ملم في HBSS (درجة حرارة الغرفة) في أنبوب 50 مل المخروطية. وضع أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية تهز حمام الهواء (250 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة، صب بعناية قبالة السوائل وإعادة ملء الأنبوب مع 25 مل من EDTA 5 ملم، وتكرار لما مجموعه 5 يغسل. لالقولون الإنسان، بعد الحصول على الشريط ½ بوصة من جدار القولون من الطبيب الشرعي قطع مع مقص القولون إلى أربعة أقسام متساوية الحجم. وضع اثنين من قطعة واحدة في أنبوب 50 مل المخروطية، ووضع ما تبقى من قطعتين من النسيج القولون منفصلة في أنبوب 50 مل المخروطية. ثم احتضان مع 25 مل من EDTA 5 ملم في HBSS وأداء يغسل، كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القولون مرتين في 20 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنسجة القولون الماوس في أنبوب 50 مل المخروطية جديدة تحتوي على 20 مل من RPMI-5، 10 من dispase U، U و 2،000 من كولاجيناز D (درجة حرارة الغرفة). لأنسجة القولون البشري، واستخدام ضعف كمية dispase كولاجيناز و(20 U dispase، 4،000 U كولاجيناز D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب في حمام الهواء 37 ° C تهز موجه عموديا (إذا وضعت أفقيا، وهناك الكثير من التهوية وتلف الخلايا). يهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 60 دقيقة. بعد التعرض لdispase كولاجيناز وD، فإن الأنسجة القولون تبدأ في هضم وسوف تبدأ أنسجة القولون للبحث مفتول العضلات. هذا عادة ما يستغرق حوالي 30 دقيقة. عندما القولون لديه هذا المظهر، وإزالة القولون من الانزيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز كل أنبوب صعودا وهبوطا 2-4 مرات لتفريق الأنسجة. Pellet الأنسجة في 200 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة (4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق. صب بعناية قبالة طاف وتجاهل. </li></ol> 3. عزل الأرومة الليفية العضلية والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend كل بيليه بإضافة 10 مل ACK العازلة تحلل (47 درجة مئوية). الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ج لمدة 5 دقائق (4 ° C)، صب قبالة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend كل بيليه بإضافة 10 مل RPMI-5 مع ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير نصف لتعليق الخلية (5 مل) من خلال شبكة مصفاة 70 ميكرومتر باستخدام ماصة 10 مل إلى 100 مم طبق المعالجة TC. ثم إضافة 15 مل إضافية من RPMI-5. أكرر مع 5 مل المتبقية من تعليق خلية إلى 100 مم طبق المعالجة TC مختلفة. ولذلك فإن واحدة القولون الماوس انتاج اثنين من 100 ملم الأطباق المعالجة TC. واحد ونصف بوصة شريط من الأنسجة القولون الإنسان تسفر عن مجموعه أربعة أطباق المعالجة TC 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق زراعة الأنسجة في 10٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. الشروط الثقافة هي نفسها وأو الماوس والخلايا الأولية الإنسان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 ساعة، ويغسل بلطف الخلايا غير ملتصقة مع اثنين من التغييرات من HBSS. والحطام العائمة يجب غسلها بلطف. وتتكون الخلايا الملتصقة من الخلايا الظهارية، الضامة وmyofibroblasts. أسبوع واحد بعد البذر، myofibroblasts الفجوة فقط، الضامة والخلايا الظهارية senesce بعد مرور الأول. إضافة جديدة RPMI-5 وتنمو الخلايا في خلية ثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و passaged الخلايا عن طريق trypsinization لمدة 5 دقائق ويتم تقسيم 2:1. </li></ol> الاختصارات HBSS: محلول ملحي متوازن هانك؛ RPMI-5: معهد روزويل بارك التذكاري وسائل الإعلام؛ ACK: الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم؛ FCS: مصل العجل الجنين؛ TC المعالجة: زراعة الأنسجة المعالجة حلول ACK تحلل العازلة - (4.15 ز NH 4 CL، 0.5 غرام KHCO 3، 18.6 ملغ نا 2 EDTA، 400 مل H 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك). مرشح sterilizه من خلال مرشح 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. RPMI-5 - (لجعل 500 مل: 454.5 مل RPMI، 25 مل FCS، 5 مل 200 ملي L-الجلوتامين، 5 مل 1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، 5 مل 100 ملي البيروفات الصوديوم، 5 مل 100X القلم بكتيريا، 500 مل 50 ملي B-ME في برنامج تلفزيوني).

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تقنية عامة مشابهة عند استخدام إما الماوس أو القولون الإنسان. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لعزل myofibroblasts من الأمعاء الدقيقة. تفاصيل محددة لعزل myofibroblasts من 1. الماوس و 2. وتناقش القولون البشري أدناه. 1. الماوس القولون <p class="jove_content" s...

تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظيفة الجهاز ينطوي المعقدة، والتفاعلات الدينامية بين الطبقة المخاطية واللحمة المتوسطة الكامنة. هذه التفاعلات تخدم عادة للحفاظ على التوازن ولكن قد يؤدي أيضا إلى تطوير الحالات المرضية في ظل ظروف مرضية 1. Myofibroblasts هي جزء من السكان من الخلايا اللحمية تقع تحتاني إلى الطبقة الظهارية التي تتصل بطريقة نظير الصماوي مع توضيح المجموعات السكانية الفرعية خلية لتنظيم عدد من العمليات الحرجة الجهاز الهضمي والتي تشمل تجديد الغشاء المخاطي، والإصلاح، والتليف 2. خط الخلية 18Co هو مثال على القولون خط الخلية البشرية الأرومة الليفية العضلية التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية لأنها تشترك في كثير من الخصائص من التعليم الابتدائي في myofibroblasts الموقع. وتشمل هذه تعبير البروتين من العضلات على نحو سلس الأكتين (α-SMA) وvimentin، فضلا عن التعبير عن عددمن مستقبلات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل نمو البشرة، أو مستقبلات حمض 3،4 lysophosphatidic. بسبب هذه الخصائص التركيبية المشتركة، فضلا عن التشابه في وظيفة بيولوجية 5، وقد استخدم خط الخلية 18Co على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية في سياق العديد من الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء أو القولون والمستقيم 3،6 السرطان. ومع ذلك، هناك قيود والمخاوف المتأصلة عند استخدام خط الخلية. وتشمل هذه عدم الاستقرار الوراثي بمرور الوقت التي تميز خطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وتغيير النمط الظاهري وظيفة بيولوجية الخلية، بما في ذلك معدلات النمو والتفاعل مع السكان الخلية الأخرى. تفتقر خطوط الخلايا أيضا مكونات طبيعية من المكروية GI (الظهارية، اللحمية، ومكونات الأوعية الدموية)، والذي يشكل قيدا رئيسيا لاستخدامه. وبالتالي، فإن الاستنتاجات المستخلصة من البحوث التجريبية خط الخلية يتطلب مزيدا من التحقق من صحة للحد من ريكورونا من سوء التفسير. ويمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان والفأر لتأكيد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية 7. طريقة وصفت في الأصل من قبل Mahida، وآخرون. 8، وبروتوكول لدينا هي واحدة من العديد من التقنيات موصوفة وصفا جيدا والتي يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية من الماوس والقولون الإنسان 9. عن أي نموذج الفأر من مرض القولون، هذه التقنية يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية لدراسة كيفية تفاعلها مع الخلايا المجاورة أو المساهمة في الظروف العادية أو عمليات GI مرضية 10،11. هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة كيفية مساهمة myofibroblasts إلى المخاطية الشفاء، والتليف، وتطوير أورام القولون والمستقيم وسرطان. كما يمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان التي تم مقطوعة في وقت التشغيل لحميدة (مرض التهاب الأمعاء، والقيود، انسدادات) أو ج الخبيثةonditions. يمكن زراعتها الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة القولون الإنسان والفأر في المزارع الخلوية والاستفادة منها على عدد محدود من المقاطع.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

والأرومة الليفية العضلية هي خلايا انسجة الجهاز الهضمي من (GI) المسالك التي تم تكتسب اهتماما كبيرا لدورها الحاسم في كثير من وظائف الجهاز الهضمي. في حين أن العديد من خطوط الخلايا الأرومة الليفية العضلية المتاحة تجاريا لدراسة هذه الخلايا في المختبر، ونتائج البحوث من خط الخلية تتعرض لظروف تجريبية ثقافة الخلية على قيود متأصلة نظرا لطبيعة اختزالية بشكل مفرط من العمل. استخدام myofibroblasts الأولية يقدم ميزة كبيرة من حيث تؤكد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية. عزل myofibroblasts الأولية من نموذج حيواني يسمح لدراسة myofibroblasts ظل الظروف التي تحاكي بشكل وثيق الدولة الأمراض التي تجري دراستها. عزل myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان يوفر يمكن القول إن معظم البيانات التجريبية ذات الصلة، منذ الخلايا تأتي مباشرة من المرضى الذين يعانون من هذا المرض الأساسي. نحن تصف تقنية راسخة يمكن أن تكون شtilized لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان. وقد اتسمت هذه الخلايا أن تكون معزولة أكتين ألفا العضلات الملساء وvimentin إيجابية، وdesmin السلبية، بما يتفق مع myofibroblasts المعوية تحت الظهارة. يمكن زراعتها خلايا الأرومة الليفية العضلية الأولية في خلية ثقافة وتستخدم لأغراض تجريبية على عدد محدود من المقاطع.

مرة واحدة معزولة، myofibroblasts الإنسان الأساسية يمكن زراعتها في خلية ثقافة وتستخدم أكثر من عدد محدود من المقاطع (حتى مرور 4). وتتميز هذه الخلايا بأنها على نحو سلس أكتين العضلات وvimentin إيجابية، وسلبية desmin (الشكل 1A)، بما يتفق مع myofibroblasts تحت الظهارة المعوية 5،7. ل...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في المختبر لالتجريب.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  UCLA.  والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في ...

Video: Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

جيل من المورين الأولي القولون الظهارية Monolayers من سرداب الأمعاء

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

عزل وثقافة الكريات الكيراتينية الفموية الأولية من الحنك الفأري البالغ

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...