ويدعم MB بتمويل منحة زمالة من لجنة نهر الميكونج. معتمدة KP وAHM بتمويل منحة من يسيكس البحوث الطبية ومعهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة / RCS (انجلترا) (C28503/A10013). ونحن ممتنون للدعم من جامعة ساوثهامبتون حدة أبحاث كيمياء الأنسجة.

1. مؤسسة الثقافات الخلايا الليفية الأولية من القولون إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات من الأنسجة الطبيعية القولون المخاطي الإنسان مباشرة من غرفة العمليات الجراحية، ووقف في 7-10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.25 ميكروغرام / مل Fungizone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المختبر، ضع عينة في وسط طبق 10 سم زراعة الأنسجة ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني / القلم بكتيريا / Fungizone. لا نضح بعد غسل النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط معقم ومشرط، وقطع الأنسجة الى قطع صغيرة (2mm في تقريبا) ووضع كل قطعة في مركز الصليب تعادل مع شفرة المشرط في 12 لوحة جيدا. صخرة مشرط بلطف على الأنسجة لتمكينها من الالتزام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة العينات في 750 ميكرولتر سائل الإعلام نمو الخلايا الليفية الأساسية (DMEM تستكمل مع 20٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين)، والتي ينبغي submeRGE الأنسجة دون تمكنها من أن تطفو. تجنب إزعاج لوحة على مدى 5 أيام القادمة إلا إلى إعادة تغذية كل يوم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال 5 أيام القادمة الليفية سوف تبدأ ببطء للتخلص من على حافة النسيج. في حوالي 7 أيام، وهذا سيكون أكثر وضوحا. بعد حوالي 3-4 أسابيع، وإذا كان هناك ما يكفي من الخلايا الليفية نابتا، إضافة 750 ميكرولتر التربسين إلى كل بئر. بعد الخلايا قد فصل (والذي قد يستغرق 5-10 دقيقة) وحوض سباحة ونقل إلى T-25 نسيج الثقافة قارورة. </li></ol> 2. إعداد عضوي النمط إعداد الخلايا الليفية مشربة هلام عضوي النمط: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية الليفية تحتوي على 5 × 10 5 خلايا لكل عضوي النمط في DMEM تستكمل مع FCS 10٪ و 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل المواد الهلامية عضوي النمط على الجليد، في النسب التالية: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 مجلدات من-الجرذ الذيل الكولاجين: Matrigel مزيج (1:1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم 10X تصفيتها DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم الخلايا الليفية تعليق خلية تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا الليفية ل9 المواد الهلامية (1 مل لكل هلام) إعداد 10 مل وتخلط برفق لتجنب الفقاعات. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل لكل بئر من لوحة 24 جيدا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 ° مئوية في جو مرطب للسماح المواد الهلامية لتعيين. بعد 1 ساعة إضافة 1 مل DMEM (10٪ FCS) / التخمة على رأس المواد الهلامية والعودة إلى الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، نضح المتوسطة من الجزء العلوي من لوحة والمواد الهلامية 1ml من وسائل الإعلام التي تحتوي على 5 × 10 5 CRC الخلايا الظهارية. </li></ol> إعداد هلام المغلفة ورقة النايلون: <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العقيمة، وصحائف النايلون تعقيمها قياس 1.5 سم × 1.5 سم، مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، ضع العدد المطلوب من أوراق النايلون في طبق ثقافة 10 سم (عادة 4 صحائف النايلون يمكن استيعابها لكل طبق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل هلام على الجليد في الترتيب التالي (250 ميكرولتر مجموعمطلوب لكل ورقة النايلون حجم): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 مجلدات من-الجرذ الذيل الكولاجين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم 10X تصفيتها DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 حجم DMEM 10٪ FCS / تخمة </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الحل هو الأصفر، وتحييد بإضافة هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M في 50 ميكرولتر مأخوذة حتى يتحول الحل الوردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل ورقة النايلون واحتضان عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشكلون 1٪ من محلول غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني. إضافة 10 مل لكل طبق ثقافة 10 سم مرة واحدة وضعت جل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صحائف النايلون غسل 3x أخرى في برنامج تلفزيوني و 1X في DMEM (10٪ FCS) / غلو واحتضان بين عشية وضحاها في DMEM / غلو في 4 درجات مئوية. </li></ol> رفع المواد الهلامية عضوي النمط على شبكات الصلب لغزو: <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد شبكات السقالات من قبل للطي ورقة الفولاذ المقاوم للصدأ في تشكيل ترايبود. الأوتوكلاف قبل استخدامها.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معقم في الإيثانول لوضع شبكة من الصلب في كل بئر من لوحة جيدا ستة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة النايلون المغلفة هلام الكولاجين مع الجانب العلوي، على كل الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية المواد الهلامية عضوي النمط من 24 لوحة جيدا إلى ورقة النايلون التي أثيرت باستخدام ملعقة معقمة في الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء البئر مع DMEM 10٪ FCS / تخمة تستكمل مع FCS 10٪ حتى ورقة النايلون هو في اتصال مع المتوسطة ولكن لا تغمرها المياه. تأكد من وسيلة لا تلمس هلام عضوي النمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب 5٪ CO 2، لتحل محل وسائل الإعلام كل يوم 2. </li></ol> 3. عضوي النمط التثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عضوي النمط كله بما في ذلك ورقة النايلون من بئر ووضع على التشبث الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطر عضوي النمط ورقة النايلون باستخدام مشرط المتاح نظيفة وإصلاح كل شطر في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الفورمالديهايد مع 70٪ إيثانرأ بعد 24 ساعة وترك بين عشية وضحاها قبل التضمين في البارافين، باجتزاء، وتلطيخ. </li></ol> 4. تسليخ مجهري ليزر من الهامش الغازية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم إلى 10 ميكرون سماكة الغشاء شنت على الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize المقاطع من خلال تطبيق الزيلين لمدة 1 دقيقة، ثم إزالة الزيلين وإصلاح في 75٪ من الإيثانول ل1 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإيثانول وصمة عار مع 0.125٪ حل البنفسجي cresyl لمدة 1 دقيقة. البنفسجي cresyl يسلط الضوء على الخلايا الظهارية ويسمح سهلة التمييز من سدى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البنفسجي cresyl وتطبيق الإيثانول بنسبة 100٪ ل1 دقيقة أخرى قبل الشطف مع الإيثانول بنسبة 100٪. تسمح الشرائح إلى الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تسليخ مجهري ليزر باستخدام منصة المختار (مثل نظام لايكا AS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة زجاجية مع القسم الملون أن يكون وجهه لأسفل microdissected على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج في الكاسيت جمع وإضافة 50 ميكرولتر منالعازلة تحلل الخلية (مثل DNA، RNA أو البروتين تحلل العازلة) إلى الحد الأقصى في الأنسجة التي سوف microdissected جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الرؤية المباشرة، استخدم عصا التحكم لتحديد الأنسجة من الاهتمام، واستخدام واجهة البرنامج، تعليم قسم العضوية الملون، وتسليط الضوء الخلايا المراد microdissected في الجبهة غزو الورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكليف ليزر لاطلاق النار، والتي يتعين على قطع المقطع أبرز ودفع الأنسجة microdissected إلى الحد الأقصى من أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جمع مادة كافية، إخراج الكاسيت جمع وإغلاق أنبوب microcentrifuge وتدور بلطف لرسم تحلل العازلة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات على الجليد حتى تسليخ مجهري كاملة. عينات العملية من خلال طريقة مناسبة لاستخراج تحليلها من الفائدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance.">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression.">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li><li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+invasion+in+an+organotypic+model.">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li><li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth.">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li><li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis.">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li><li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis.">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li><li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+roads+to+maturity:+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation.">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+cells+and+snap+frozen+cells.">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li><li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling.">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li></ol>

المؤلفين الكشف عن أي تعارض محتمل في المصالح.

نحن هنا تصف طريقة لعزل وتوصيف تحديدا الخلايا السرطانية التي حصلت على القدرة على غزو السرطان المرتبطة سدى خلال المراحل الأولى من تطور المنتشر في 3 الابعاد بناء ثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية واللحمية. واستخدمت نماذج التعاون ثق?...

عضوي النمط المشترك الثقافات نماذج الأنسجة المهندسة التي تساعد في إعادة بناء في الجسم الحي الورم المكروية في 3 أبعاد ازدواجية بواسطة الخلايا الظهارية الخبيثة والخلايا اللحمية في هلام الكولاجين تحتوي على مكونات المصفوفة خارج الخلية الأساسية 1-3. تصور أساسا كوسيلة لقياس غزو الورم، organotypics تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية في الجسم الحي، وتجنب أوجه القصور في غيرها من تقنيات في المختبر مثل فحوصات Transwell، التي يضطر فيها الخلايا الغازية بشكل مصطنع في حالة تشتت أحادية 2-4. إدراج الخلايا اللحمية في هذه النماذج، مثل الخلايا الليفية، ويعكس الدور الأساسي للالمكروية الورم الخبيث في تنظيم الغزو والانبثاث 3-4، ولكن عدم التجانس المظهري للسدى هو أن هذه من أجل تحقيق أقصى قدر من الأهمية الفسيولوجية للعضوي النمط نماذج، محددة الجهاز ودقيقة تشريحيا فيفو السابقينينبغي أن تدرج الخلايا الليفية حيثما كان ذلك ممكنا 3،6. Organotypics هي منصة متعددة لدراسة التفاعلات بين الورم والخلايا اللحمية وتستخدم بشكل متزايد في طرق جديدة لدراسة تأثير ذلك على غزو الورم من مثبطات الكيميائية والتعديلات الجين المستهدف 7،8. دراسة الهامش الورم الغازية هو احتمال مثيرة بشكل خاص. في النماذج عضوي النمط، سرطان القولون والمستقيم إنشاء (CRC) خطوط الخلايا عادة تنتج طبقة الطلائية الطبقية بشكل جيد، وفي المقطع العرضي، والخلايا التي اكتسبت القدرة على غزو المصفوفة خارج الخلية (ECM) يمكن تمييز بسهولة. في ضوء عدم التجانس الدقيقة الطبوغرافية أنشئت من الورم والأورام المرتبطة الخلايا اللحمية في الجسم الحي، واستخراج هذه الخلايا باستخدام الليزر تسليخ مجهري ودراستها في عزلة، قد تكشف عن رؤى البيولوجية الهامة المتعلقة أصول القولون والمستقيم ورم خبيث من السرطان وكيف يمكن أن تكون أكثر كفاءة المستهدفة. أنان المنهجية التالية، جميع المرضى الذين تبرعوا عينات الأنسجة قدمت موافقة خطية مستنيرة، والدراسة وتمت الموافقة من قبل المؤسسات جنة أخلاقيات البحوث الإقليمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colorectal cancer cell lines - example shown SW480</td>
			<td style="width:132px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC CCL-228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon membrane</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VVLP01300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Metal grid</td>
			<td style="width:132px;">The Mesh Company</td>
			<td>WSS20-A4</td>
			<td>themeshcompany.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser microdissection platform</td>
			<td style="width:132px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica AS LMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Membrane mounted slides</td>
			<td style="width:132px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cresyl Violet</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1052350025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular profiling of the invasive tumor microenvironment in a 3-dimensional model of colorectal cancer cells and ex vivo fibroblasts

غزو ​​سرطان القولون والمستقيم قد المكتسب (CRC) الخلايا القدرة على التحرر من الخلايا أختهم، اختراق سدى، ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM). يمكن أن تميز بيولوجيا هذه المجموعة المتميزة ظاهريا من خلايا تحسين فهمنا بشكل كبير من الأحداث في وقت مبكر خلال تتالي النقيلي. غزو ​​الورم هو عملية ديناميكية سهلت التفاعلات ثنائية الاتجاه بين ظهارة الخبيثة والسرطان المرتبطة سدى. من أجل دراسة استجابات الخلايا المحددة في الورم سدى واجهة جمعنا بين عضوي النمط ثقافة مشتركة والتقنيات الدقيقة تشريح الليزر. نماذج عضوي النمط، الذي المكونات الرئيسية مثل انسجة الخلايا الليفية هي 3 dimentioanally شارك في تربيتها مع سرطان الخلايا الظهارية، هي أدوات تجريبية manipulatable للغاية التي تمكن الغزو والتفاعلات السرطان سدى لدراستها في شبه فتاهشروط ysiological. الليزر تسليخ مجهري (LMD) هو الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الجراحي واستخراج الطبقات المختلفة داخل أنسجة الورم، مع مستوى الدقة ميكرون. من خلال الجمع بين هذه التقنيات مع التنميط الجيني، transcriptomic وجينية ونحن نهدف إلى تطوير فهم أعمق للخصائص الجزيئية لغزو الخلايا السرطانية والأنسجة المحيطة اللحمية، وبذلك يحتمل أن تكشف المؤشرات الحيوية والفرص المتاحة لتطوير الأدوية في CRC الرواية.

لقد طبقنا الأسلوب أعلاه إلى مجموعات متعددة من خطوط الخلايا اتفاقية حقوق الطفل والخلايا اللحمية. أحد الأمثلة المعروضة هنا هي خطوط الخلايا الظهارية SW480 جنة حقوق الطفل مع فيفو السابقين الخلايا الليفية القولون الإنسان الأساسية. هي التي شيدت 3 الابعاد المشترك الثقا?...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts at JoVE.com

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

التنميط الجزيئي للخلايا الليزر microdissected وسدى من الاصطناعية، ونماذج سرطان القولون والمستقيم الأنسجة المهندسة يمثل الرواية والنهج manipulatable لتوصيف وتشريح الأحياء المتميزة في مجال التفاعل بين الخلايا السرطانية في الجبهة الغازية وسرطان الخلايا اللحمية المرتبطة.

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

11.0K Views.  University of Southampton School of Medicine.  التنميط الجزيئي للخلايا الليزر microdissected وسدى من الاصطناعية، ونماذج سرطان القولون والمستقيم الأنسجة المهندسة يمثل الرواية والنهج manipulatable لتوصيف وتشريح الأحياء المتميزة في مجال التفاعل بين الخلايا السرطانية في الجبهة الغازية وسرطان الخلا...

Video: Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

يعيش التصوير من الاستجابة للأدوية الأورام المكروية في في نماذج الماوس من سرطان الثدي

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

بدء النقيلي سرطان الثدي عن طريق استهداف ظهارة الأقنية مع اتش، لجنة المساواة العرقية: رواية المعدلة وراثيا نموذج الفأر من سرطان الثدي

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

ورم في المخ / شريحة عضوي النمط المشارك ثقافة النظام لدراسة ورم المكروية والمستهدفة المخدرات العلاجات

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...