This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. توليد بتكاثر الأجسام الشبه الكروية ورم الحجم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 5 مل ل25 سم 2 أو 8-10 مل ل75 سم 2 قارورة)، إضافة انزيم تفارق الخلية (1 مل ​​25 سم 2 أو 2 مل 75 سم 2 قارورة)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق انفصال الخلايا تحت المجهر وتحييد انزيم تفارق الخلية مع كامل متوسطة النمو (5 مل ل25 سم 2 أو 8 مل ل75 سم 2 قارورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، والاستفادة من الأنبوب وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من متوسط ​​النمو باستخدام ماصة P1000. وهذا ينبغي أن تسفر عن تعليق خلية واحدة دون كتل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية للحصول على 0،5-2 × 10 4 خلية / مل (تحتاج كثافة الخلية المثلى ليتم تحديدها لكل خط الخلية في سrder للحصول الكروية الورم من 300-500 ميكرون قطرها 4 أيام بعد خلية البذر 12،13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى خزان معقم و، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، الاستغناء عن 200 ميكرولتر / جيد في المرفق منخفضة للغاية (ULA) 96-جيدا لوحات أسفل الجولة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحات لحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة). بعد أربعة أيام، تأكيد بصريا تشكيل كروي الورم والمضي قدما في غزو مقايسة 3D. </li></ol> 2. 3D ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد BMM على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مجموعة من النصائح مرشح العقيمة لP10، P200 والماصات P1000 وأنابيب معقمة (1.5 مل حجم أو أكبر اعتمادا على الحجم الكلي مطلوب) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ULA لوحات 96-جيدا تحتوي الكروية القديمة 4 أيام على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية، وإزالة بلطف 100 ميكرولتر / جيد للنمو المتوسطة من لوحات كروي. لهذه الخطوة زاوية النصائح نحو طجدار nside من الآبار U-القاع، وتجنب الاتصال مع الجزء السفلي من البئر وموقع الكروية. تقليل اضطراب الكروية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النصائح المثلج، ونقل BMM لأنابيب الجليد الباردة. للغزو التي يسببها خلوى أو دراسات تقييم المخدرات، إضافة الكواشف (في 2X تركيز النهائي) إلى BMM باستخدام نصائح الجليد الباردة. على سبيل المثال، استخدم عامل نمو البشرة (EGF) لتحفيز غزو CAL S وCAL R الخلايا الحرشفية سرطان. مزيج جيد من قبل يحوم بلطف، وتجنب تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بلطف 100 ميكرولتر من BMM في البئر U-القاع، وتهدف غيض نحو الجدار داخل البئر. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية كما، على تحليل الصور الأمثل، يجب أن تظل الكروية في وسط البئر 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.6 لجميع الآبار المطلوبة، مما يسمح 5-6 مكررات / حالة. إذا لزم الأمر، تغيير إلى طرف الطازجة المبردة. ملاحظة: عندما أكثر خبرة، dispenحد ذاته BMM باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة معقمة، إزالة الفقاعات، إذا كان موجودا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، والتحقق بصريا أن الكروية هي في موقع مركزي. إن لم يكن، أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وسوف يضمن هذا الكروية تقع مركزيا في كل بئر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة لحاضنة عند 37 درجة مئوية، والسماح للBMM لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 1 ساعة، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة بلطف 100 ميكرولتر / بئر الكامل متوسطة النمو. للغزو أو تقييم المخدرات الدراسات التي يسببها خلوى، وتشمل السيتوكينات أو مثبطات على المدى المتوسط ​​(1X التركيز النهائي). بدلا من ذلك، إذا لم يتم إضافة الكواشف إلى BMM في الخطوة 2.5، وإضافتها إلى وسيلة في هذه المرحلة (3X التركيز النهائي المطلوب). </li></ol> 3. الآلي الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات المسح على الكريات (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد) على فترات ستاrting من وقت صفر (T0 = يوم للمقايسة غزو إعداد، مباشرة بعد خطوة 2.10 تصل إلى 72 ساعة أو 96 ساعة للأبطأ غزو خطوط الخلايا السرطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق &quot;التقاء&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن كروي هو في التركيز، وإذا لزم الأمر، وضبط يدويا وإصلاح &quot;التركيز المقاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت &quot;ضبط أخذ العينات&quot;، حدد لمسح حقل مركزي واحد من عرض (فوف). بعد BMM بالإضافة إلى ذلك، يجب أن ظلت الكروية الورم في موقع مركزي، وبالتالي ليست هناك حاجة لفحص البئر كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج، وتحديد الآبار التي يتم مسحها ضوئيا من خلال تسليط الضوء على الخريطة لوحة. انقر على &#39;بدء المسح الضوئي. ملاحظة: يتم حفظ المسح الضوئي تلقائيا، ويمكن إعادة النظر فيها في وقت لاحق خارج الخط. </li></ol> 4. الآلي تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق &#39;ملتقى&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علامة التبويب &quot;تحليل&quot;، وضبط تطبيق صحيفةضبط أوجه (على سبيل المثال، &quot;الدقة&quot;: منخفضة، عادية، عالية؛ &quot;عتبة كثافة&quot;: 1-15) لإنتاج تجزئة دقيقة حول كروي، بما في ذلك عمليات الخلية وinvadopodia تمتد إلى BMM (انظر الشكل 1). ضبط الإعدادات لكل خط الخلية السرطانية و / أو عند نقاط زمنية مختلفة. تدابير تطبيق &quot;التقاء&quot; ل٪ من المساحة بشكل جيد من قبل الخلايا الغازية المشمولة في مجال الرؤية المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن إعدادات تحليل مناسبة (أي تجزئة دقيقة) لالكروية الأخرى في لوحة من خلال النقر على عدد قليل من الآبار المختلفة. إذا لم تجزئة الخطوط العريضة بدقة كروي، وضبط إعدادات التطبيق أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;ابدأ التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على علامة التبويب &quot;نتائج&quot;، والتحقق من الآبار متعددة للتحقق من نوعية التحليل. &quot;البيانات على مستوى حسنا&quot; التصدير إلى برنامج جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repeaتحليل ر لجميع نقاط الوقت. حساب متوسط٪ التقاء للآبار تكرار والغزو مؤامرة (٪ التقاء) مع الزمن في الرسم البياني شريط، وذلك باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية في الاختيار. </li></ol> 5. دليل الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل صورة لكل كروي الورم على فترات بدءا من ر = 0 ما يصل الى 72-96 ساعة، وهذا يتوقف على سرعة اجتياح خط الخلية في السؤال، وذلك باستخدام مجهر مقلوب (لوحة 96-جيدا هذا يستغرق حوالي 20 - 30 دقيقة). استخدام هدفا 10X. استخدام الهدف 4X عندما غزت منطقة كبيرة جدا ليتم القبض تماما في مجال 10X نظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كل صورة الفردية المكتسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمعايرة، التقاط صور من مرحلة graticule (1 مم) باستخدام كل أهداف 10X و4X (وحفظ الصور). </li></ol> 6. كتيب تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور المرحلة graticule في برنامج تحليل الصور في الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل غراتقياسات icule، الوحدات (ميكرون)، والأهداف المستخدمة (10X أو 4X) وأداء المعايرة. مطلوب هذه الخطوة مرة واحدة فقط. لتحليل الصور لاحقا، وذلك ببساطة إعادة ضبط المعايرة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور مقايسة الغزو واختر إعدادات المعايرة اعتمادا على الهدف المجهر (10X أو 4X) المستخدمة للحصول على الصور. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، الصور التي تم الحصول عليها استيراد على التصوير الكريات (الخطوة 3) وتحليل يدويا، كما هو موضح في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مقلوب (انظر النتائج هو موضح في الشكل 3 والشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس المنطقة التي تغطيها الكروية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرمجيات المستخدمة هنا لممثل النتائج (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد)، انتقل إلى &quot;قياس&quot; وحدد &quot;عدد / حجم. اختار &#39;ملف&#39; ثم &#39;تحميل الإعدادات&#39; وحدد قبل تحديد أساضبط ص. ثم اختر &#39;عدد&#39;. ثم ينبغي أن تكون مجزأة بدقة كروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذهب بدلا من ذلك إلى &#39;تعديل&#39; ثم &#39;رسم / كائنات دمج &quot;لفتح نافذة&quot; العصا السحرية / تتبع. استخدام المؤشر عصا لانقر على الصورة كروي والحصول على تجزئة. اختر &#39;تتبع&#39; (في نافذة &quot;العصا السحرية&quot;) لتوضيح كروي يدويا باستخدام الماوس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياسات تصدير معلمات مختلفة (منطقة، قطر، محيط الخ) إلى جدول بيانات. سجل في جدول البيانات والمعلومات ذات الصلة الصورة (على سبيل المثال، وأيضا العدد، نقطة زمنية نسبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة متوسط ​​الكروية تكرار (الغزو) مقابل الوقت باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية. بدلا من ذلك، حساب التغير في منطقة كروي في كل نقطة زمنية، نسبة إلى المنطقة في ر = 0. ثم غزو مؤامرة (٪ T0) مقابل الوقت باعتباره جرا الخطيةالرقم الهيدروجيني. </li></ol>

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

كل الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح المتنافسة.

نماذج ورم المذكورين هنا (ورم أرومي وSCCHN) وقد تم اختيار خصيصا لتجسد لنا مقايسة 3D كما هي سريريا السرطانات الغازية محليا ذات الصلة مع الحاجة غير الملباة لعلاجات فعالة 12. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، وتقييم التغييرات في المختبر الدوائية (PD) العلامات البيولوجية لا يمكن أن يؤديها بسهولة عن طريق طخة غربية أو المناعية لللست] بعد استخدام الكواشف محددة متاحة تجاريا للسماح الانتعاش خلية من BMM و / أو تحليل مناعي غزو الأجسام الشبه الكروية الورم عن طريق كله جبل تلطيخ. هذا الاختبار الغزو هو تقنية مفيدة للتقييم السريع واستنساخه من غزو الخلايا السرطانية في المتوسط ​​نصف صلب وبالتالي مناسبة خاصة بالنسبة للمستقبل في المختبر فحص المخدرات. الخلايا السرطانية تغزو المصفوفة بطريقة 3D لأنها انتشرت من &quot;الورم الصغير&quot;، ممثلة كروي الورم، وتمتد إلى extracellulAR-مثل مصفوفة البيئة. الحقيقي ثلاثة أبعاد للفحص هو واضح في شكل الخلية، والذي يختلف من شقة، مورفولوجيا الخلايا الملتصقة تفترض عندما تتحرك على ركيزة صلبة. يمكن تقدير درجة الغزو بسهولة باستخدام إما التصوير الكريات، مما يسمح للالآلي للقراءة بها، أو عن طريق استخدام المجهر القياسي في تركيبة مع برامج التصوير. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مناسبة للتصوير الفلورسنت 13 (على سبيل المثال مع خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية أو المسمى مسبقا مع الأصباغ الفلورية). طريقة بسيطة لأداء بالخطوة الحاسمة الوحيدة التي يمثلها إضافة BMM، عندما يكون هناك خطر إزعاج المركز الأساسي للكروي في شكل U جيدا. هذا يمكن أن يؤدي إلى تحليل الصور دون المستوى الأمثل، مع الكروية في طائرات التنسيق المختلفة. ولذلك فمن الأهمية بمكان إضافة BMM بعناية وببطء إلى كل بئر. بعد BMM بالإضافة إلى ذلك فإنه من المستحسن للتحقق من لوحةتحت المجهر وإذا اعتبر توطين غير مقبول، وهذا يمكن تداركه عن طريق الطرد المركزي لطيف. من ذوي الخبرة، وهذا نادرا ما يكون ضروريا. ومع أن هذا الأسلوب هو قوية وقابلة للتكرار للغاية، يمكن أن الاختلاف بين التجريبية تحدث مع دفعات مختلفة من BMM. لتجنب هذا، فإنه من المستحسن لشراء ما يكفي من BMM من دفعة واحدة لاستكمال سلسلة من الدراسات. وجود قيود على طريقة (كما عن أي من هذه المقايسات) هو صعوبة في التمييز بين الغزو والانتشار، والتي الخلايا السرطانية المحتمل الخضوع خلال الإطار الزمني الفحص. على الرغم من أن الوقت مضاعفة الخلايا يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار، أو مثبطات دورة الخلية مثل مثبط حركة الخلايا D قدم، فإنه ليس من السهل السيطرة عليها أو التمييز بين هذين الجوانب المختلفة لتطور الورم، وخاصة بالنسبة للخلايا السرطانية السريعة النمو وبالنسبة لأولئك بوضوح أن لديها أكثر &quot;توسعية&quot;، بدلا من الارتشاحي، ونمط الغزو. لهذا السببيقترح أن مواز فحص النمو 3D يتم تنفيذ لتقييم آثار محددة من أية عوامل المثبطة أو تنشيطية. إذا تم إجراء دراسات متأنية الاستجابة للجرعة، قد يكون من الممكن لتحديد تركيزات التي تقلل من الآثار المترتبة على انتشار الأسلحة النووية. على سبيل المثال لقد أظهرنا أن HSP90 المانع 17-AAG يمنع U-87 MG 3D غزو الورم كروي بالفعل في 24 ساعة وبتركيزات أقل من تركيز تثبيط نمو بنسبة 50٪ 3D (GI 50) (12). من ناحية أخرى، فإن أهمية هذا الاختبار بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الغزو القياسية (على سبيل المثال، مرشح القائمة على فحوصات أو غزو الخلايا واحد في 3D المصفوفات 1)، هو أن الخلايا السرطانية تغزو في مصفوفة المحيطة بها من كروي، التي تمثل &quot; الورم الصغير &quot;أو&quot; ورم خبيث-الصغير &quot;، وبالتالي يأخذ بعين الاعتبار جوانب هامة من الفيزيولوجيا المرضية لكتلة الورم. طريقة نقدم يوفر معلومات عنالسلوك الجماعي من الخلايا السرطانية، عند الخروج في البداية الكروية، وأيضا بشكل فردي، عندما تصل خلايا مفردة المناطق الأكثر بعدا في BMM. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا داخل الكروية الورم قد تواجه نقص الأكسجين والمغذيات الحرمان التي، من خلال التغيرات في التعبير الجيني، يمكن أن تعزز الهجرة والغزو. هذه الميزات هي غائبة في المقايسات 2D. وعلاوة على ذلك، كل هذا هو متاح في شكل عالية الإنتاجية من خلال استخدام لوحات محددة 96-جيدا وأحدث تقنيات التصوير، والسماح لفحص 3D أكثر تعقيدا ليتم استخدامها بسهولة في التحقق من صحة الهدف واكتشاف المخدرات. طريقة نقدم يمكن أن تستوعب المزيد من التطبيقات لمعالجة جوانب إضافية من غزو الخلايا السرطانية. على وجه الخصوص، تعقيد إضافي يمكن تصور بإضافة خلايا العائل، مثل الخلايا الليفية و / أو الخلايا البطانية، إلى كروي نفسه أو المصفوفة المحيطة بها. هذا ويمكن أيضا أن يتم تعديل، ليس فقط من حيث صلابة (عن طريق استخدام شارك مختلفةncentrations من BMM)، ولكن أيضا من حيث التكوين (عن طريق إضافة مكونات أخرى تعتمد على محدد الأنسجة / جهاز من النموذج المعتمد الورم: على سبيل المثال، tenascin لسرطان الدماغ 16 و الكولاجين لسرطان الثدي 17). ويمكن أيضا مماثل مجموعة المتابعة (الجيل من الكروية والتصوير) أن تتكيف مع تقييم غزو الأنسجة في 3D، حيث الكروية الورم وشارك في تربيتها مع الهيئات مضغي تشبه الأنسجة المعقدة 12 أو مع organoids خلية محددة أخرى (على سبيل المثال، الخلايا النجمية ل مطلوب بالورم 18 أو سرداب الثقافات لسرطانات الجهاز الهضمي)، ولكن بمزيد من العمل لتمكين تحليل الصور آليا.

الكلاسيكية تنمية المضادة للسرطان المخدرات هي مركزة بشكل كبير على استخدام فحوصات في المختبر خلية القاعدة للكشف عن العوامل السامة للخلايا التي تمنع انتشار الخلايا السرطانية و / أو تعزيز موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). وفي الآونة الأخيرة، تحركت الجهود الرامية إلى العلاجات المستهدفة مع تطوير مثبطات لأسباب الجزيئية الكامنة وراء انتشار الخلايا الخبيثة. على الرغم من بعض النتائج مذهلة، وغالبا ما ترتبط هذه العوامل مع التطور السريع للمقاومة الجراثيم للأدوية. نظرا لأنه هو احتمال الغازية والمتنقل من الخلايا السرطانية هي المسؤولة عن معظم الوفيات الناجمة عن السرطان، وهذا المرض غالبا ما انتكس يمثل النمط الظاهري أكثر عدوانية، فمن المنطقي أيضا أن تنظر مكملة في المختبر نماذج تجريبية 1،2 لتحديد رواية العوامل التي سوف تمنع هذه &#39;بصمات&#39; مفتاح إضافية من السرطان. خلال تطور خبيث، تكتسب الخلايا السرطانيةالقدرة على غزو الأنسجة المحيطة و / أو تنتشر في أعضاء بعيدة (الانبثاث). الخلايا السرطانية تخترق الغشاء القاعدي عن طريق تشكيل لinvadopodia 3،4. وأثرت هذه الهياكل مع خيوط الأكتين والبروتينات التصاق محددة وproteinases وهي مجتمعة مسؤولة عن الحركة الخلايا السرطانية وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) 5. Invadopodia تمتد إلى ECM، ويعتقد أنها مهمة لغزو الخلايا السرطانية وكذلك تسرب إلى قنوات الأوعية الدموية، مما يسهل دموي المنشأ (أو اللمفاوية) نشر والانبثاث. طرق القياسية الحالية لتقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر تشمل ما يلي. المستندة إلى Transwell أو بويدن المقايسات غرفة 2،6 حيث المصنف تعليق خلية واحدة على رأس مرشح مغلفة بطبقة سميكة من البروتينات المشتقة من ECM. خلايا ثم تغزو وتنتقل إلى مجلس النواب ردا على الكيماوي جاذبة. وشاع استخدام ECMالبروتينات هي من النوع الأول الكولاجين، أو قبو يشبه غشاء المصفوفة (BMM، على سبيل المثال، Matrigel، والمستمدة من الورم EHS 7) الذي يحاكي التكوين الطبيعي للأغشية الطابق السفلي. كبديل لبويدن نوع الغرفة المقايسات القائم على تصفية 8 خلايا يمكن المصنف على رأس هلام ECM (التي الليفية يمكن إضافة) حيث أنها تشكل أحادي الطبقة ومن ثم فرديا أو جماعيا غزو في هلام. ويمكن قياس الغزو من حيث عدد الخلايا الغازية و / أو المسافة المقطوعة من سطح هلام 9. ويمكن أيضا أن الخلايا السرطانية تكون جزءا لا يتجزأ تماما في مصفوفة إما تعليق خلية واحدة أو كما الكروية - عادة ما توضع بين طبقتين من ECM gel- مما يتيح لخلايا لغزو من كتلة الورم في مصفوفة المحيطة 2،6،10،11. وثلاثي الأبعاد (3D) ورم كروي مقايسة الغزو الموصوفة هنا يوفر نظام غزو automatable السريع باستخدام HIGHLذ استنساخه، طريقة موحدة 12 في شكل لوحة 96-جيدا مع كروي واحد لكل بئر. يضاف BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو من الجسم كروي. ويتم رصد مدى غزو الخلايا السرطانية على فترات على مدى فترة من 72-96 ساعة. يوفر هذا الأسلوب الميزات التالية على المقايسات الحالية في المختبر الغزو المذكورة أعلاه: الورم ويتم تنظيم الخلايا في هيكل 3D محاكاة ورم الصغرى المنطقة أو ورم خبيث الصغير؛ الأجسام الشبه الكروية الورم هي تكرار للغاية في حجم؛ يتم تنفيذ فحص الغزو في الموقع بنفس لوحة عن تطوير ورم كروي، من دون الحاجة إلى نقلها إلى لوحات الثانوية؛ طريقة، جنبا إلى جنب مع أحدث التقنيات لتحليل الصور الآلي، وتمكن كل من المحتوى العالي وتحليل إنتاجية عالية من غزو الخلايا السرطانية. يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام التصوير الكريات، والذي يقوم بمسح جيدا 96لوحة في غضون 10 دقيقة. باستخدام تطبيق التقاء، ومدى ومعدل الغزو يتحقق إما عن طريق خلايا مفردة أو مجموعات الخلايا تمتد من الأجسام الشبه الكروية الورم والغازية في مصفوفة يمكن قياسها بطريقة ديناميكية. لانخفاض الإنتاجية، وتقدم طريقة بديلة لتحليل الصور، استنادا إلى استخدام مجهر مقلوب وبرامج التصوير القياسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

يعتبر غزو الأنسجة المحيطة العادية عموما أن تكون السمة المميزة الرئيسية للالخبيث (في مقابل حميدة) الأورام. بالنسبة لبعض أنواع السرطان على وجه الخصوص (على سبيل المثال، وأورام الدماغ مثل الأشكال ورم أرومي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة - SCCHN) هو سبب اعتلال شديد ويمكن أن يكون حتى في حالة عدم وجود نقائل بعيدة مهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، والسرطانات التي انتكس بعد العلاج للأسف موجودة في كثير من الأحيان مع النمط الظاهري أكثر عدوانية. ولذلك، هناك فرصة لاستهداف عملية غزو لتوفير علاجات جديدة يمكن أن تكون مكملة لمضادات التكاثري القياسية. حتى الآن، وقد أعاق هذه الاستراتيجية من خلال عدم وجود قوية، المقايسات استنساخه مناسبة لإجراء تحليل مفصل للغزو وفحص المخدرات. نحن هنا نقدم طريقة لوحة صغيرة بسيطة (على أساس موحد، الكروية الورم 3D الذاتي تجميع) التي لديها إمكانات كبيرة لمثل هذا ستويموت. نحن مثالا على منصة الفحص باستخدام خط خلية ورم أرومي البشري وأيضا نموذجا SCCHN حيث يرتبط تطور المقاومة ضد تستهدف عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) مثبطات مع تعزيز مصفوفة الغازية المحتملة. كما نقدم طريقتين بديلة للالكمي شبه الآلي: واحد باستخدام التصوير الكريات والثانية التي يتطلب ببساطة القياسية المجهري والتقاط الصور مع تحليل الصور الرقمية.

ويتم تقييم 3D غزو الورم كروي باستخدام، قابلة للتكرار، طريقة بسيطة الآلي موضح تخطيطي في الشكل 1: يتم الحصول عليها الكروية الورم الحجم بتكاثر بواسطة طلاء الخلايا في ULA 96-جيدا لوحات أسفل مستديرة. هي جزء لا يتجزأ 4 أيام بعد بدء-الكروية في BMM. وهذا يوفر بنية شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو وتنتشر كروي. وتقع الكروية مركزيا في قاعدة كل بئر والغزو في BMM يتم رصدها بسهولة على فترات بدءا من ر = 0 تصل إلى 72-96 ساعة باستخدام التصوير الكريات. هذا يمكن أن توفر تحليل الصور مؤتمتة بالكامل. ويوضح أمثلة لأنواع مختلفة من غزو الخلايا السرطانية في أرقام 2 - 4 خبيث للغاية الأشكال ورم أرومي الإنسان (GBM) خط الخلية U-87 MG، يشكل ضيق، كروية هيكل 3D، ويستخدم هنا مثالا أورام المخ التي محلية الغزو هو مهددة للحياة على الرئيسيةالميزة. مرة واحدة جزءا لا يتجزأ من BMM، الخلايا من الكروية U-87 MG تنتشر مع &quot;النجمي&quot; نمط الغزو نموذجي 12. الخلايا السرطانية تمديد شعاعيا في مصفوفة التي تحافظ على شكل 3-الأبعاد. ويتبع عملية على مدى 72 ساعة كما هو مبين في الشكل رقم 2 لU-87 MG الكروية، عندما مدى غزو الخلايا السرطانية، مع تفاصيل العمليات الخلوية وinvadopodia تمتد إلى BMM هو واضح بشكل واضح. مؤتمتة بالكامل تحليل الصور باستخدام صورة الكريات تمكن الكميات الدقيقة للغزو الخلايا السرطانية مع مرور الوقت. يتم الحصول على القياس الكمي في الشكل 2 كما هو موضح في الشكل رقم 1، حيث ينتج عن التحليل الآلي تجزئة حول نتوءات خلية تمتد إلى BMM من U-87 MG جسم كروي. لاحظ أن لهذا الخط خلية، يتم استبعاد لهيئة كروي الورم من قياس مجال غزو. وهناك نمط مختلف من invasتم عرض أيون الحرشفية في الرأس والرقبة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. CAL S وCAL R هي إسوي لكن CAL S حساس ل، وCAL R مقاومة للEGFR التيروزين كيناز مثبطات 14. في غياب EGF، لا خط الخلية غزا في BMM (الشكل 3) ومع ذلك، كما تم زيادة تركيز EGF (2.5 نانوغرام / مل)، تظهر الكروية إلى &quot;برعم&quot;. في تركيزات أعلى من EGF (40 و 80 نانوغرام / مل) درجة الغزو تم تخفيض. وهذا يتفق مع الكلاسيكية على شكل جرس الاستجابة للجرعة لEGF من حيث الغزو التي ذكرت سابقا 15. في 20 نانوغرام / مل EGF، كانت نتوءات تشبه الاصبع مقذوف من الجسم الرئيسي للالكروية CAL R بينما الخلايا CAL S أقل الغازية بعد 72 ساعة (الشكل 3). وكان هذا الغزو الفرق واضح 48 ساعة بعد وضعت الكروية في BMM (تحتوي على 20 نانوغرام / مل EGF للتميز القصوى بين خطوط الخلايا) وأعظم بعد 72 ساعة (الشكل 4). تم الحصول عليها هذه الصور بسرعة باستخدام التصوير الكريات، أما بالنسبة U-87 MG. ومع ذلك، في هذه الحالة، لتجسد أسلوب بديل، وكان كميا درجة غزو يدويا باستخدام برمجيات تحليل الصور قائمة بذاتها ويتم عرضها بيانيا (الشكلان 3 و 4). وتوضح هذه النتائج فرق المظهري بين الخلايا الحساسة للعقاقير ومقاوم يمكن استخدامها للكشف عن المركبات التي سوف يثير عداء على وجه التحديد مقاومة، النمط الظاهري الغازية المخدرات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي 3D الورم كروي الغزو الفحص. ويوضح سير العمل الخطوات ينطوي على طريقة بما في ذلك الصور ممثل الكروية U-87 MG ورم أرومي بعد التضمين في BMM (اللوحة العلوية؛ ر = 0) وبعد الغزو<html> في BMM (اللوحة السفلية؛ ر = 72 ساعة) مع وبدون تجزئة الذي يقيس المنطقة من قبل الخلايا الغازية تغطيتها. بار = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> الشكل 2. الوقت بالطبع من الغزو U-87 MG ورم أرومي كروي في BMM. U-87 MG كروي تم رصد الغزو 3D في BMM وكميا تصل إلى 72 ساعة باستخدام التصوير الكريات. (A) صور الممثل و (B) الكمي ل وترد غزو الخلايا السرطانية. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> إعادة 3 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; ويبين الشكل 3. CAL R (مقاومة) وCAL S (حساسة) غزو الورم كروي. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للEGF تعتمد على الجرعة CAL R وCAL S غزو الورم كروي. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> الرقم 4. خلايا من CAL R (المقاومة) الكروية هي أكثر الغازية من CAL S (الحساسة) الكروية الورم عند وضعه في BMM. وعند تبين التحفيز EGF CAL R الكروية ورم غزو أكثر وضوحا من CAL S. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للغزو ترد. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.6K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

نظام Coculture مع عضوي النمط شريحة الدماغ و 3D كروي من خلايا سرطان

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

ثلاثي الأبعاد نموذج المشارك الثقافة ل-ورم انسجة التفاعل

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

ثلاثي الأبعاد ثقافة الفحص لاستكشاف سرطان الغازية خلية والأقمار الصناعية ورم تشكيل

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

الطباعة ثلاثية الأبعاد ليمثل شذوذاً الابهري المعقدة

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...