الكتاب أشكر M. فيشه من مستشفى جامعة لوزان لتوفير صورة تصغير او تكبير M. يرث وA. Ayyanan من المعهد السويسري لبحوث السرطان التجريبية، المركز الوطني للبحوث في اختصاص علم الأورام الجزيئية، كلية علوم الحياة، مدرسة الفنون التطبيقية الاتحادية لدي لوزان للحصول على المساعدة الفنية وR. كلارك من جامعة مانشستر للحصول على تعليقات حرجة. تلقت الأبحاث الرائدة لهذه النتائج بدعم من SNF3100A0-112090، Oncosuisse 531817، ومبتكرة الأدوية المبادرة المشتركة تعهد بموجب اتفاقية منحة لا. 115188، موارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7 / 2007-2013) والاتحاد الأوروبي للصناعات الدوائية وجمعيات الشركات في المساهمة العينية. عنوان ويب من مبادرة الأدوية المبتكرة هو <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

اعتبارات عامة: في وقت مبكر، إنشاء بروتوكول الأخلاق، وإعداد الاستبيانات للمرضى، ونرى لتدريب الموظفين السريري. قبل استخدام مواد من جراحة تصغير او تكبير الخفض، شراء التراخيص، وضمان موافقة المريض. قد تكون الأنسجة المعدية ويحتاج ليتم التعامل معها وفقا لذلك. وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة أخلاقية من ISREC - المعهد السويسري لبحوث السرطان التجريبية. 1. الأنسجة الاسترداد، تجهيز والحيوية المصرفية لضمان أفضل جودة عينة لالمصرفية الحيوي، وتنفذ عددا من الخطوات للخروج في المستشفى قبل نقل إلى المختبر. في المستشفى: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أنسجة الثدي الإنسان تحت ظروف معقمة من عينات جراحة تصغير او تكبير خفض والدم، وإذا لزم الأمر. تحتاج الأنسجة لفحصها من قبل الطبيب الشرعي الذي سوف أخذ عينات لاستبعاد وجود الآفات الخبيثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ر الثديتصدر تحت غطاء محرك السيارة على لوحة العقيمة وإعداد مقص، مشرط جراحي وملقط التي يتم تعقيمها التعقيم بالفعل مع البخار. جعل قطع عميق في مواقع مختلفة من الأنسجة الثديية باستخدام مشرط لفتحه. في نسيج الثدي الإنسان والبحث عن خيوط بيضاء تتكون من قنوات وفصيصات، والتي هي جزء لا يتجزأ في الأنسجة الدهنية الصفراء. ملاحظة: نسبة متني البيضاء إلى الأنسجة الدهنية الصفراء تختلف بين النساء. عادة النساء الأصغر سنا لديهم الأنسجة الظهارية أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار قطع من مادة بيضاء وعقد لهم مع ملقط، ثم تفصل بينهما بلطف من الأنسجة الدهنية مع مقص. تجنب اتخاذ الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع شطف من الأنسجة في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2 لإزالة الدم. نقل الأنسجة لزجاجات البلاستيك 250 مل تحتوي على F12 المتوسطة (متوسطة F12 Dulbecco لتعديل النسر) دون الفينول الأحمر مع 2٪ البنسلين / الستربتومايسين (بما في ذلك 5،000 وحدة / مل البنسلين و 5،000 غرام / مل الستربتومايسين) و 1٪ لtibiotic / الأمفوتريسين B (بما في ذلك 10،000 وحدة / مل البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين، و 25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B). متجر الأنسجة في المتوسط ​​لنقلها إلى المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قطعة من 3-5 مم لRNA والبروتين استخراج وفلاش تجميدها في cryovials مع البرد (الثلج الجاف) isopentane. نقلها إلى صندوق الثلج الجاف لنقلها إلى المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة من 3-5 ملم في العفن وتغطية ذلك مع طبقة من قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) ثم وضع القالب في أسفل شقة مربع مليئة isopentane الباردة. بعد تجميد كامل نقل القالب إلى مربع الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح 5 قطع من 3-5 مم في بارافورمالدهيد (PFA) 4٪ و 5 قطع أخرى في الفورمالديهايد (FA) 4٪ في برنامج تلفزيوني في RT التحليل النسيجي في وقت لاحق. ينصح اثنين من مثبتات مختلفة كما تعمل بعض الأجسام المضادة بشكل أفضل مع واحدة أو أخرى من الاثنين. </li></ol> في المختبر: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فعلcument جميع المعلومات عن تصغير او تكبير الخفض، وتستمد تاريخ الجراحة وإذا كانت العينات من اليسار مقابل اليمين الثدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات المجمدة في -80 ° C ونقل الأنسجة الثابتة إلى أشرطة الأنسجة بعد 2 ساعة من التثبيت. ثم وضعها إما في برنامج تلفزيوني أو الإيثانول 70٪، لO / N تخزين عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، ونقل أشرطة الأنسجة إلى مرافق الأنسجة لالبارافين التضمين. </li></ol> 2. الأنسجة الهضم وتحفيز هرمون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزجاجات التي تحتوي على عينات الأنسجة لمجلس الوزراء تدفق الصفحي في غرفة زراعة الخلايا P2. ضع قطعة نسيج على متن تقطيع معقمة (29 × 19 سم). امسك المواد مع ملقط وتتخلص من الدهون المتبقية والسفن بعيدا عن لحمة الثدي (الجزء الأبيض) مع مشرط. وضع مادة بيضاء في برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة المواد الدهنية من كل قطعة والتخلص منها وفقا لسيادة السلامةالصورة من المختبر، ووضع أجزاء البيضاء التي تحتوي على الأنسجة الظهارية مرة أخرى على لوحة التقطيع. باستخدام المشارط معارضة قطع الأنسجة وختم عليها إلى قطعة من لتصل إلى 2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المواد المفروم في أنابيب من حجم كاف: يصل إلى 1، 2.5 و 10 مل إلى 5 أو 15 أو 50 مل أنابيب، على التوالي. عادة 5 مل عوائد أنبوب ما يكفي من المواد لالغرز البارافين وهرمون التحفيز، و15 مل عوائد أنبوب ما يكفي من المواد لالإسفار خلية المنشط للفرز (FACS). وتستخدم أنابيب أكبر لتجميد مأخوذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الرئيسي الهضم تتكون من المتوسطة (DMEM / F12 دون أحمر الفينول) مع البنسلين 1٪ / الستربتومايسين / الأمفوتريسين B وكولاجيناز ألف (A كلوستريديوبيبتيداز من مطثية حالة للنسج). جرعة كولاجيناز وفقا لمرات الهضم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة 12، 24، و 36 ساعة من الحضانة، واستخدام تركيز النهائي من كولاجيناز من 1.5 ملغ / مل، 1.0 ملغ / مل و 0.5 ملغ / مل على التوالي. إضافة مزيج الرئيسي الهضم تصل إلى 4 مرات منحجم المواد هضمها لضمان التحريض وتهوية كافية. ملاحظة: اعتمادا على التصميم التجريبي ومدة التحفيز الهرمون، إضافة الهرمونات إما أثناء أو بعد خطوة عملية الهضم والمجهرية الأنزيمية الانتعاش. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة هرمون (ق) في التركيز المطلوب لاختبار العينات والسيارة إلى عنصر التحكم. لالتحفيز مع 17-β استراديول، وpromegestone (R5020) استخدام تركيز النهائي من 20 نانومتر. ملاحظة: R5020 هو الاصطناعية ناهض مستقبلات هرمون البروجسترون، وهو أكثر استقرارا من البروجسترون الطبيعي في المتوسط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأنابيب في الخلاط الأسطوانة داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة O / N. قبل وضع العينات في الخلاط، و resuspend لهم بشكل جيد للغاية للتأكد من أن جميع المواد وتوزع على طول أنابيب الطرد المركزي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يأخذ الهضم لا يقل عن 12 ساعة (O / N)، للمرة تحفيز هرمون أقل من 12 ساعة، إضافة الهرمونات بعد الشفاء من المجهرية (ديالذيل تحت الخطوة 3). إضافة الهرمونات كما كنت resuspend والمجهرية ووضع تعليق على لوحات مرفق منخفضة للغاية. يمكن أن تظل المجهرية الأنسجة على لوحات مرفق منخفضة للغاية لمدة تصل إلى 7 أيام في النمو خالية من عامل المتوسطة الحفاظ على حوالي 70٪ قدرتها على البقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لRNA والبروتين التحليل، وجمع المجهرية الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وفلاش تجميد في أنابيب الطرد المركزي. </li></ol> 3. استرداد المجهرية الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي أنبوب (ق) في 400 x ج لمدة 5 دقائق. نضح الدهون من الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي ونقل طاف من طاف مائي المتبقية، والتي يتم تخصيبها في الخلايا الليفية، إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: كما في المجهرية نسيج الثدي هي لزجة جدا، لجميع الخطوات اللاحقة resuspend الكرية التي كتبها تهييج بلطف الأنبوب. لا ينصح pipetting ليرجع ذلك إلى خطر فقدان المواد. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وكريات المخصب في المجهرية والخلايا الليفية المستمدة من طاف مائي في برنامج تلفزيوني، 2٪ الجنين مصل العجل (FCS). وفي وقت لاحق تدور على حد سواء في أنابيب 1،250 x ج لمدة 5 دقائق ثم تجاهل supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والكريات في 3-5 مل الأحمر العازلة تحلل الدم خلية ونقلها لتنظيف الأنابيب. احتضان لهم لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم 2X من برنامج تلفزيوني، 2٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق. غسل الكريات مع PBS، 2٪ FCS والطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين. </li></ol> 4. عينات لالتدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 - 2 مل التربسين 0.25٪ لبيليه ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا بلطف شديد لمدة 2 دقيقة مع pipetman 1،000 ميكرولتر لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمنع النشاط التربسين بإضافة 9 مل PBS، 2٪ FCS. الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في 10 مل PBS، 2٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق الخلية على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وضعت على رالمرجع من أنبوب الطرد المركزي 50 مل لإعداد الخلايا واحد. إذا بقيت بضع ميكرولتر من تعليق خلية على رأس مرشح، ومساعدتهم تمر عبر فلتر بواسطة الشفط إليها من الجانب الآخر من مصفاة مع الماصة وإضافتها إلى المجهرية التي تمت تصفيتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا المناعية منفصلة، ​​الخلايا الليفية والخلايا البطانية من المجهرية مع كوكتيل من مكافحة CD45، ومكافحة FAP ومكافحة CD31 الأجسام المضادة ومن ثم فرزها مع FACS، استنادا إلى عموم الظهارية EpCAM علامة وCD10 لفصل الخلايا اللمعية والقاعدية على التوالي 10 . </li></ol> 5. عينات الأنسجة ل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل المواد هضمها ميكانيكيا وإنزيمي كما هو موضح أعلاه، إصلاح الكريات من 1.5 مل المواد الأولية في 1 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 1،250 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل مع 1 - 2 مل PBS مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، وإعداد 1٪ متعددة الأغراض الاغاروز في تريس، خلات-EDTA (TAE) العازلة والحرارة الحل في المايكرويف حتى يأتي الحل ليغلي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل من فرن الميكروويف ودوامة القارورة بلطف لمزج الحل و resuspend أي جزيئات الاغاروز المتبقية. الحل الاغاروز بارد إلى 50 درجة مئوية، وتصب 1 مل في قالب قاعدة البارافين الحجم 31 × 23 × 13.5 ملم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ووضع الكريات على الجزء العلوي من طبقة طدت (1 - 3 مم) من الاغاروز باستخدام ملعقة مع نهاية مسطحة. تغطية كل منهم مع طبقة إضافية من الاغاروز (40 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد agarose يتصلب، عادة في غضون 5 دقائق، وطرح الكتل الاغاروز في أشرطة الأنسجة لالبارافين الغرز. جنبا إلى جنب مع عينات الاغاروز تضع ورقة بيضاء في مكتب الكاسيت مع جميع المعلومات حول عدد تصغير او تكبير الخفض، حالة تجريبية، وتاريخ مكتوبة بحروف صغيرة في قلم رصاص. كتابة هذه السطور يقاوم جميع الخطوات معالجة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أشرطة فيPBS O / N، أو في 70٪ من الإيثانول لتخزين خلال عطلة نهاية الأسبوع، في 4 درجات مئوية. ونحن لم يلاحظ أي فرق بين حلول التخزين اثنين. ثم نقل أشرطة الأنسجة إلى مرافق الأنسجة لالبارافين التضمين. </li></ol> 6. المجهرية التجميد (المستقبل التثقيف) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend المجهرية الأنسجة في تجميد المتوسطة التي تتكون من FCS مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، وتجميد 1 مل مأخوذة في cryovials. يعتمد عدد cryovials الحصول على كمية من المواد الأولية التي تم الحصول عليها من تصغير او تكبير الخفض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد cryovials تحتوي على المجهرية الأنسجة باستخدام المجمد معدل تسيطر عليها مع البرنامج التالي: 5 دقائق مسكن في 4 درجات مئوية، وخفض درجة الحرارة إلى -7 ° C مع معدل 6 ° C / دقيقة، وخفض درجة الحرارة إلى -12 ° C مع معدل 6 ° C / دقيقة، 10 دقيقة مسكن، وخفض درجة الحرارة إلى -40 درجة مئوية مع نسبة 6 ° C / دقيقة، وخفض في درجة الحرارة إلى -80 درجة مئوية معمعدل 6 ° C / دقيقة. ثم نقل إلى cryovials -80 ° C الفريزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، ونقل cryovials من -80 ° C إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين الطويل. </li></ol>

<ol>
	<li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study.">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li><li>MacMahon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+at+first+birth+and+breast+cancer+risk.">Age at first birth and breast cancer risk.</a> Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).</li><li>Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Hormonal'+risk+factors,+'breast+tissue+age'+and+the+age-incidence+of+breast+cancer.">'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer.</a> Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).</li><li>Brisken, C., O'Malley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+action+in+the+mammary+gland.">Hormone action in the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).</li><li>Levenson, A. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF-7:+the+first+hormone-responsive+breast+cancer+cell+line.">MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line.</a> Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).</li><li>Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+and+PR+signaling+nodes+during+mammary+gland+development.">ER and PR signaling nodes during mammary gland development.</a> Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).</li><li>Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction.">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).</li><li>Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell:+influence+of+extracellular+matrix+composition+and+organization+during+development+and+tumorigenesis.">Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).</li><li>Graham, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+licensing+and+progenitor+numbers+are+increased+by+progesterone+in+normal+human+breast.">DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast.</a> Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+&#34;Progesterone/RANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast&#34;.">Comment on &#34;Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast&#34;.</a> Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).</li><li>Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+signalling+in+breast+cancer:+a+neglected+hormone+coming+into+the+limelight.">Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight.</a> Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).</li><li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture+and+function:+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices.">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li><li>Tanos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone/RANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast.">Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast.</a> Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).</li><li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate.">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li><li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+the+FACS:+a+devil+in+the+details.">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ثقافة فيفو السابقين الموصوفة هنا يوفر المجهرية أنسجة الثدي تحتوي على قنوات وفصيصات سليمة، جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى التي توجد عادة في الإناث الثدي البشري. في تجهيز نسيج الثدي الإنسان عادة ما يتم الحصول عليها من mammoplasties الحد، وإزالة الأنسجة الدهنية، و...

A correction was made to <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>. There was an error with the author, Marie Shamsheddin&#39;s, name. The author&#39;s name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin

A correction to the author list has been made for the article <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>.

Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

معلومات حول المشهد التحولي في سرطان الثدي يتزايد بوتيرة سريعة. وقد تم إيلاء اهتمام أقل لعوامل النظامية التي تؤثر على تطور سرطان الثدي. التعرض للهرمونات التناسلية له تأثير كبير على تطور المرض 1-3. ومع ذلك، وغير مفهومة الآليات التي الهرمونات الإنجابية تؤثر على الثدي البشري. وقد كشف العمل مع نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تنطوي على الخلية إشارات الجوهرية ونظير الصماوي من خلال العديد من المستجيبات المصب 4. معرفة محدودة عن عمل الهرمون في الثدي البشري تعزى إلى حد كبير إلى عدم وجود نماذج كافية. وقد تم تنفيذ معظم العمل على آليات مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ومستقبلات هرمون البروجسترون (PR) إشارات مع خطوط الخلايا مستقبلات هرمون إيجابية سرطان الثدي، مثل MCF-7 و T47D. وقد استمدت هذه من الانصباب الجنبي من المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي المتقدم الذي كان الريدتلقى دى معالجات متعددة 5. أهمية البيولوجية للنتائج في مثل هذه في المختبر نماذج بسيطة من الثدي البشري هي الجينات مشكوك فيها والمستهدفة المحددة في هذه النماذج في المختبر هي تختلف عن الجينات المستهدفة التي يتم تحديدها في النماذج الحيوانية 6. عندما الخلايا الظهارية الأساسي الثدي البشري يتم تربيتها في المختبر أنها تميل الى فقدان التعبير مستقبلات الهرمونات وبالتالي استجابة هرمون 7،8. يمكن circumventd هذه المشكلة عن طريق النهج 3D المتطورة باستخدام matrigel. وبهذه الطريقة، نجح C. كلارك وزملاؤه في إنشاء خلايا الثدي الظهارية التي حافظت مستقبلات الهرمونات التعبير وأظهرت استجابة التكاثري لهرمون البروجسترون التحفيز 9. ومع ذلك، واثنين من المهم في الجسم الحي مستقبلات هرمون البروجسترون الجينات المستهدفة، WNT-4 وRANKL، لم يسببها على التحفيز البروجسترون في هذا النظام 9. وقد اتخذ هذا النهج مؤخرا حول زيادة مع في المختبر </م&gt; وقد تحقق هرمون المعالجة والاستقراء RANKL 10. ويبقى التحذير من أن matrigel له الأنشطة التي تعتمد على دفعة، باهظة الثمن، ويتطلب تصميم التجريبية التي هي عرضة للأرقام زنزانة صغيرة فقط. وبناء على هذا الاكتشاف أنه في ER الجسم الحي والعلاقات العامة والإشارات بوساطة إلى حد كبير من التفاعلات نظير الصماوي 11، قلنا أن التفاعلات بين الخلايا تحتاج إلى الحفاظ عليها. وفصلها عامل مهم آخر أن تندثر مع أنسجة الخلايا وحيدة للثقافة في المختبر هي تفاعلات الخلايا الظهارية مع المصفوفة خارج الخلية. بعد هذه حاسمة للتمايز الظهارية وتعطيل لها مهم في تكون الأورام 12. مع هذا في الاعتبار، أنشأنا طريقة لعزل المجهرية أنسجة الثدي من المواد الطازجة تجاهل الجراحية 13. لحمة الثدي، ويتألف من ظهارة الطبقات اثنين مع اللمعية الداخلية وmyoepitheli الخارجيخلايا القاعدة ويتم تشريح بعيدا عن الأنسجة الدهنية وتعرض لتفارق الميكانيكية والأنزيمية. بعد غسل والطرد المركزي، ويتم الحصول على أجزاء من قنوات الحليب التي تحتفظ تفاعلات وثيقة مع العديد من الخلايا اللحمية. تبقى هذه المجهرية الأنسجة هرمون استجابة. تم التحقق من صحة النموذج في العينات السريرية 13. على هذا النحو، يمكن أن الإجراء الحالي يساعد على دراسة عمل الهرمونات في الثدي في سياق بيولوجيا وذات الصلة سريريا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

وقد أعاق دراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري من خلال عدم وجود نظم نموذج كافية. على الثقافة في المختبر، والخلايا الظهارية الثديية الأولية تميل الى فقدان مستقبلات الهرمونات التعبير. على نطاق واسع مستقبلات الهرمونات خطوط خلايا سرطان الثدي إيجابي المستخدمة هي ذات أهمية محدودة إلى الوضع في الجسم الحي. هنا، نحن تصف نموذجا فيفو السابقين لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. وميكانيكيا وإنزيمي هضمها الطازجة عينات أنسجة الثدي الإنسان من المواد تجاهل الجراحية مثل mammoplasties تخفيض أو mammectomies للحصول على شظايا الأنسجة التي تحتوي على قنوات وفصيصات وأنواع الخلايا اللحمية متعددة. هذه المجهرية الأنسجة يوضع في المتوسط ​​القاعدية دون عوامل النمو الحفاظ على اتصالاتهم بين الخلايا، والهندسة المعمارية الأنسجة، وتبقى هرمون استجابة لعدة أيام. يتم معالجتها بسهولة أنها لRNA واستخراج البروتين، والتحليل النسيجي أو تخزينها في تجميد المتوسطة. مضانتنشيط الفرز الخلية (FACS) يمكن استخدامها في تخصيب للسكان خلية معينة. يوفر هذا البروتوكول نهج واضحة، ومعيار للدراسات متعدية مع معقدة للغاية، العينات البشرية المتنوعة.

لدراسة دور هرمون الاستروجين والبروجستيرون وفهم أفضل الوظائف الجزيئية في الثدي البشري، نقوم بجمع عينات أنسجة الثدي البشرية الطازجة من المرضى الذين يخضعون mammoplasties التخفيض (الشكل 1) بعد الحصول على موافقتها المستنيرة. ونحن أيضا الحصول على التاريخ المرضى الطبي?...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast at JoVE.com

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

لقد قمنا بتطوير رواية فيفو السابقين نموذج لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. لأنه يقوم على المجهرية الأنسجة المعزولة من عينات الأنسجة الثدي الجراحية التي تحافظ العمارة الأنسجة، والتفاعلات بين الخلايا، ونظير الصماوي الإشارات.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

an-ex-vivo-model-to-study-hormone-action-in-the-human-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K Views.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  لقد قمنا بتطوير رواية فيفو السابقين نموذج لدراسة عمل الهرمونات في الثدي البشري. لأنه يقوم على المجهرية الأنسجة المعزولة من عينات الأنسجة الثدي الجراحية التي تحافظ العمارة الأنسجة، والتفاعلات بين الخلايا، ونظير الصماوي الإشارات. 

Video: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

المؤشرات الحيوية في نموذج حيواني لكشف الاقتران العصبية، الدموية، والسلوكية للPTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

والإنسان<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تصلب الشرايين البلاك نموذج لدراسة علم الأحياء الآفات

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

الإنسان دوبوترين<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة Myofibroblasts وخارج الخلية مصفوفة التفاعلات

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

في فيفو وفيفو السابقين المداخل لدراسة سرطان المبيض النقيلي الاستعمار من الهياكل التبانة بقعة في البريتوني الدهنية

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video