وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى SHO من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM092993)، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF جائزة التوظيف وDBI 0964216)، ومكتب البحوث البحرية (شركة أوريكس) برنامج الباحث الشاب وجائزة مينيسوتا الشراكة للتكنولوجيا الحيوية وعلم الجينوم الطبية. تم إجراء تصنيع الجهاز في جامعة مينيسوتا مركز Nanofabrication (NFC)، التي تتلقى دعما من جبهة الخلاص الوطني من خلال شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة أيضا إلى MR من المعاهد الوطنية لل، الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (CA1060A11)، وأبلباوم، هيلتون، وبيترسون سانفورد المؤسسات الصحية (NS048357، R21 NS073684) والأسرة McNeilus. الكتاب أود أن أشكر Hyungsoon ايم للحصول على المساعدة مع الرسوم التوضيحية وShailabh كومار للحصول على المساعدة مع المجهر الإلكتروني.

1. التصنيع الدقيق من Microwell صفيف الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع رقاقة السيليكون 4 بوصة مع 100 نيوتن متر من أكسيد نمت حراريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور SPR-955 0.7 مقاوم الضوء على الرقاقة عند 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبز على موقد في 115 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح مقاومة للضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قناع التي من شأنها خلق 1 ميكرومتر الثقوب وترتيبها في مجموعة سداسية مع فترة 3 ميكرون حيث تغطي مجموعة 2 مم × 2 مم المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح رقاقة السائر في خط ط باستخدام حجم خطوة من 6 مم وتعرض 200 ميغا جول / سم 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبز على موقد في 115 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير استخدام مطور تدور لإيداع 2 برك من CD-26 على الرقاقة لفترة تطوير مجموعه 90 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جيدا مع الماء عالى النقاء والجافة مع DI N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر أكسيد مطبوع في رد الفعل ايون لمدة 6 دقائق مع 50 من سورة SCCM، 25 SCCM من CF 4، و 50 SCCM من CHF 3 فلوالجناح عند ضغط 75 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر السيليكون في برنامج المقارنات الدولية في أعماق خندق رد الفعل ايون مطبوع لمدة 2 دقيقة مع 63 SCCM من C 4 F 8، 27 SCCM من SF 6، 40 من سورة SCCM، و 10 SCCM من O 2 تتدفق عند ضغط 14 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الأسيتون، والميثانول، والأيزوبروبانول لإزالة مقاومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان في حمام من H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 لمدة 10 دقيقة لتنظيف السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جيدا مع الماء عالى النقاء والجافة مع DI N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع 1،080 Å من آل 2 O 3 بواسطة ترسب طبقة الذرية في 250 درجة مئوية. </li></ol> 2. تحضير بولي (dimethylsiloxane) الممسحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ممكنا، والعمل في غرف الأبحاث. العمل على خلاف ذلك في بيئة أنظف ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على طبق بتري البلاستيكية (أو غيرها من الحاويات المتاح نظيفة) مع الجانبين ≥ 13 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذا الطبق، من اجل الخروج 5 ز كيل PDMS علاج، تليها 50 ز PDMS وباوكيل البريد (أو أي شيء مع نسبة 01:10 من شأنها أن تملأ معظمها طبق بيتري). تخلط جيدا مع ماصة البلاستيك القابل للتصرف أو قضيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفقاعات من خلال وضع PDMS مختلطة في غرفة مع خط فراغ، وتطبيق فراغ حتى يخرج فقاعات من الخليط (حوالي 30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إن لم يكن بالفعل في طبق بيتري، صب PDMS في طبق بيتري، وتجنب خلق فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج بين عشية وضحاها على موقد في&gt; (يعمل أيضا ارتفاع الحرارة لوقت أقل) 50 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الجديد / شفرة حلاقة نظيفة، وقطع بعناية قطعة مستطيلة حوالي 2.5 × 2.5 سم، وحفظ السطح العلوي نظيفة قدر الإمكان. قشر خارجا مع ملقط نظيفة. تقليم قبالة حافة واحدة (وصولا الى 1.5 سم) عن طريق الضغط باستمرار على شفرة حلاقة في اقتراح واحد، لجعل أعلى الحافة الحادة قدر الإمكان (وهذا سوف يكون على حافة المستخدمة في عملية ممسحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة مع الأسيتون، والميثانول، ايزوبروبيل، وعالى النقاء المياه DI، ثم ضربة الجافة مع غاز النيتروجين نظيفة. تخزين في طبق بتري نظيفة. </li></ol> 3. إعداد الحويصلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدهون الحلول الأسهم من فسفاتيديل 25 ملغ / مل البيض (PC) و 1 ملغ / مل 1،2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (lissamine رودامين B السلفونيل) ملح الأمونيوم (رو DPPE) في الكلوروفورم و0.5 ملغ / مل من محلول المخزون monosialoganglioside GM1 في الكلوروفورم / الميثانول (2:1 ت / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قارورة زجاجية صغيرة جعل المزيج الذي ينتج 97٪ PC مول، مول 2٪ GM1 و 1٪ مول رو DPPE بإضافة 18.9 ميكرولتر من 25 ملغ / مل PC، 39.6 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل GM1 و 7.9 ميكرولتر من 1 ملغ / مل رو DPPE استخدام المحاقن الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: المواد التكميلية لناير وآخرون 25 يحتوي على تخصيص جداول البيانات إكسل ممتازة لحساب كميات من الدهون المطلوبة لإنشاء الحويصلات من أي تكوين المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القارورة في مجفف الفراغ وإزالة المذيب من خلال ترك القارورة تحت فراغ لمدة 6 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل محلول مائي من 0.1M كلوريد الصوديوم. إضافة 0.5 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M الحل لالقارورة التي تحتوي على الدهون فيلم المجففة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخليط الدهن المائي للراحة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باختصار مزيج دوامة لإنشاء تعليق الحويصلة، ثم يصوتن لمدة 20 دقيقة في حمام sonicator في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بثق تعليق الحويصلة عبر غشاء البولي مع 100 نانومتر حجم المسام. تمرير تعليق الحويصلة من خلال 17X التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحويصلات مقذوف في قارورة زجاجية في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. تشكيل كروية المدعومة الدهون طبقات ثنائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 700 نانومتر قطر شافي 2 الخرز. يتم توفير حبات في الماء المقطر مع تركيز الأسهم من 1.4 × 10 11 حبات / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 1.5 مل إيبندورف إعداد حبة التعليق 1 مل بتركيز 1.5 × 10 10 حبات / مل بإضافة 107 ميكرولتر من محلول المخزون حبة إلى 893 ميكرولتر من 0.1 M كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة تعليق لضمان أنها كذلك ميلxed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق على 1،700 x ج لمدة 20 دقيقة ثم تجاهل طاف. resuspend والخرز في 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر ليغسل جيدا الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشكيل SSLBs، في أنبوب 1.5 مل إيبندورف إضافة 25 ميكرولتر من تعليق حبة شافي 2 إلى 200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حويصلة التعليق. دوامة الخليط واسمحوا الوقوف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في هذه المرحلة يجب أن يكون تركيز SSLB 1.7 × 10 9 SSLBs / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 20 دقيقة لتكوير SSLBs. يجب أن تظهر بيليه الوردي بسبب تمزق الحويصلات مع رو DPPE على الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend في 225 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة = 7.4. كرر الخطوات من 4،6-4،7 مرتين أكثر لإزالة أي الحويصلات unruptured عن تعليق SSLB. </li></ol> 5. جمعية SSLB صفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقاقة يلتصق صفائف microwell مما أدى إلى قطع مستطيلة مع هيئة التصنيع العسكري 4-6صفائف رويل للقطعة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة خلط تعليق SSLB، ثم ضع 10 ميكرولتر من SSLB التعليق على كل مجموعة microwell. لئلا تبقى لمدة 1 ساعة للسماح SSLBs ليستقر على السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف غسل رقاقة مجموعة microwell مع برنامج تلفزيوني من زجاجة غسل، ثم يغرق في حمام PBS أعدت في طبق ضحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما المغمورة، ضع برفق PDMS دافق ممسحة على رقاقة مجموعة microwell وحرك برفق على طول سطح 5X لإزالة SSLBs التي لا يجمد في microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبضة رقاقة مجموعة microwell مع ملاقط وبلطف يهز في الحمام لإزالة أي برنامج تلفزيوني SSLBs الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة رقاقة من الحمام ممسحة ووضع في حمام برنامج تلفزيوني جديد حتى استخدامها مرة أخرى. تأكد من أن السطح العلوي للرقاقة لا يزال الرطب للحفاظ على SSLBs. </li></ol> ملاحظة: أسلوب التجميع المذكورة أعلاه يمكن استخدامها لإنشاء صفائف جزيئات الغشاء الطبيعي، مثل جزيئات المايلين المعزولة من مخ الفأر، أو بوالحويصلات spholipid دون الدعم حبة شافي 2. يوصف هذا العمل بالتفصيل في فيتنبرغ وآخرون 21 ويتم عرض نتائج ممثلة أدناه. 6. الكوليرا السمية تجليد الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 2 ملغ / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل مع التركيز المطلوب من اليكسا 488 مترافق بكتيريا الكوليرا B-الوحيدات في برنامج تلفزيوني مع 2 ملغ / مل BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مجموعة رقاقة SSLB من حمام PBS والفتيل بعيدا أكثر من الحل PBS باستخدام مختبر قضاء. ترك ما يكفي PBS على الرقاقة للحفاظ على مجموعة SSLB رطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع الربط غير محددة، إضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ / مل BSA حل لمجموعة رقاقة SSLB. دعونا بقية لمدة 1 ساعة في مربع مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع micropipette، وإزالة 200 ميكرولتر من الحل من الجزء العلوي من مجموعة رقاقة SSLB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الحل الكوليرا السم لمجموعة رقاقة SSLB وترك بقية لمدة 1 ساعة في مربع مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف غسل مجموعة رقاقة SSLB مع برنامج تلفزيوني من زجاجة غسل لإزالة أي سموم الكوليرا غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفتيل الزائدة بعيدا PBS باستخدام مختبر قضاء. قبل التصوير غطاء رقاقة مع الانزلاق 24 مم × 40 مم غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفائف الصورة مع المجهر تستقيم باستخدام فلتر يحدد المناسبة لfluorophores من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كثافة مضان من SSLBs الفردية في صفيف باستخدام وظيفة تحليل الجسيمات الآلي البرمجيات يماغيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع كثافة مضان يعني من SSLBs الفردية في رسوم بيانية تلخص شدة SSLBs العثور على مجموعة معينة. </li></ol>

<ol>
	<li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery:+A+Historical+Perspective.">Drug discovery: A Historical Perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).</li><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Membrane+Receptor+Screening+and+Analysis.">Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis.</a> J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).</li><li>Voskuhl, J., Ravoo, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Recognition+of+Bilayer+Besicles.">Molecular Recognition of Bilayer Besicles.</a> Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Supported+Lipid+Bilayers:+From+Biophysical+Studies+to+Sensor+Design.">Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design.</a> Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Steps+of+Supported+Bilayer+Formation+Probed+by+Single+Vesicle+Fluorescence+Assays.">Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays.</a> Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Mono-+and+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Au+and+Hg.">Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg.</a> Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).</li><li>Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Coherent+anti-Stokes+Raman+Scattering+Imaging+of+Lipid+Distribution+in+Coexisting+Domains.">Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains.</a> Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).</li><li>Richter, R. P., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Formation+of+Supported+Lipid+Bilayers+on+Mica:+A+Study+Combining+AFM,+QCM-D,+and+Ellipsometry.">Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry.</a> Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).</li><li>Dahlin, A., Z&#228;ch, M., Rindzevicius, T., K&#228;ll, M., Sutherland, D. S., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Surface+Plasmon+Resonance+Sensing+of+Lipid-Membrane-Mediated+Biorecognition+Events.">Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).</li><li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+Lipid+Membranes+Analyzed+with+High-Resolution+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry.">Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).</li><li>Groves, J. T., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+Formation+in+Supported+Lipid+Membranes.">Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes.</a> Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).</li><li>Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., V&#246;r&#246;s, J., Stadler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+and+Lipid+Bilayer+Arrays+Towards+Biosensing+Applications.">Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications.</a> Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).</li><li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+in+Studies+on+Immune+Cell+Adhesion+and+Communication.">Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication.</a> J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .</li><li>Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Phospholipid+Bilayer-Coated+Microchannels+for+On-Chip+Immunoassays.">Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays.</a> Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).</li><li>Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+Fluid+Lipid+Bilayers+on+Solid+Supports.">Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports.</a> Science. 275 (5300), 651-653 (1997).</li><li>Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+Composition+Arrays+of+Supported+Lipid+Bilayers+by+Microcontact+Printing.">Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing.</a> Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).</li><li>Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Photochemical+Patterning+and+Refunctionalization+of+Supported+Phospholipid+Bilayers.">Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).</li><li>Kelly, C. V., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofabrication+for+the+Analysis+and+Manipulation+of+Membranes.">Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Arrays+of+Submicron+Spherical+Supported+Lipid+Bilayers.">High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers.</a> Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+Assembly+of+Micro-+and+Nanoarrays+for+Sensing+with+Natural+Cell+Membranes.">Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes.</a> ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).</li><li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels.">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).</li><li>Kalyankar, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arraying+of+Intact+Liposomes+into+Chemically+Functionalized+Microwells.">Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells.</a> Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).</li><li>Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Self-Assembly+of+Single+Lipid+Vesicles+in+Nanoplasmonic+Apertures+in+Gold.">Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold.</a> Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).</li><li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Patterned+Supported+Lipid+Membranes+to+Investigate+the+Role+of+Receptor+Organization+in+Intercellular+Signaling.">Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling.</a> Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).</li><li>Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+Binding+Affinity+and+Specificity+for+Gangliosides+Determined+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.</a> Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).</li><li>Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometer-Sized+Supported+Lipid+Bilayer+Arrays+for+Bacterial+Toxin+Binding+Studies+Through+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).</li><li>Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1+Clustering+Inhibits+Cholera+Toxin+Binding+in+Supported+Phospholipid+Membranes.">GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).</li><li>Gill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arrangement+of+Subunits+in+Cholera+Toxin.">The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin.</a> Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).</li><li>Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+Supported+Lipid+Bilayers+Containing+Monosialoganglioside+GM1:+A+QCM-D+and+FRAP+study.">Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study.</a> Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).</li><li>Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibre+Optic+Microarrays.">Fibre Optic Microarrays.</a> Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).</li><li>Bake, K. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Spectroscopic+Detections.">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li><li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+(SERS).">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li><li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography.">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li><li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers.">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.

في هذا العمل وتبين لنا أن monodisperse شافي 2 حبات المغلفة مع طبقات ثنائية الدهون يؤيد يمكن المحتشدة في صفائف microwell دون الحاجة لاستهداف بروابط على طبقات ثنائية الدهون أو سطح الركيزة، وصفائف يمكن استخدامها لوصف التفاعلات السمية الدهون. ونحن ثابت التفكك المحسوبة لCTx/GM1 ...

الأغشية الدهنية طبقة ثنائية هي هياكل الأساسية في الطبيعة. وتتكون الأغشية الخلوية والأغشية البلازما عضية من طبقات ثنائية الدهون التي تضم عددا من الجزيئات التي هي ضرورية للحياة. تحدث العديد من العمليات إدامة الحياة على سطح الخلايا أو بوساطة الجزيئات المرتبطة الأغشية الدهنية، طبقة ثنائية. في الواقع، تم العثور على العديد من الأدوية العمليات المستهدفة أو الجزيئات أو في الأغشية 1،2. وبالتالي فإنه من الضروري التحقيق في العمليات التحليلية، مثل التفاعلات الكيميائية أو الأحداث ملزمة noncovalent التي تحدث على أسطح الأغشية. لأن الأغشية الطبيعية يمكن أن يكون من الصعب عزل و / أو التفاعل مع أجهزة الاستشعار، والعديد من الباحثين استخدام الأغشية نموذج مبسط لإجراء دراسات تحليلية. ووصف عدد من أنظمة غشاء نموذج في الأدب، بدءا من حويصلات العملاقة التي يمكن أن يكون عشرات ومئات من ميكرون في القطر إلى الجسيمات الشحمية ذات أبعاد النانو 3،4. Alternatively، طبقات ثنائية مستو الدهون تترسب على الدعم الصلبة، أي بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs)، يمكن تشكيلها على عدد من الأسطح المختلفة، واستخدمت على نطاق واسع في التطبيقات الفيزيائية الحيوية، والكيمياء الحيوية، والتحليلية 5. اقتران SLBs مع المواد الكهربائية أو الضوئية يمكن التحقيق في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الغشاء من خلال استخدام التقنيات التحليلية المختلفة. مضان المجهري 6، 7 الكيمياء الكهربائية، التحليل الطيفي الضوئي 8، 9 المجهر التحقيق، مأكل سطح الرنين 10، وقياس الطيف الكتلي 11 كلها قد استخدمت لدراسة بنية وخصائص SLBs. صفائف SLB تقدم براعة إضافية في تصميم أجهزة استشعار لفحوصات متعددة 12،13. تطبيقات أخرى استخدام صفائف SLB لتقليد مفترق التي تشكل بين الخلايا المناعية 14. وقد اختلفت أساليب إعداد للصفائف SLB من microfluنهج idic 15 إلى تلك التي توظف الحواجز المادية بين بقع SLB المجاورة. استخدمت 16 مجموعات أخرى أساليب الطباعة 17، الزخرفة الضوئية 18 ومختلف النهج nanoengineering 19 إلى إنشاء صفائف SLB. في هذه الورقة والفيديو المرفقة ونحن لشرح طريقة لتشكيل المصفوفات SLB عن طريق إيداع SLB المغلفة شافي 2 حبات في صفائف أمر من microwells 20. نشير إلى SLB المغلفة شافي 2 حبات كروية طبقات ثنائية الدهون كما دعمت (SSLBs). هذه التقنية هو امتداد لعمل سابق أن خلق صفائف الحويصلات فوسفورية وbiomembranes المستمدة من مصادر طبيعية 21، التي تبين لنا أيضا نتائج سبيل المثال. وقد اعتمدت أساليب أخرى لarraying جزيئات غشاء حيوي أو حويصلات على أنماط بروابط استهداف محددة على الأسطح التي اقترانه بروابط التكميلية الواردة على سطح الحويصلة. وتشمل الأمثلة البيوتين-جمعية أفيدين 22،23 ومخططات تهجين الحمض النووي 24. نهجنا يتطلب سوى مجموعة microwell مع أي استهداف أو الاعتراف الأنصاف اللازمة. ويعرف حجم SSLBs من قبل قطر تدعم حبة شافي 2، والتي تعاني من انخفاض بولي التبعثر. عن طريق ضبط قطر microwell للتو أكبر من قطر SSLB، سوى SSLB واحدة يستقر في كل microwell. A بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) ممسحة ثم يزيل من على سطح الأرض كل SSLBs التي لا يجمد في microwells. وmicrowells والمصفوفات SSLB الناتجة لديها كثافة عالية (~ 10 5 SSLBs / مم 2) مع 3 ميكرون مركز إلى مركز تباعد وتيرة سداسية. عن طريق إيداع متسلسل SSLBs مع التراكيب الدهون مختلفة، فمن الممكن لإنشاء صفائف متعدد المكونات مع SSLBs وضعه بشكل عشوائي. للتدليل على قدرة الاستشعار صفائف SSLB، استخدمنا تفاعل بكتيريا الكوليرا (CTX) مع غانغليوزيد (GM1) دمجها في SSLBs. معجزيئات الغشاء الطبيعي، تمكنا من الكشف عن نسبة الدهون في خلايا محددة في المصفوفات المتعددة المكونات التي تحتوي على مادة غشاء من اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية تشكل أغشية البلازما من الخلايا وتحديد العضيات التحت خلوية حدود. في الطبيعة، وهذه الأغشية هي مزيج غير متجانس من العديد من أنواع الدهون، وتحتوي على بروتينات غشاء محدد وزينت مع الكربوهيدرات. في بعض التجارب، فمن المستحسن أن فصل الخصائص الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية أو من طبقة ثنائية المادة الدهنية من تلك الغشاء الطبيعية. مثل هذه الحالات تدعو إلى استخدام نظم نموذج مثل حويصلات العملاقة، الجسيمات الشحمية أو طبقات ثنائية الدهون المدعومة (SLBs). صفائف SLBs جذابة بشكل خاص للتطبيقات الاستشعار عن بعد ومحاكاة التفاعلات خلية خلية. نحن هنا تصف طريقة جديدة لتشكيل المصفوفات SLB. والمغلفة Submicron قطرها شافي 2 حبات الأولى مع طبقات ثنائية الدهون لتشكيل SLBs كروية (SSLBs). ثم تترسب حبات في مجموعة من microwells submicron ذات القطر الصغير التجهيز. يستخدم تقنية التحضير ل&quot;ممسحة&quot; لتنظيف سطح الركيزة، في حين اغادرز وراء SSLBs التي استقرت في microwells. يتطلب هذا الأسلوب أي تعديل الكيميائية الركيزة microwell، ولا أي بروابط تستهدف بشكل خاص على SSLB. ويشغل Microwells بواسطة الخرز واحد لأن يتم ضبطها قطر جيدا أن مجرد أكبر من قطر حبة. عادة، يتم المحتلة أكثر من 75٪ من الآبار، في حين أن بقية تبقى فارغة. في المخزن عرض صفائف SSLB الاستقرار على المدى الطويل من الاسبوع أكبر من واحد. أنواع متعددة من SSLBs يمكن وضعها في مجموعة واحدة عن طريق ترسب المسلسل، وصفائف يمكن استخدامها للاستشعار، والتي علينا أن نظهر من خلال تميز تفاعل بكتيريا الكوليرا مع غانغليوزيد GM1. وتبين لنا أيضا أن الحويصلات فوسفورية دون الدعم حبة وbiomembranes من مصادر الخلوية يمكن المحتشدة مع نفس الأسلوب ويمكن تحديد نسبة الدهون في غشاء الخلية محددة.

عندما يتم خلط شافي 2 حبات بمحلول مكون من حويصلات مؤلفة من الدهون الفوسفاتية والدهون الفلورسنت والدهون الأخرى مثل gangliosides، تمزق الحويصلات على السطوح حبة شافي 2 لتشكيل SSLBs، كما هو مبين تخطيطي في الشكل 1A. بعد غسل SSLBs، يتم وضع قطرة من حل SSLB على مجموعة micr...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method at JoVE.com

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

طبقات ثنائية الدهون بدعم والجزيئات الغشاء الطبيعية هي أنظمة مريحة التي يمكن تقريب خصائص أغشية الخلايا وإدراجها في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات التحليلية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لإعداد ميكروأرس تتكون من أيد الدهون المغلفة طبقة ثنائية شافي 2 حبات، حويصلات فوسفورية أو جزيئات الغشاء الطبيعية.

تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  University of Minnesota.  طبقات ثنائية الدهون بدعم والجزيئات الغشاء الطبيعية هي أنظمة مريحة التي يمكن تقريب خصائص أغشية الخلايا وإدراجها في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات التحليلية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لإعداد ميكروأرس تتكون من أيد الدهون المغلفة طبقة ثن?...

Video: Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

الذهب Nanostar التجميعي مع أسلوب بذور فضة النمو وساطة

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

تلفيق من الآبار المخصصة [اغروس] لبذر الخلية والأنسجة خاتم التجميع الذاتي باستخدام قوالب طباعة 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.