עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לSHO מן המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM092993), הקרן הלאומית למדע (NSF פרס הקריירה וDBI 0,964,216), משרד מחקר של צי (ONR) צעיר תכנית החוקר ופרס מינסוטה השותפות לביוטכנולוגיה וג&#39;נומיקס הרפואי. ייצור מכשיר בוצע במרכז אוניברסיטת מינסוטה Nanofabrication (NFC), שזוכה לתמיכה מNSF דרך רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומית. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים למר מהמכונים הלאומיים לבריאות (NS048357, R21 NS073684), יסודות האגודה הלאומית הטרשת הנפוצה (CA1060A11), אפלבאום, הילטון, פיטרסון וסנפורד ומשפחת McNeilus. המחברים מבקשים להודות Hyungsoon Im לסיוע עם איורים וShailabh קומאר לקבלת סיוע במיקרוסקופיית אלקטרונים.

1. Microfabrication של תשתית מערך microwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם פרוסות סיליקון 4 אינץ&#39; עם של תחמוצת מבוגרת תרמית 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין SPR-955 0.7 photoresist על פרוסות סיליקון ב4,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף photoresist. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במסיכה שתיצור 1 מיקרומטר חורים מסודרים במערך משושה עם 3 מיקרומטר תקופה שבה המערך משתרע על שטח מ&quot;מ x 2 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף רקיק בצעד i-קו באמצעות גודל צעד של 6 מ&quot;מ וחשיפה של 200 mJ / 2 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח באמצעות מפתח ספין להפקיד 2 שלוליות של CD-26 על פרוסות סיליקון לזמן פיתוח כולל של 90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחרוט תחמוצת בחרט תגובתי יון ל6 דקות עם 50 SCCM של Ar, 25 SCCM של 4 CF, ו50 SCCM של 3 CHF פלואגף בלחץ של 75 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחרוט סיליקון בחרט תגובתי יון עמוק תעלת ICP עבור 2 דקות עם 63 SCCM של 4 C F 8, 27 SCCM של SF 6, 40 SCCM של Ar, ו10 SCCM של O 2 זורם בלחץ של 14 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף באצטון, מתנול, וisopropanol להסיר להתנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום באמבטיה של H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 ל10 דקות כדי לנקות את השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד 1,080 Å של Al 2 O 3 על ידי בתצהיר שכבה אטומי ב250 ° C. </li></ol> 2. הכנה של פולי (dimethylsiloxane) מגב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, לעבוד בחדר נקי. אחרת לעבוד בסביבה הנקיה ביותר האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג צלחת פטרי מפלסטיק (או מיכל חד פעמי נקי אחר) עם ≥ צדדים 13 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , במנה שישפוך את 5 סוכן ריפוי PDMS גרם, ואחריו 50 bas PDMS גרםסוכן דואר (או כל דבר עם יחס 1:10 שבעיקר ימלא את צלחת פטרי). מערבבים היטב עם טפטפת פלסטיק חד פעמי או מוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות על ידי הצבת PDMS המעורבת בתא עם קו ריק, החלת ואקום עד בועות יצאו מהתערובת (כ 30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא כבר בצלחת פטרי, לשפוך PDMS בצלחת פטרי, הימנעות יצירה של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא לילה על פלטה חמה ב&gt; 50 מעלות צלזיוס (חום גבוה יותר עבור פחות זמן גם עובד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סכין גילוח חדש / נקי, לחתוך בזהירות חתיכה כ 2.5 x 2.5 סנטימטר מלבני, שמירה על משטח עליון נקיים ככל האפשר. לקלף עם מלקחיים נקיים. לקצץ את קצה אחד (עד 1.5 סנטימטר) על ידי לחיצה על סכין גילוח בתנועה אחת, כדי להפוך את הקצה עליון חד ככל האפשר (זה יהיה בקצה המשמש בתהליך המגב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי עם אצטון, מתנול, אלכוהול איזופרופיל, ומים די ultrapure, ולאחר מכן מכה יבשה בגז חנקן נקי. אחסן בצלחת פטרי נקייה. </li></ol> 3. הכנת שלפוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פתרונות שומנים המניה של phosphatidylcholine ביצת 25 מ&quot;ג / מיליליטר (PC) ו1 מ&quot;ג / מיליליטר 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (rhodamine lissamine B sulfonyl) מלח אמוניום (Rho-DPPE) בכלורופורם ו0.5 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של monosialoganglioside GM1 בכלורופורם / מתנול (2:1 V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבקבוקון זכוכית קטנה לעשות תערובת כי התוצאות במחשב 97% mol, 2% mol% mol Rho-DPPE GM1 ו1 על ידי הוספת 18.9 μl של 25 מחשב מ&quot;ג / מיליליטר, 39.6 μl של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר GM1 ו7.9 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר Rho-DPPE באמצעות מזרקים זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה:. החומר המשלים עבור Nair et al 25 מכיל גיליון אלקטרוני של Excel להתאמה אישית מצוין לחישוב הסכומים של שומנים הנדרשים כדי ליצור שלפוחית ​​של כל הרכב רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוקון בייבוש ואקום ולהסיר הממס על ידי השארת הבקבוקון תחת ואקום במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תמיסה מימית של 0.1M NaCl. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון M NaCl 0.1 לבקבוקון המכיל את סרט שומנים בדם היבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תערובת השומנים המימית לנוח למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל בקצרה מערבולת כדי ליצור השעיה שלפוחית, אז sonicate עבור 20 דקות בsonicator אמבטיה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Extrude ההשעיה השלפוחית ​​דרך קרום פוליקרבונט עם 100 גודל נקבובית ננומטר. לעבור את ההשעיה השלפוחית ​​דרך 17x המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את שלפוחית ​​extruded בבקבוקון זכוכית ב 4 ° C. </li></ol> 4. כינונה של bilayers שומנים נתמכים כדורי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 700 2 חרוזים SiO קוטר ננומטר. חרוזים מסופקים במים מזוקקים עם ריכוז מניות של 1.4 x 10 11 מיליליטר / חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להכין השעיה חרוז 1 מיליליטר עם ריכוז של 1.5 x 10 10 מיליליטר / חרוזים ידי הוספת 107 μl של פתרון מניות חרוז ל893 μl של 0.1 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ההשעיה כדי להבטיח שהוא גם מיילXED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב1,700 XG עבור 20 דקות לאחר מכן לבטל את supernatant. Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של 0.1 M NaCl. חזור על פעולה זו עוד פעמיים כדי לשטוף ביסודיות את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את SSLBs, בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להוסיף 25 μl של ההשעיה חרוז SiO 2 200 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר השעיה שלפוחית. מערבולת את התערובת ולתת לעמוד במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. בשלב זה ריכוז SSLB צריך להיות 1.7 x 10 9 מיליליטר / SSLBs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,700 XG עבור 20 דקות עד גלולה SSLBs. גלולה אמורה להופיע ורוד בשל הקרע של שלפוחית ​​עם Rho-DPPE בחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend ב 225 פוספט μl סליין (PBS), pH = 7.4. חזור על שלבי 4.6-4.7 עוד פעמיים כדי להסיר את כל שלפוחית ​​unruptured מהשעית SSLB. </li></ol> 5. עצרת של מערך SSLB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקיק קליב של מערכי microwell וכתוצאה מחתיכות מלבניות עם 4-6 מיקרופוןמערכי Rowell ליחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לערבב את ההשעיה SSLB, ואז למקם 10 μl של ההשעיה SSLB על כל מערך microwell. שמא מנוחה לשעה 1 כדי לאפשר SSLBs להתיישב על פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את שבב מערך microwell עם PBS מבקבוק לשטוף, ואז להשקיע באמבטית PBS שהוכנה בצלחת רדודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם מתחת למים, מניח בעדינות את סומק PDMS מגב על שבב מערך microwell ועדינות חלק אותו על פני השטח 5x כדי להסיר SSLBs שאינם משותקים בmicrowells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גריפ שבב מערך microwell עם פינצטה ובעדינות לנער באמבטיה PBS להסיר כל SSLBs עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את השבב מאמבטית המגב ומניח באמבט PBS טרי עד לשימוש נוסף. ודא שהמשטח העליון של השבב נותר לח כדי לשמר את SSLBs. </li></ol> הערה: שיטת ההרכבה שתוארה לעיל יכולה לשמש ליצירת מערכים של חלקיקי קרום טבעיים, כמו חלקיקי מיאלין מבודדים ממוח עכבר, או פושלפוחית ​​spholipid ללא תומך חרוז SiO 2. עבודה זו מתוארת בפירוט וביטנברג ואח&#39;. 21 ותוצאות נציג מוצגות להלן. 6. Assay עקידת רעלן כולרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר של אלבומין בסרום השור (BSA) ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עם ריכוז רצוי של אלקסה 488 מצומדות רעלן הכולרה B-למקטע ב-PBS עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שבב מערך SSLB מאמבטית PBS ופתיל משם את רוב פתרון PBS באמצעות מעבדה לנגב. השאר מספיק PBS על השבב כדי לשמור על מערך SSLB התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע ספציפי מחייב, להוסיף 200 μl של 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון BSA לשבב מערך SSLB. תן מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם micropipette, להסיר 200 μl של פתרון מהחלק העליון של שבב מערך SSLB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון רעלן הכולרה לשבב מערך SSLB ולתת מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את שבב מערך SSLB עם PBS מבקבוק לשטוף כדי להסיר כל רעלן הכולרה מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS משם העודף וויק באמצעות מעבדה לנגב. לפני ההדמיה כיסוי שבב עם תלוש לכסות x 40 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי תמונה עם מיקרוסקופ זקוף באמצעות מסנן קובע מתאימים לfluorophores של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את עוצמת הקרינה של SSLBs הבודד במערך באמצעות פונקצית ניתוח חלקיקים האוטומטית של תוכנת ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל עוצמות הקרינה ממוצעת מSSLBs הבודד לתוך היסטוגרמות המסכמות את העוצמות של SSLBs לציין במערך נתון. </li></ol>

<ol>
	<li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery:+A+Historical+Perspective.">Drug discovery: A Historical Perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).</li><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Membrane+Receptor+Screening+and+Analysis.">Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis.</a> J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).</li><li>Voskuhl, J., Ravoo, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Recognition+of+Bilayer+Besicles.">Molecular Recognition of Bilayer Besicles.</a> Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Supported+Lipid+Bilayers:+From+Biophysical+Studies+to+Sensor+Design.">Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design.</a> Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Steps+of+Supported+Bilayer+Formation+Probed+by+Single+Vesicle+Fluorescence+Assays.">Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays.</a> Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Mono-+and+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Au+and+Hg.">Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg.</a> Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).</li><li>Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Coherent+anti-Stokes+Raman+Scattering+Imaging+of+Lipid+Distribution+in+Coexisting+Domains.">Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains.</a> Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).</li><li>Richter, R. P., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+Formation+of+Supported+Lipid+Bilayers+on+Mica:+A+Study+Combining+AFM,+QCM-D,+and+Ellipsometry.">Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry.</a> Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).</li><li>Dahlin, A., Z&#228;ch, M., Rindzevicius, T., K&#228;ll, M., Sutherland, D. S., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Surface+Plasmon+Resonance+Sensing+of+Lipid-Membrane-Mediated+Biorecognition+Events.">Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).</li><li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+Separation+of+Lipid+Membranes+Analyzed+with+High-Resolution+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry.">Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).</li><li>Groves, J. T., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropattern+Formation+in+Supported+Lipid+Membranes.">Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes.</a> Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).</li><li>Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., V&#246;r&#246;s, J., Stadler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+and+Lipid+Bilayer+Arrays+Towards+Biosensing+Applications.">Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications.</a> Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).</li><li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+in+Studies+on+Immune+Cell+Adhesion+and+Communication.">Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication.</a> J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .</li><li>Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Phospholipid+Bilayer-Coated+Microchannels+for+On-Chip+Immunoassays.">Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays.</a> Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).</li><li>Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+Fluid+Lipid+Bilayers+on+Solid+Supports.">Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports.</a> Science. 275 (5300), 651-653 (1997).</li><li>Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+Composition+Arrays+of+Supported+Lipid+Bilayers+by+Microcontact+Printing.">Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing.</a> Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).</li><li>Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Photochemical+Patterning+and+Refunctionalization+of+Supported+Phospholipid+Bilayers.">Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).</li><li>Kelly, C. V., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofabrication+for+the+Analysis+and+Manipulation+of+Membranes.">Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Arrays+of+Submicron+Spherical+Supported+Lipid+Bilayers.">High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers.</a> Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).</li><li>Wittenberg, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+Assembly+of+Micro-+and+Nanoarrays+for+Sensing+with+Natural+Cell+Membranes.">Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes.</a> ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).</li><li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels.">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).</li><li>Kalyankar, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arraying+of+Intact+Liposomes+into+Chemically+Functionalized+Microwells.">Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells.</a> Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).</li><li>Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., H&#246;&#246;k, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Self-Assembly+of+Single+Lipid+Vesicles+in+Nanoplasmonic+Apertures+in+Gold.">Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold.</a> Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).</li><li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Patterned+Supported+Lipid+Membranes+to+Investigate+the+Role+of+Receptor+Organization+in+Intercellular+Signaling.">Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling.</a> Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).</li><li>Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+Binding+Affinity+and+Specificity+for+Gangliosides+Determined+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.</a> Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).</li><li>Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometer-Sized+Supported+Lipid+Bilayer+Arrays+for+Bacterial+Toxin+Binding+Studies+Through+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).</li><li>Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1+Clustering+Inhibits+Cholera+Toxin+Binding+in+Supported+Phospholipid+Membranes.">GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).</li><li>Gill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arrangement+of+Subunits+in+Cholera+Toxin.">The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin.</a> Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).</li><li>Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+Supported+Lipid+Bilayers+Containing+Monosialoganglioside+GM1:+A+QCM-D+and+FRAP+study.">Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study.</a> Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).</li><li>Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibre+Optic+Microarrays.">Fibre Optic Microarrays.</a> Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).</li><li>Bake, K. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Spectroscopic+Detections.">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li><li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+(SERS).">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li><li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography.">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li><li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers.">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li><li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

בעבודה זו אנו מראים כי SiO 2 חרוזים monodisperse מצופים bilayers שומנים נתמכים ניתן ערוכים למערכי microwell ללא צורך במיקוד ligands על bilayers השומנים או פני המצע, והמערכים יכולים לשמש לאפיון אינטראקציות רעלן שומנים בדם. אנו קבועים דיסוציאציה שמחושבים לCTx/GM1 מחייב משווה לטובה, בהתחשב ...

קרומי bilayer שומנים הם מבנים חיוניים בטבע. ממברנות פלזמה נייד וקרומים אברון מורכבים מbilayers שומנים המשלבים מספר המולקולות שאינן הכרחיים לחיים. תהליכי חיים מקיימים רבים מתרחשים על פני השטח של תאים או מתווכים על ידי מולקולות הקשורות לממברנות שומנים בדם bilayer. למעשה, תהליכים רבים תרופות יעד או מולקולות נמצאים על או בקרומי 1,2. לכן, יש לחקור בצורה אנליטית תהליכים, כגון תגובות כימיות או אירועים המחייבים noncovalent המתרחשים על פני שטח של קרום. מכיוון שקרומים טבעיים יכולים להיות קשים לבודד ו / או ממשק עם חיישנים, חוקרים רבים להעסיק ממברנות מודל פשוטות לבצע מחקרים אנליטיים. מספר מערכות קרום מודל מתוארים בספרות, החל משלפוחית ​​ענקית שיכולים להיות עשרות עד מאות מיקרונים בקוטר ליפוזומים עם ממדים ננומטריים 3,4. Alternatively, bilayers שומנים מישוריים שהופקד על תמיכה מוצקה, כלומר, נתמך bilayers שומנים (SLBs), יכול להיווצר במספר המשטחים השונים והיה בשימוש נרחב ביישומי biophysical, ביוכימיות, ואנליטיות 5. צימוד SLBs עם חומרים חשמליים או אופטיים מאפשר חקירה לביוכימיה וביופיסיקה קרום באמצעות השימוש בטכניקות אנליטיות שונות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי 6, אלקטרוכימיה 7, ספקטרוסקופיה אופטית 8, בדיקה סריקה מיקרוסקופית 9, plasmon משטח התהודה 10, וספקטרומטריית מסת 11 כולם הועסקו כדי לחקור את המבנה והמאפיינים של SLBs. מערכי SLB להציע צדדיות נוספת בעיצוב של חיישנים עבור מבחני זמנית 12,13. יישומים אחרים להשתמש במערכי SLB לחקות את הצומת שיוצרת בין תאים חיסוניים 14. שיטות הכנה למערכי SLB השתנו מmicrofluidic גישות 15 לאלה שמעסיקים מחסומים פיזיים בין טלאי SLB הסמוכים. 16 קבוצות אחרות השתמשו בשיטות הדפסה 17, דפוסים פוטו 18 וnanoengineering השונות גישות 19 ליצור מערכי SLB. במאמר זה ובוידאו המצורף אנו מדגימים שיטה ליצירת מערכי SLB ידי הפקדת SiO 2 חרוזים מצופים SLB למערכים מסודרים של microwells 20. אנו מתייחסים לSiO 2 חרוזים מצופים SLB כbilayers הכדורית נתמכת שומנים (SSLBs). טכניקה זו היא הרחבה של עבודה קודמת שיצרו מערכים של שלפוחית ​​פוספוליפידים וbiomembranes נגזר ממקורות טבעיים 21, שממנו אנחנו גם להראות תוצאות ירושלים. שיטות אחרות לעריכת חלקיקי biomembrane או שלפוחית ​​יש לסמוך על דפוסים של ligands מיקוד הספציפי על משטחים שמקשרים עם ligands המשלים הכיל על פני השטח של השלפוחית. דוגמאות כוללות יוטיןעמותת avidin 22,23 וערכות הכלאת DNA 24. הגישה שלנו דורשת רק מערך microwell ללא moieties מיקוד או הכרה הכרחי. הגודל של SSLBs מוגדר על ידי הקוטר של תומך חרוז SiO 2, שיש לי poly-dispersity נמוך. על ידי כוונון קוטר microwell רק גדול יותר מאשר קוטר SSLB, רק SSLB אחת ישקע לתוך כל microwell. מגב פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) ואז מסיר מעל פני השטח כל SSLBs שאינם משותקים בmicrowells. יש לי microwells ומערכי SSLB תוצאת צפיפות גבוהה (~ 10 5 SSLBs / 2 מ&quot;מ) עם 3 מיקרומטר מרווח ומחזוריות משושה מרכז למרכז. באופן סדרתי הפקדת SSLBs עם קומפוזיציות שומנים שונות, אפשר ליצור מערכי multicomponent עם SSLBs ממוקם באופן אקראי. כדי להדגים את יכולת החישה של מערכי SSLB, השתמשנו באינטראקציה של רעלן הכולרה (CTX) עם ganglioside (GM1) שולב SSLBs. עםחלקיקי קרום טבעיים, שהיינו מסוגלים לזהות שומני תא ספציפי במערכי multicomponent מכילים חומר קרום משני סוגי תאים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

קרומי bilayer שומנים מהווים את קרום הפלזמה של תאים ולהגדיר את הגבולות של אברונים subcellular. בטבע, קרומים אלה תערובות הטרוגנית של סוגים רבים של שומנים, מכילים חלבוני קרום הנכנס ומעוצבים עם פחמימות. בניסויים מסוימים, רצוי לנתק את מאפייני biophysical או ביוכימי של bilayer שומנים מאלה של הקרום הטבעי. מקרים כאלה קוראים לשימוש במערכות מודל כגון שלפוחית ​​ענקית, ליפוזומים או bilayers נתמכת שומנים (SLBs). מערכים של SLBs הם אטרקטיביים במיוחד ליישומי חישה ומחק תאי תאי אינטראקציות. כאן אנו מתארים שיטה חדשה ליצירת מערכי SLB. 2 חרוזים SiO submicron בקוטר הם מצופים ראשון עם bilayers שומנים ליצירת SLBs הכדורי (SSLBs). אז חרוזים מופקדים לתוך מערך של microwells submicron בקוטר מפוברק מיקרו. טכניקת ההכנה משתמשת &quot;מגב&quot; כדי לנקות את שטח המצע, בעוד leavinגרם מאחורי SSLBs שהתמקם microwells. שיטה זו לא דורשת שינוי כימי של מצע microwell, ולא כל ligands מיקוד מיוחד על SSLB. Microwells תפוס על ידי חרוזים בודדים בגלל הקוטר גם הוא מכוון להיות גדול יותר מקוטר חרוז. בדרך כלל, יותר 75% מהבארות שנכבשו, ואילו השאר יישאר ריק. במאגר מערכי SSLB להציג יציבות לטווח הארוך של יותר משבוע אחד. סוגים שונים של SSLBs יכולים להיות ממוקמים במערך יחיד בתצהיר סדרתי, והמערכים יכולים לשמש לחישה, שאנחנו מדגימים על ידי המאפיינים את האינטראקציה של רעלן הכולרה עם ganglioside GM1. כמו כן, אנו מראים כי שלפוחית ​​פוספוליפידים ללא תומך חרוז וbiomembranes ממקורות סלולריים יכולה להיות מסודרת עם באותה השיטה וניתן לזהות שומני קרום תא ספציפי.

כאשר 2 חרוזים SiO מעורבבים עם תמיסה של שלפוחית ​​המורכבת מפוספוליפידים, שומני ניאון ושומנים אחרים כגון gangliosides, שלפוחית ​​הקרע במשטחי חרוז SiO 2 כדי ליצור SSLBs, כפי שמוצגת באופן סכמטי באיור 1 א. לאחר שטיפת SSLBs, ירידה של פתרון SSLB מושם על מערך microwell, והחרו...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method at JoVE.com

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  University of Minnesota.  bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספ...

Video: Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.