Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium f&#252;r Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.

1. إعداد رابط كاسيت (LC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 40 ميكرولتر من LC1 قليل النوكليوتيد (الجدول 1)، و 40 ميكرولتر من LC2 قليل النوكليوتيد (الجدول 1، مع تقييد انزيم عبء السليم)، و 110 ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك (100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، و 10 ميكرولتر 250 ملم MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5MIN والسماح للتفاعل يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 300 ميكرولتر H 2 O والتركيز dsLinker الحمض النووي على فلتر الطرد المركزي. إضافة 80 ميكرولتر H 2 O إلى شطافة وقسامة 10 ميكرولتر من استعداد رابط الكاسيت في 0.2 أنابيب PCR. </li></ol> 2. Preamplification من ناقلات الجينوم المفارق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز عينات من الحمض النووي. ماصة ميكرولتر س (1-1،000 نانوغرام للLAM/100-1، 000 نانوغرام للnrLAM) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وركض فيجنرال الكتريك من 0،5 حتي 25 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 2 ميكس (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي مع كل عينة الحمض النووي في 0.2 مل أنابيب PCR. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preamplify ناقلات تقاطعات الجينوم باستخدام PCR الظروف المتمثلة في الجدول 2. بعد الانتهاء من PCR إضافة 0.5 ميكرولتر طق البلمرة إلى كل أنبوب PCR وبرنامج PCR باعادتها. ويمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol> 3. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخرز المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر (200 ميكروغرام) من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في أنبوب 1.5 مل وفضح لمدة 1 دقيقة على فاصل الجسيمات المغناطيسية (MPS) في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من MPS و resuspend حبات مغناطيسية في 40 ميكرولتر الحزب الاشتراكى البرازيلى / 0.1٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.5). فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل حبات وايال 20 ميكرولتر من 3 M LiCl الحل (3 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA) لفضح MPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. الخرز resuspend في 50 ميكرولتر من LiCl M 6 الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج تفاعل PCR بأكمله من الخطوة 2.2 مع 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المعدة. احتضان الأفقي على شاكر (300 دورة في الدقيقة) على الأقل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة تسمح ملزمة من الناتج PCR البيروكسيديز إلى streptavidin المغلفة الخرز (مجمع الحمض النووي الخرزة). يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف، و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. الشروع فورا في الخطوة 4 للام أو خطوة 5 لnrLAM. </li></ol> 4. LAM-الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضعف ستراند الحمض النووي (dsDNA و) التجميعي (LAM فقط) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 للنواب لمدة 1 دقيقة وديسبطاقة طاف. إضافة 8.25 ميكرولتر من H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X hexanucleotide، 0.25 ميكرولتر dNTPs (10 ملم) و 0.5 ميكرولتر (2 U) Klenow البلمرة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييد دايجست <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 8.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر العازلة 10X تقييد انزيم و 0.5 ميكرولتر من انزيم التقييد واحتضان رد فعل لمدة 1 ساعة. كرر الخطوة 4.1.2. ملاحظة: احتضان رد الفعل في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للانزيم التقييد. تأكد من أنه لا يوجد أي قيود موجودة في موقع أو المصب من موقع ملزم التمهيدي تستخدم لpreamplification في الحمض النووي من الفائدة. لاختيار مجموعات انزيم تقييد الانزيمات / تقييد مناسبة الرجوع إلى 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط س من رابط (LK) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 10X فاست لينك العازلة، 1 ميكرولتر ATP (10 ملم)، 2 ميكرولتر رابط الكاسيت من الخطوة 1.2، و 1 ميكرولتر سريعة لينك الحمض النووي يغاز (2 U / ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 4.1.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمسخ من تجميعي dsDNA و <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. معقدة في resuspend الحمض النووي الخرزة في 5 ميكرولتر 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع preamplified تقاطع ناقلات الجينوم تحتوي على طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 6 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 5. nrLAM-الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط واحد الذين تقطعت بهم السبل من رابط (SSLC) (nrLAM فقط) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة من الخطوة 3.3 إلى MPSلمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. إضافة 6.5 ميكرولتر H 2 O، CircLigase 1 ميكرولتر العازلة 10X رد الفعل، 0.5 ميكرولتر MnCl 2 (50 ملم)، و 0.5 ميكرولتر ATP (1 ملم)، 1 ميكرولتر ssLinker نيوكليوتيدات دقيقة و 0.5 ميكرولتر CircLigase (100 U / ميكرولتر). احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 90 ميكرولتر من H 2 O وفضح لMPS لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. تعرض مرة أخرى لMPS لمدة 1 دقيقة، طاف تجاهل و resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 10 ميكرولتر H 2 O. </li></ol></li></ol> 6. الأسي التضخيم أنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 4.4.2 (LAM) أو 5.1.2 (nrLAM)) إلى 0.2 مل أنبوب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 3. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 6.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم بواسطة PCR CONDITIOنانوثانية يتضح في الجدول 3. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 7. الفصل المغناطيسي للPCR المنتج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حبات مغناطيسية كما حدث مثلا في خطوات 3.1.1 - 3.1.3. الخرز resuspend في 20 ميكرولتر (للام) أو 50 ميكرولتر (لnrLAM) من 6 م LiCl الحل (6 M LiCl، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA). مزيج 20 ميكرولتر (LAM) أو 50 ميكرولتر (nrLAM) من رد فعل PCR من الخطوة 6.1.2 مع حبات مغناطيسية استعداد (الخطوة 7.1)، واحتضان على شاكر الأفقي (300 دورة في الدقيقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن المحتضنة معقدة حبة الحمض النووي على شاكر بين عشية وضحاها أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 100 ميكرولتر حبة H 2 O. فضح معقدة الحمض النووي حبة لMPS لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend معقدة الحمض النووي الخرزة في 20 ميكرولتر (LAM) أو 5 ميكرولتر (nrLAM) 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. Incuباتي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر الأفقي، فضح لMPS لمدة 1 دقيقة وجمع الحمض النووي التي تحتوي على تضخيم طاف في أنبوب جديد 1.5 مل. الشروع فورا في الخطوة 8.1 أو مخزن طاف في -20 درجة مئوية. </li></ol> 8. الأسي التضخيم الثاني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (من الخطوة 7.3) إلى 0.2 مل أنبوب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول رقم 4. إضافة 48 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 8.1.1 وتضخيم ناقلات تقاطعات الجينوم ظروف PCR يتضح في الجدول رقم 4. يمكن تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور (NR) منتجات LAM-PCR، تحميل 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 8.1.2 على 2٪ agarose هلام. إذا نطاقات واضحة وتحليل 10 ميكرولتر من المنتج LAM-PCR على هلام عالية الدقة. تنبيه: إتبروميد hidium هو التشوهات الخلقية. العمل بعناية فائقة ودائما ارتداء القفازات المناسبة. </li></ol> 9. إعداد لارتفاع الإنتاجية تسلسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية (NR) منتجات LAM-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 40 ميكرولتر PCR المنتج من الخطوة 8.1.2 مع 44 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة AMPure XP الخرز المغناطيسي. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفضح لMPS ل2 دقيقة إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ويغسل مرتين مع 200 ميكرولتر 70٪ ETOH على MPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend معقدة الحمض النووي في 30 ميكرولتر حبة H 2 O. احتضان 1 دقيقة ونقل طاف لأنبوب 0.2 مل الطازجة. تحديد تركيز الحمض النووي تنقيته. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fusionprimer PCR لإضافة محولات تسلسل معين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة لتحليلها إعداد 50 ميكرولتر PCR التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ميكرولتر س (40 نانوغرام) من الحمض النووي إلى 0.2 مل أنبوب PCR. يجب أن يكون حجم الحمض النووي على قدم المساواة في كل عينة وفي حدود 0،5 حتي 25 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 5 إضافة (50 - س). ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل عينة من الخطوة 9.2.2 وإدخال محولات تسلسل إلى (NR) منتجات LAM-PCR PCR الظروف المتمثلة في الجدول 5 منتجات PCR. يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام أو على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور Fusionprimer-PCR تحميل المنتجات 10 ميكرولتر من المنتج PCR من الخطوة 9.2.3 على 2٪ agarose هلام. تنقية المنتج PCR المتبقية كما هو موضح في الخطوات 9.1.1 - 9.1.3. تحليل 1 ميكرولتر منتج PCR تنقيته من الخطوة 9.4 على الآلية عالية الدقة الجهاز الكهربائي لقياس بدقة تركيز وجزء حجم المنتجات Fusionprimer-PCR. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples.">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li><li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li><li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration.">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li><li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1/mariner+transposable+elements.">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li><li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection.">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li><li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR.">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li><li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiarm+high-throughput+integration+site+detection:+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis.">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li><li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer.">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li><li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing.">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1.">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li><li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients.">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li><li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk.">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li><li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle.">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li><li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy.">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li><li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains.">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li><li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors.">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li><li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome.">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li><li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy.">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li><li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo.">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity.">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li><li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases.">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li><li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis.">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li><li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import.">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li><li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites.">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تقنية LAM-PCR يسمح تحديد تسلسل الحمض النووي المجهولة التي تكتنف المنطقة الحمض النووي المعروف. بسبب حساسية عالية الناجمة عن preamplification من تقاطعات مع الاشعال محددة التهجين في تسلسل الحمض النووي المعروف، فمن الممكن لتضخيم وكشف حتى تقاطعات نادرة وصولا الى مستوى خلية واحدة. ?...

الخطي التضخيم بوساطة PCR (LAM-PCR) يسمح تحديد وتوصيف غير معروف الحمض النووي DNA المرافقة مجاورة ليعرف من أي منشأ. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير LAM-PCR في توطين مواقع التكامل ناقلات فيروسية (IS) في الجينوم المضيف 1،2. العناصر الجينية مثل الفيروسات القهقرية أو ترانسبوزونات دمج الجينوم الخاصة بهم في جينوم المضيف في (شبه) بطريقة عشوائية 3-6. في كثير من الحالات هو حاسمة أن يعرف بالضبط الموقف حيث تتكامل هذه النواقل. وقد ثبت LAM-PCR لتكون متفوقة على التقنيات البديلة مثل بوساطة ربط PCR 7 ومشتقاته أو العكسية PCR 8. حساسية ومتانة هذه الطريقة ينشأ من preamplification الأولي للتقاطعات ناقلات الجينوم واختيار المغناطيسي من المنتجات PCR تضخيمها. مثل الطرق البديلة المذكورة، تعتمد LAM-PCR على استخدام إنزيمات التقييد، وإدخال التحيز في قدرة استرجاع IS 9-11. وبالتالي،ويمكن الكشف عن مجموعة فرعية فقط من مرجع هي (integrome) في رد فعل واحد. يتم التقليل من هذا التحيز من خلال تحليل مواز لعينة معينة باستخدام تركيبات الأمثل للأنزيمات تقييد 9. في الآونة الأخيرة، وهو البديل من التكنولوجيا يطلق عليه غير المقيدة وقد تم تطوير LAM-PCR (nrLAM-PCR) التي تلتف استخدام إنزيمات التقييد ويسمح تحليل الجينوم على نطاق غير منحازة لعينة في رد فعل واحد 9،12. في الماضي، استخدمت LAM-PCR لتحديد فيروس المسبب للمرض هو مما أدى إلى سرطان الدم في عدد قليل من المرضى في التجارب السريرية العلاج الجيني 13-15. منذ ذلك الحين، تم تكييفها LAM-PCR لتحديد IS من ناقلات أخرى دمج (ناقلات lentiviral، ترانسبوزونات) وأيضا لتحديد أنماط التكامل دمج سلبي مثل ناقلات ناقلات الغدة المرتبطة (AAV) أو integrase معيبة ناقلات lentiviral (IDLV) 16 -21. واسعة تنتشر تطبيقات LAM-PCR: التقليديةلاي، ويستخدم على نطاق واسع هذه التقنية لدراسة تكوين نسيلي خلايا الجينات المعدلة في المرضى الذين خضعوا لعلاج الجينات أو لتقييم السلامة الأحيائية أنظمة النواقل رواية كشف السلوك اندماجهم 15،16،22-24. في الآونة الأخيرة، تمكين LAM-PCR تحديد خصوصية وبعيدا عن الهدف من النشاط nucleases مصمم من قبل IDLV محاصرة مقايسة 25. علاوة على ذلك، LAM-PCR يسمح بسهولة لمتابعة مصير الخلايا transduced مع مرور الوقت في كائن حي. وهذا يسمح لتحديد بروتو الجينات المسرطنة وكذلك الورم الجينات القامع وأيضا لدراسة تكون الدم أو سرطان الخلايا الجذعية والبيولوجيا 26-28. أخيرا وليس آخرا، تم تكييفها LAM-PCR لدراسة التنوع مستقبلات خلايا T في الإنسان 29 (وبيانات غير منشورة). ومما يعزز قوة لا يتجزأ من التكنولوجيا من خلال ربط الأسلوب لتقنيات التسلسل العميقة التي تسمح تميز الملايين من المجهول المرافقة الحمض النووي مع واحد النوكليوتيدات صesolution في الجينوم بأكمله. في بروتوكول التالية، ونحن تصف خطوة بخطوة التضخيم وتحديد المرافقة الحمض النووي غير معروف exemplarily لتحديد ناقلات lentiviral IS. يتم سرد أليغنوكليوتيد] المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1. المستخلصة الحمض النووي أو كدنا] من أي مصدر يمكن استخدامها كقالب الحمض النووي لLAM-PCR وnrLAM-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:527px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3001.5000</td>
			<td>Alternative Taq Polymerases may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR Buffer</td>
			<td style="width:203px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">201203</td>
			<td>Use of this buffer is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">dNTP-Mixture</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3015.4020</td>
			<td>or any other dNTPs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Oligonucleotides (Primers)</td>
			<td style="width:203px;">MWG Biotech</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">11206D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PBS</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:120px;">14190-086</td>
			<td>0.1 % wt/vol BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">6M LiCl</td>
			<td style="width:203px;">Roth</td>
			<td style="width:120px;">3739.1</td>
			<td>10 mM Tris-HCl&#160; (pH 7.5)/1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tris-HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:203px;">USB Corporation&#160;</td>
			<td style="width:120px;">22637</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">EDTA</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A1103,0250</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Klenow Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">10104523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Hexanucleotide mixture</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11277081001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Restriction endonuclease</td>
			<td style="width:203px;">NEB</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Fast-Link DNA ligation kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">LK11025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CircLigase ssDNA Ligase Kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">CL4111K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NaOH</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">72068</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agarose LE</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11685660001</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TBE buffer</td>
			<td style="width:203px;">Amresco</td>
			<td style="width:120px;">0658</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A2273,0005</td>
			<td>Ethidium bromide is mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">15628-050</td>
			<td>or any other DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">20 mM NaCl</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">71393-1L</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158501</td>
			<td>for use with 1.5 ml Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158696</td>
			<td>for use with 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PerfectBlue Gelsystem Midi S</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;">40-1515</td>
			<td>or other electrophoresis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TProfessional 96</td>
			<td style="width:203px;">Biometra</td>
			<td style="width:120px;">050-551</td>
			<td>or other Thermocycler for 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Orbital shaker KS 260 basic</td>
			<td style="width:203px;">IKA</td>
			<td style="width:120px;">2980200</td>
			<td>or other horizontal shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR softtubes 0.2 ml</td>
			<td style="width:203px;">Biozym Scientific GmbH</td>
			<td style="width:120px;">711082</td>
			<td>or other 0.2 ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">12682</td>
			<td>or other 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Gel documentation system</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Nanodrop ND-1000 spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Spreadex EL1200 precast gel</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">3497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:360px;">Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">2001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
			<td style="width:203px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

linear amplification mediated pcr &#8211; localization of genetic elements and characterization of unknown flanking dna

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

النتائج LAM-PCR في التضخيم من ناقلات تقاطعات مع حجم الجينوم جزء المحدد لكل تقاطع. حجم الفردية شظايا PCR يعتمد على المسافة بين موقع الحمض النووي المعروف في الجينوم وأقرب موقع تقييد الاعتراف الانزيم. وهذا يسمح تصور تنوع تقاطعات تضخيم في العينات التي تم تحليلها من قبل الكهر?...

Watch this Scientific Journal Video about Linear Amplification Mediated PCR â€“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA at JoVE.com

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

linear-amplification-mediated-pcr-localization-genetic-elements

Research

JoVE Journal

Biology

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

29.9K Views.  National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ).  الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، ...

Video: Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

اتش بوساطة إزالة الجزيئات الجينية في اشارة الى مثقف الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.