وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة 1R21AI094289 إلى إيغور ف. شاراخوف

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

هناك خطوات متعددة حاسمة لتضخيم الحمض النووي بنجاح من عينات كروموسوم البوليتين المصححة. يستخدم البروتوكول استخدام LCM ، وهي طريقة تزيد من الكفاءة الشاملة وتقلل من التعرض للحمض النووي الأجنبي عن طريق إزالة تفاعل الأدوات المادية مع العينة. ومع ذلك ، فإن تضخيم الحمض النووي الأجنبي لا يزال أكبر عثرة محتملة لهذه التجربة. وبالتالي ، خلال العملية برمتها ، من الضروري الحفاظ على العينات محمية من التلوث. طوال مراحل إعداد الشريحة والتشريح الدقيق ، من الضروري غسل إبر تشريح الإيثانول ، والشرائح ، وقسائم الغطاء ، وكذلك مساحة العمل.  كما ينصح بمعالجة الأشعة فوق البنفسجية لجميع المعدات المعمول بها (الإبر والشرائح والأغطية) قبل الاستخدام.
الغشاء على الشرائح تشريح يجعل انتشار الكروموسومات صعبة للغاية.  من المهم استخدام المزيد من المبيض (نصف إلى زوج كامل من المبيضين) عند إجراء هذه الشرائح ، لتوفير فرصة أكبر للعثور على نواة منتشرة بشكل جيد.  كما يوصى باستخدام الأنسجة الطازجة عند صنع الشرائح ، حيث يبدو أن معدلات التضخيم تنخفض مع تقدم الأنسجة في سن 49 وانتشار الكروموسومات يصبح أكثر تحديا.  إعداد الشرائح للقسمة الدقيقة هو الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في هذا البروتوكول.  يجب أن تنتشر الكروموسومات بشكل جيد لتجنب الاستحواذ العرضي على المواد غير المرغوب فيها.  تلطيخ Giemsa يسمح للمستخدم للتحقق من جودة انتشار مع المجهر النقيض المرحلة قبل استخدام نظام microdissection.
ويتيح الجمع بين التحلل الدقيق والتضخيم الفرصة لاستخراج وتحليل الأجزاء الكروموسومية التي تتراوح أحجامها بين المناطق الصغيرة ذات الأهمية وأغلبية الأسلحة.  يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بالحصول على الحمض النووي من مناطق متميزة شكليا مثل الانعكاسات والعصابات euchromatic محددة وinterbands، التيلومريك، المركزية والتكلساتين. يمكن للمستخدم تطبيق مسابير اللوحة المتولدة لفحص الكروموسومات الشاذة ، أو دراسة الأوهام بين الأنواع في loci معينة ، أو توصيف التنظيم المكاني للكروموسومات في نواة ثلاثية الأبعاد سليمة. لتطوير الدهانات الكروموسومية، اخترنا شرائح euchromatic لتجنب تهجين الحمض النووي المتكررة مع مناطق الكروموسومات متعددة. ونتيجة لذلك، حصلنا على لوحة خاصة بالذراع دون استخدام منافس، مثل الحمض النووي الجينومي الكلي أو كسر الحمض النووي C0t-1.
اخترنا استخدام GenomePlex WGA ومجموعات REPLI-G استنادا إلى المراجعات التي قارنت معدل الكفاءة والتسرب من مجموعات تضخيم متعددة 40،44.  وكان أداء المجموعتين أفضل من بين الأساليب المتاحة في كل من معدل التسرب (كان معدل الجينومPlex 12.5٪ مقارنة مع REPLI-g 37.5٪) في 2012. ونسبة العلامات المضخمة (كان لدى GenomePlex معدل تضخيم 45.24٪ مقابل 30.0٪ في REPLI-g) 40.كما قدمت مجموعة GenomePlex كمية أعلى من الحمض النووي ، وبالتالي جعلها مرشحا أفضل لتقنيات المصب المتعددة.  كما تتوفر أيضا مجموعة أدوات لإعادة تضخيم نظام جينومبلس، مما يسمح بمزيد من تضخيم الحمض النووي. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ أن التضخيم ليس مثاليا.  يبقى الاحتمال أن التضخيم الناجح يمكن أن يدخل أخطاء أو يكون له تحيز نحو loci محددة في الحمض النووي المستهدف. ومن المهم النظر في حجم الجزء النهائي من أساليب تضخيم الجينوم المتاحة.  ينتج عن تجزئة GenomePlex مكتبة ذات أجزاء تتراوح بين 200-500 نقطة أساس ، في حين تنتج مجموعة REPLI-g أجزاء من الحجم حوالي 10-20 كيلوبايت. والتطبيق المقصود لهذا البروتوكول في المصب هو FISH، مما يجعل مجموعة GenomePlex خيارا أكثر جدوى، لأنها توفر حجم الشظايا المطلوب والقدرة على تسمية شظايا الحمض النووي مباشرة من خلال WGA. يجب تجزئة جزيئات الحمض النووي الطويلة التي تنتجها تضخيم REPLI-g في رد فعل وضع العلامات على ترجمة في المصب.
تم تكييف هذا البروتوكول لتضخيم الحمض النووي بنجاح من ذراع كروموسوم بوليتين واحد.  تتطلب البروتوكولات الأخرى تجميع العديد من شظايا الكروموسوم (عادة 10-30) من أجل تضخيم العينة بنجاح 7و11و28و40.  على الرغم من أن تجميع الكروموسومات المتعددة ممكن باستخدام طريقتنا ، إلا أن زيادة احتمال تلوث العينة يؤكد على أهمية بدء التجربة مع أقل عدد ممكن من الكروموسومات. إذا لم تتوفر كروموسومات البوليتين، يمكن تكييف بروتوكولنا للاستخدام في الكروموسومات الميتوتيكية. قد يكون من الضروري، ومع ذلك، لتجميع الكروموسومات 10-15 ميتوتيك قبل تضخيم لأسماك ناجحة 11. التحيز التضخيم هو أقل مع كميات عالية من بدء قالب الحمض النووي 50. توفر كروموسومات البوليتين حوالي 512 نسخة من تسلسل الحمض النووي الواحد و 1024 نسخة من تسلسلين متجانسين للحمض النووي.  وبالتالي، فإن تجميع الكروموسومات ميتوتيك تساعد على زيادة الجودة الشاملة للمنتج الحمض النووي بعد تضخيم.
هذا الإجراء له العديد من الاستخدامات المحتملة في الدراسات الجينية الخلوية والجينومية. هنا، استخدمنا دهانات الكروموسوم لإنشاء المراسلات بين شرائح euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. غامبيا. ويمكن تطبيق نفس المسابير اللوحة على توصيف الخلوية من خطوط الخلية الغامبية. إعادة ترتيب الجينوم واسعة النطاق والتغيرات في أعداد الكروموسومات هي السمات الشائعة لخطوط الخلية 51،52. تم الكشف عن الأنوبلويدية، والتعددية، وإعادة ترتيب الكروموسومات مثل عمليات النقل، والانقلابات، والحذف، والكروموسومات الحلقية في خطوط خلايا البعوض المختلفة 53،54. وقد أظهرت الملاحظات الجينية الخلوية الكلاسيكية 55 ورسم الخرائط الفيزيائية 56 حدوث انتقالات كروموسومية كاملة الذراع في تطور بعوض الملاريا. لذلك، يمكن استخدام المواد الممسوصة بالميكروستات جنبا إلى جنب مع تجارب FISH لمقارنة التماثل في المناطق الكروموسومية بين الأنواع. لقد نجحنا في تنفيذ 3D FISH مع مسبار 2R-painting على كروموسومات البوليتين في خلايا ممرضة المبيض الكاملة. هذه الطريقة سوف تسهل تتبع مسارات الكروموسوم ودراسة العمارة النووية في أنوفيليس. تقنيات مثل dna genotyping 57،58، الجيل التالي من تسلسل الجينوم 26،27، المادية وتطوير خريطة الربط ، وتوليد من تحقيقات للكروموسوم اللوحة 33،59 يمكن أن تستفيد جميع من التشحم الدقيق الذراع والمنطقة محددة. من خلال الجمع بين تكنولوجيا LCM والنهوض WGA خلية واحدة، ونحن نظهر كفاءة، وطريقة عملية لإنتاج كميات معقولة من الحمض النووي من ذراع كروموسوم البوليتين واحد.

الكروموسوم اللوحة هي تقنية مفيدة لدراسة تطور karyotypes 1-5 وتصور التشوهات الوراثية الخلوية عن طريق التهجين من الحمض النووي الصبغي المسمى فلوريا 1،6-8. يتم تطبيق هذه الطريقة أيضا على دراسة الديناميات ثلاثية الأبعاد لأقاليم الكروموسوم في التنمية 9 وعلم الأمراض 10. وتستخدم الدهانات الكروموسومية المسماة بشكل تفاضلي لتصور الفردية mitotic 11،12، meiotic 13،14، أو interphase غير البوليتين 15،16 وpolytene 9،11،17 الكروموسومات. ومن شأن وجود بروتوكول بسيط وقوي للحصول على دهانات الكروموسومات أن يكون مفيدا جدا في توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل الكائنات الحية غير النموذجية، مثل البعوض. مجمع أنوفيليس غامبيا هو مجموعة من سبعة بعوض لا يمكن تمييزه من الناحية الشكلية يختلف في السلوك والتكيف، بما في ذلك القدرة على نقل الملاريا.  هذه البعوض بمثابة نموذج ممتاز لفهم أفضل لتطور الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها ناقلات.  وقد أجريت معظم الدراسات الجينية الخلوية في بعوض الملاريا باستخدام كروموسومات متطورة وعالية تعدد الأضلاع (تمت مراجعتها في 18،19). سمحت أنماط الربط القابلة للقراءة لكروموسومات البوليتين للباحثين بإظهار الارتباط بين التقلبات المتعددة الأشكال والتكيفات البيئية في Anopheles gambiae 20. أيضا، وقد تم وصف الأنسجة محددة 21 والأنواع محددة 22 ملامح منظمة كروموسوم البوليتين 3D في مجمع An. macullipennis. ومع ذلك، يمكن أن توفر دراسة الكروموسومات ميتوتيك معلومات هامة إضافية. على سبيل المثال، ارتبط مستوى أعلى من تعدد الأشكال التريلوكروماتين لوحظ في الكروموسومات ميتوتيك مع انخفاض نشاط التزاوج والخصوبة في An. gambiae 23. قد يكون من الصعب تحديد المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسومات المتعددة والميتوتيك فقط من خلال مقارنة أطوالها النسبية. وذلك لأن هيتيركروماتين تشكل جزءا كبيرا من الكروموسومات ميتوتيك, ولكن ممثلة تمثيلا ناقصا في الكروموسومات البوليتين 24. ومن شأن توافر الدهانات الكروموسومية لطاعوض الملاريا أن يسمح للباحثين بتوسيع الدراسات الجينية الخلوية بشكل كبير من خلال إدراج أنواع إضافية، مع تقليل التكلفة والوقت بشكل كبير في تحليلات تطور karyotypic والديناميات ثلاثية الأبعاد للكروموسومات في هذه المجموعة من الحشرات المهمة وبائيا.
من أجل الحصول على مساحات كبيرة من الكروموسومات ، أصبح الالتصاط الدقيق تقنية متكاملة للتلاعب وعزل مناطق محددة ذات أهمية للمكمل الكروموسومي.  عندما يقترن تضخيم الجينوم كله (WGA)، يؤدي التشحم الدقيق في تطبيقات المصب قوية بما في ذلك FISH 11،12 وتسلسل الجينوم الجيل القادم 25-27. في السابق ، كانت التقنية تتطلب استخدام إبر التشتيت الدقيق المتخصصة التي كان لا بد من التحكم فيها يدويا من قبل مستخدم متمرس 28.  أدى تقدم الالتصيع الدقيق لالتقاط الليزر (LCM) إلى أداة مبسطة أكثر ملاءمة لعزل الخلايا المفردة 29أو30 أو الكروموسومات الفردية 31-33 مع تقليل خطر التلوث. هذا النهج يسمح للمستخدم لدراسة التغايريات الوراثية والتشوهات الكروموسومية التي تحدث في خلايا واحدة، بدلا من المناظر الطبيعية توافق الآراء التي تنتج عن تجميع خلايا متعددة معا 34-36. وقد استخدمت أساليب متعددة لتضخيم الحمض النووي المنتجة من التشتيت الدقيق.  DOP-PCR، وهي تقنية مفيدة لتضخيم تسلسل متكررة للغاية، وقد استخدمت لتضخيم الكروموسومات microdissected من الأنواع بما في ذلك جندب 37،ثعبان البحر الشوكي 38،والبلطي النيل 39.  في الآونة الأخيرة ، أصبحت مجموعة GenomePlex WGA4 أحادية الخلية القائمة على PCR والتضخيم المتعدد القائم على الإزاحة (MDA) Repli-G Single Cell أدوات قيمة للتجارب التي تنطوي على التحليل الجيني للخلايا البشرية الفردية وكذلك الكروموسومات40-42، بما في ذلك أنظمة الكروموسوم B في الجنادب 37 والجراد 43. هذه المجموعات اثنين من كل مزايا وعيوب، ولكن تفوقهم الواضح فوق غيرها من أنظمة التضخيم المتاحة وقد ثبت 44.
كمية الحمض النووي التي يمكن الحصول عليها من كروموسوم واحد أو جزء كروموسوم أقل بكثير من تلك الموجودة في نواة كاملة. ولذلك فإن التجسيد الدقيق والتضخيم والتحليل اللاحق لكروموسوم واحد أكثر تحديا بكثير ، خاصة في الكائنات الحية ذات الجينوم الصغير كما هو الحال في Drosophila أو Anopheles.  على الرغم من أن الدهانات قد تم تطويرها من كروموسومات صغيرة واحدة للإنسان 33 و دبور 45، فإن تجربة FISH الناجحة تتطلب عدة (على الأقل 10-15) كروموسومات ميتوتيك مبتزة صغيرة لذبابة الفاكهة 11. ومع ذلك، فإن القدرة على microdissect وتضخيم كروموسوم واحد سيكون من المهم ل(1) الحد من فرصة التلوث مع المواد من كروموسوم مختلف، (2) التقليل من عدد الاستعدادات الكروموسومية اللازمة للانصاع المجهري، (3) خفض النيوكليوتيدات والتعددية الهيكلية للعينة المشقوقة في كل من FISH وتسلسل تطبيقات المصب. الكروموسومات البوليتين وجدت في العديد من الأنواع Dipteran توفر فرصة فريدة من نوعها للحصول على كمية أعلى بكثير بدءا من الحمض النووي. كما أنها توفر دقة أعلى وبنية كروموسوم لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام الكروموسومات الميتوتيكية. يمكن أن تكون هذه الدقة المضافة حاسمة في تصور إعادة ترتيب الكروموسومات ، وهيكل الكروماتين ، وشرائح الكروموسومات ليتم تقسيمها 28،46.
هنا نقدم إجراء لعزل بكفاءة شريحة euchromatic من ذراع كروموسوم متعدد التين واحد، تضخيم الحمض النووي، واستخدامه في تطبيقات FISH المصب في البعوض الملاريا.  أولا، نحن نطبق LCM لعزل واستخراج ذراع كروموسوم واحد من الشرائح الغشاء المعدة خصيصا. ثانيا، يستخدم WGA لتضخيم الحمض النووي من المواد المجهرية. ثالثا، نحن تهجين الحمض النووي تضخيمها في تجارب FISH لمستحضرات الاسكواش البوليتين 47،ميتافيزي والشرائح الكروموسوم بين المراحل 48،فضلا عن عينات جبل المبيض 3D كله. وقد تم هذا الإجراء لرسم بنجاح غالبية euchromatin في أذرع الكروموسومات من An. غامبيا .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A491-212</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Methanol</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:120px;">A412-4</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Propionic acid&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">402907</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Membrane slides 1.0 PET</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9051-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Buffer tablets &#8220;GURR&#8221;</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10582-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">KaryoMAX Giemsa Stain</td>
			<td style="width:112px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10092-013</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td>
			<td style="width:112px;">Abbott Molecular</td>
			<td style="width:120px;">30-144110</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Vacufuge vacuum concentrator</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22820001</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">11-992-89</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:191px;">Thermo Scientific NanoDrop</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-2000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">REPLI-g Single Cell Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">150343</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:191px;">GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA4-10RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">WGA3-50RXN</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">MZ6 Leica stereomicroscope</td>
			<td style="width:112px;">Leica</td>
			<td style="width:120px;">VA-OM-E194-354</td>
			<td style="width:139px;">A different stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Olympus CX41 Phase Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:120px;">CX41RF-5</td>
			<td style="width:139px;">A different phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:112px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">22670000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">10x PBS</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P5493</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">50x Denhardt&#8217;s solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D2532</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">99% Formamide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP227500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">D8906</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">20x SSC buffer</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AM9765</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:120px;">P-36931</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">R0141, R0151, R0161, R0171</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:120px;">PA53022, PA55022</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">BSA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3294</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNA polymerase I</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EP0041</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Fermentas</td>
			<td style="width:120px;">EN0521</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S3256-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Spermidine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S0266-1G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP366-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP3581</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EGTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">E0396-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">PIPES</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P6757-25G</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">S311-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Digitonin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D141-100MG</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">BP151-100</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">AdhesiveCap 500 clear</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">415190-9211-000</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">QIAamp DNA Micro Kit (50)</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">56304</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:120px;">D4010</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">37% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">F79-500</td>
			<td style="width:139px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d chromosome painting in malaria mosquitoes

الفلورسنت في التهجين الموقعي (FISH) من مسابير كروموسوم الذراع كله هو تقنية قوية لرسم خرائط المناطق الجينومية ذات الاهتمام، والكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات، ودراسة تنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) من الكروموسومات في نواة الخلية. ظهور الليزر التقاط الالتصيع الدقيق (LCM) وتضخيم الجينوم كله (WGA) يسمح بالحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي من خلايا واحدة. دفعتنا الحساسية المتزايدة لمجموعات WGA إلى تطوير دهانات الكروموسوم واستخدامها لاستكشاف تنظيم الكروموسوم وتطوره في الكائنات غير النموذجية. هنا، نقدم طريقة بسيطة لعزل وتضخيم شرائح euchromatic من الأسلحة كروموسوم البوليتين واحد من خلايا ممرضة المبيض من البعوض الملاريا الأفريقية Anopheles غامبيا. يوفر هذا الإجراء منصة فعالة للحصول على دهانات الكروموسوم ، مع تقليل الخطر العام لإدخال الحمض النووي الأجنبي إلى العينة. استخدام WGA يسمح لعدة جولات من إعادة تضخيم، مما أدى إلى كميات عالية من الحمض النووي التي يمكن استخدامها لتجارب متعددة، بما في ذلك 2D و 3D FISH. أثبتنا أن الدهانات الكروموسومية المطورة يمكن استخدامها بنجاح لإنشاء المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. gambiae. بشكل عام ، يوفر اتحاد LCM و WGA أحادي الكروموسوم أداة فعالة لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي المستهدف للدراسات الجينية الخلوية والجينومية المستقبلية.

يصف الشكل 1 إجمالي تدفق عبر البروتوكول الموضحة في هذه المقالة.  يبدأ المستخدم في البداية عن طريق قطع عينات الحمض النووي الكروموسومية من شرائح الغشاء.  يتم استخراج المواد المنقصة وتنقية. ثم يتم تضخيم الحمض النووي المنقى، وإعادة تضخيمه، وتسميته، ثم استخدامه ل FISH لتسمية ينتشر الكروموسوم.
يمكن تقسيم بروتوكول LCM إلى ثلاث خطوات عامة: 1) العثور على الكروموسومات ذات الاهتمام وإعداد المنطقة لقطع(الشكل 2A)،2) قطع والمنجنيق منطقة الكروموسوم ذات الأهمية عن طريق الليزر (الشكل 2B)، و 3) التحقق لتحديد ما إذا كانت العينة هي في الواقع قفزت إلى غطاء لاصق (الشكل 2C). تظهر عملية LCM المستخدمة على كروموسومات البوليتين سلالة An. غامبيا سوا في الفيديو 1. الفيديو تفاصيل العملية برمتها من بدء تشغيل البرنامج ، بما في ذلك وظائف البرنامج الهامة والنصائح.
GenomePlex و REPLI-g مجموعات WGA خلية واحدة المستخدمة في هذا البروتوكول تختلف اختلافا كبيرا في حجم المنتج الناتج، فضلا عن العائد العام.  ويبين الشكل 3 نتائج الكهروفورسيس الهلامي الذي أجري لمجموعات الجينومPlex و REPLI-g، فضلا عن تحديد كمية العينات عن طريق Nanodrop.
وقد استخدمت المواد المجهرية لإنشاء تحقيقات FISH التي تستهدف المناطق euchromatic من الكروموسوم.  يوضح الشكل 4 الأسماك من خمسة تحقيقات ولدت من المواد الممسكتة على كروموسومات البوليتين من An. غامبيا.  تم تسمية أربعة أذرع أوتوسومال بثلاثة فلوروفورس باستخدام مجموعة WGA3: يتم تسمية كروموسوم 3R باللون الأخضر (الفلورسين) ، وكروموسوم 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2R باللون الأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2L باللون الأحمر (Cy-3). تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) باستخدام ترجمة للمواد REPLI-g في تجربة منفصلة. لإنشاء المراسلات بين أجزاء euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك، وقد تم تهجين الدهانات الكروموسوم إلى إنترباز، prophase، بروميتافاس والكروموسومات ميتافايز من An. غامبيا (الشكل 5).  لتصور تنظيم 3D من ذراع كروموسوم البوليتين واحد في نواة الخلية، تم تنفيذ جبل كله FISH على An. غامبيا سوا سلالة خلايا ممرضة المبيض (فيديو 2).  وينظر بوضوح مناطق ذراع الكروموسوم متميزة في نواة مع إنترباتيز(الشكل 5D)وpolytene (فيديو 2) الكروموسومات.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تمثيل تخطيطي للإجراءات التجريبية نحو إعداد دهانات الكروموسوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الخطوات الرئيسية في التشجر الدقيق الكروموسوم. أ) قطع بمساعدة الليزر من المنطقة الكروموسومية من الفائدة من خلال الغشاء. ب) يتم تنفيذ الغشاء مع ثقب بعد المنجنيق. ج) وجهة نظر قطعة منجنيق من الغشاء مع جزء الكروموسومات في ذلك تعلق على غطاء لاصق. يشير السهم إلى الهتيروماتين من كروموسوم X الذي بقي على الشريحة. تظهر النجمة قطعة من كروموسوم آخر بقي على الشريحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن صور هلام Agarose تظهر الحمض النووي بعد WGA. أ) انخفاض الوزن الجزيئي (200-500 نقطة أساس) الحمض النووي من الذراع 3R بعد استخدام مجموعات WGA4 و WGA3 GenomePlex. ب) الوزن الجزيئي العالي (10-20 kb) الحمض النووي من الذراع 2L بعد تضخيم REPLI-g. يظهر سلم 100 نقطة أساس في الممرات اليسرى. تظهر الجداول أدناه صور الجل تركيزات الحمض النووي التي تقاس بالانودروب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال رسم كروموسومات البوليتين من خلايا ممرضة المبيض في An. gambiae باستخدام أربعة مسابير تم إنشاؤها من مواد مجزرة. تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) من خلال ترجمة لمادة REPLI-g. وسم الذراع 2R باللون الأصفر (Cy-5)؛ الذراع 2L باللون الأحمر (Cy-3)؛ وسم الذراع 3R باللون الأخضر (الفلورسين); وسم الذراع 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5). تم تصنيف الوسومات التلقائية مع مجموعة تضخيم WGA3. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). يتم وضع أسماء الكروموسومات بالقرب من المناطق التيلومريك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم رسم الكروموسومات بين المراحل (A) والبروبهاز (B) والبروميتافاس (C) والميتافيزي (D) من أقراص اليرقات الماجينالية لسلالة An. gambiae Mopti باستخدام ثلاثة مسابير تم إنشاؤها من مواد مشقوقة صغيرة وصفتها WGA3. وسم الذراع 2R باللون الأخضر (الفلورسين); ذراع 2L غير تسمية; الذراع 3R باللون الوردي، وهو خليط من الأحمر (Cy-3) والبرتقال (Cy-5)؛ وسم الذراع 3L باللون البرتقالي (Cy-5). الكروموسوم X لديه تسمية حمراء المقابلة للمسبار rDNA 18S. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). المناطق الملونة الزاهية من الكروموسومات تتوافق مع heterochromatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>
فيديو 1. عملية LCM من الكروموسومات بوليتين An. غامبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيديو 1.</a>
فيديو 2. جبل كامل 3D FISH يؤديها على خلايا ممرضة المبيض غامبيا. تم تسمية المسبار في Cy-3 (يصور باللون الأزرق) ومصطغ من ذراع كروموسوم 2R مجزئي.  كان ملطخا كروماتين مع DAPI ويصور بواسطة سماوية زائفة التلوين (الأزرق الفاتح). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">انقر هنا لعرض الفيديو 2.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes at JoVE.com

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

الكروموسوم اللوحة هي طريقة مفيدة لدراسة تنظيم نواة الخلية وتطور karyotype. هنا، نظهر نهجا لعزل وتضخيم مناطق محددة ذات أهمية من كروموسومات البوليتين المفردة التي تستخدم لاحقا للفلورسنت ثنائي وثلاثي الأبعاد في التهجين الموقعي (FISH).

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Virginia Tech. الكروموسوم اللوحة هي طريقة مفيدة لدراسة تنظيم نواة الخلية وتطور karyotype. هنا، نظهر نهجا لعزل وتضخيم مناطق محددة ذات أهمية من كروموسومات البوليتين المفردة التي تستخدم لاحقا للفلورسنت ثنائي وثلاثي الأبعاد في التهجين الموقعي (FISH).

Video: 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

تهجين<em&gt; في الموقع</em&gt; من الغدد اللعابية والمبيض والأجنة من البعوض الحامل للمرض

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

فلوري<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين على الكروموسومات الميتوزى من البعوض

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

طرق لزيادة حساسية عالية الدقة ذوبان واحدة النكليوتيد تعدد الأشكال التنميط الجيني في الملاريا

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...