وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني للبحوث المثلث MRSEC (DMR-1121107).

<ol>
	<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Chemistry+of+Biological+Free+Energy+Transduction+As+Demonstrated+by+Elastic+Protein-Based+Polymers.">Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers.</a> J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).</li><li>Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+elastin-like+protein+in+pichia+pastoris.">Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).</li><li>Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+production+of+an+elastin-like+polypeptide+by+Pichia+pastoris.">Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).</li><li>Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+elastin-like+polypeptides+with+different+transition+temperatures+by+Pichia+pastoris.">Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris.</a> Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).</li><li>Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+synthetic+protein-based+polymer+(elastomer)+gene+in+Aspergillus+nidulans.">Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).</li><li>Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+elastin-like+polypeptide+fusions+for+expression+and+purification+of+recombinant+proteins+in+plants.">Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).</li><li>Conrad, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELPylated+anti-human+TNF+therapeutic+single-domain+antibodies+for+prevention+of+lethal+septic+shock.">ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock.</a> Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).</li><li>Kaldis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+human+interleukin-10+fusions+in+tobacco+cell+suspension+cultures.">High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures.</a> Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).</li><li>McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recursive+directional+ligation+by+plasmid+reconstruction+allows+rapid+and+seamless+cloning+of+oligomeric+genes.">Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes.</a> Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).</li><li>Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+parallel+method+for+synthesizing+DNA+repeats+enables+the+discovery+of+'smart'+protein+polymers.">A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers.</a> Nat Mater. 10, 141-148 (2011).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+effects+of+chain+length+and+concentration+on+the+thermal+behavior+of+elastin-like+polypeptides.">Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+of+Polypeptide+Inverse+Temperature+Transition+Depends+on+Mean+Residue+Hydrophobicity.">Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity.</a> Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+change+in+Gibbs+free+energy+for+hydrophobic+association+-+Derivation+and+evaluation+by+means+of+inverse+temperature+transitions.">The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions.</a> Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).</li><li>Cho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Hofmeister+anions+on+the+phase+transition+temperature+of+elastin-like+polypeptides.">Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides.</a> The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).</li><li>Kim, B., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+actuation+of+inverse+phase+transition+of+a+stimulus-responsive+fusion+polypeptide+by+ligand+binding.">Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding.</a> J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).</li><li>Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+peptide+motifs+from+calmodulin+confer+divalent+ion+selectivity+to+elastin-like+polypeptides.">Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).</li><li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides:+biomedical+applications+of+tunable+biopolymers.">Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers.</a> Biopolymers. 94, 60-77 (2010).</li><li>McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+solid+tumors+by+elastin-like+polypeptides.">Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).</li><li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins.">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. , (2010).</li><li>Shamji, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+fusion+protein+between+thermally+responsive+elastin-like+polypeptide+and+interleukin-1+receptor+antagonist:+sustained+release+of+a+local+antiinflammatory+therapeutic.">Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic.</a> Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).</li><li>Hassouneh, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+multivalent+display+of+proteins+by+temperature+triggered+self-assembly+of+elastin-like+polypeptide+block+copolymers.">Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers.</a> Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).</li><li>Lan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+nonchromatographic+method+for+the+purification+of+recombinant+proteins+using+elastin-like+polypeptide-tagged+proteases.">An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases.</a> Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).</li><li>Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-in-one+chromatography-free+purification,+tag+removal,+and+site-specific+modification+of+recombinant+fusion+proteins+using+sortase+A+and+elastin-like+polypeptides.">Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides.</a> Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).</li><li>McDaniel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.

ELPs تقدم وسيلة غير مكلفة وخالية من اللوني تنقية عن طريق استغلال سلوكهم مرحلة التحفيز استجابة. هذا النهج يستفيد من السلوك LCST من ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج للقضاء على كل من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان بعد التعبير عن ELPs المشفرة وراثيا في E. القولونية. هذا سهولة تنقية يمكن استخدامها لإنتاج ELPs لمجموعة متنوعة من التطبيقات، أو يمكن استغلالها لتنقية الببتيدات أو البروتينات المؤتلف الذي ELP يمكن أن تكون بمثابة علامة تنقية التي يمكن إزالتها مع تجهيز تنقية آخر. ينطوي تنقية ELP الخطوات الأولية لليز E. القولونية وإزالة الجيني وغير قابلة للذوبان حطام خلية من الثقافة المحللة الخام (الشكل 1)، يليه إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية عن طريق مركز التجارة الدولية (الشكل 2). الطرد المركزي بعد إحداث التحول ELP من قبل عدينشوئها من الحرارة أو الملح يفصل ELP من الملوثات القابلة للذوبان في طاف، في خطوة توصف تدور الساخنة. بعد resolubilizing في ELP، يتم طرد الحل مرة أخرى عند درجة حرارة أقل من T ر لإزالة الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان، في خطوة توصف تدور الباردة. يدور بالتناوب الساخنة والباردة يحسن نقاء الحل ELP مع كل دورة، بتكلفة صغيرة لانتاج. غلة تنقية تختلف تبعا لELP تي تي، وطول، والببتيدات تنصهر أو البروتينات. عادة، هذا البروتوكول ينتج 100 ملغ من ELP تنقيته للتر الواحد من E. ثقافة القولونية، ولكن غلة يمكن أن تصل إلى 500 ملغ / لتر. يتم تأكيد نقاء النهائي للمنتج ELP بواسطة SDS-PAGE (الشكل 3). ميغاواط من ELP النقي يجب أن تطابق بشكل وثيق مع ميغاواط النظرية المشفرة بواسطة الجينات ELP. ومع ذلك، فإن بعض ELPs الهجرة في SDS-PAGE مع MW الظاهر أعلى تصل إلى 20٪ من MW المتوقعة على 9، 27. تحليل أكثر دقة للELPلا يمكن أن يتحقق ميجاوات بحلول MALDI-TOF-MS، والتي يمكن أيضا تقديم معلومات إضافية عن نقاء المنتج ELP جنبا إلى جنب مع التقنيات التحليلية متعامد مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC). تنقية التالية، يتم قياس ELP تي تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. هذه التقنية تراقب OD من حل ELP في حين يتم زيادة درجة الحرارة. تي تي هو تركيز تعتمد ولذلك فمن المستحسن أن تميز سلسلة تركيز ذات الصلة بتطبيق المقصود من ELP. لhomopolymers ELP الشخصى التعكر يسلك زيادة حادة واحد الذي يتوافق مع انتقال ELP من unimer المجاميع إلى ميكرون النطاق (الشكل 4A). يتم تعريف T T ودرجة الحرارة المقابلة لنقطة انعطاف في ملف تعريف التعكر، تحدد بالضبط كما الحد الأقصى للمشتقة الأولى من التطوير التنظيمي فيما يتعلق درجة الحرارة. حالة العكس منوأكد ELP المرحلة الانتقالية انخفاض في OD إلى خط الأساس كما هو خفض درجة حرارة أقل من تي تي (الشكل 4B). سوف الشخصى التعكر مع زيادة وخفض درجة الحرارة سلالم تختلف في حجمها وحركية بسبب تسوية من coacervates ELP والتباطؤ متغير ELP resolubilization. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يحمل بالمثل السلوك LCST في هذا الطريق، حيث الببتيد أو البروتين تنصهر إلى ELP يؤثر على T ر. للبروتين اندماج ELP التحول هو عكسها تحت درجة حرارة انصهار من البروتين. بينما يحددها درجة الحرارة قياس العكر هو وسيلة ممتازة لتوصيف الحرارية من المنتجات الأولية ELP، وتقنيات بديلة، مثل المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس ELP T ر. ELPs مع السلوكيات الحرارية أبنية المعرض أكثر تعقيدا أكثر تعقيدا التي يمكن أيضا أن تتميز درجة الحرارة PROGRAقياس العكر mmed. ELP diblock بوليمرات، على سبيل المثال، تظهر لمحة التعكر مميزة الموافق أثار درجة حرارتها التجميع الذاتي في المذيلات كروية في درجة حرارة micellization الحرجة. لمثل هذه diblock بوليمرات ELP لOD عادة أول يزيد 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس تشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وبعد ذلك زيادة حادة في التطوير التنظيمي (تصل إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس) عند درجة حرارة أعلى يدل على تشكيل ميكرون النطاق المجاميع (الشكل 5A). يتم الحصول على معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها الهياكل ELP-تسبب درجة الحرارة مع دائرة الأراضي والمساحة، وهي تقنية الذي يقيس R H المجالس ELP في الحل. التغييرات في R H توافق بشكل وثيق مع التغيرات في قياس OD مع قياس العكر (الشكل 5B). unimers ELP عادة يحمل R H &lt;10 نانومتر بينما الجمعيات جسيمات متناهية الصغر يحمل R H ~ 20-100 نانومتر والمجاميع يحمل R H </suب &gt;&gt; 500 نانومتر. معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها النانوية ELP، مثل تجميع عدد والتشكل، ويمكن الحصول على تشتت الضوء ثابتة أو المبردة المجهر الإلكتروني النافذ 17، 23، 29. نظرا لو tunability من الخواص الحرارية ELP، يتم الحصول على مجموعة من T ر ق من خلال التصاميم ELP المختلفة. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المتأصلة T ر ستؤثر على تعظيم الاستفادة من بروتوكول تنقية لكل ELP، حيث منخفضة للغاية أو عالية T ر ق سيتطلب معظم التعديل في هذا البروتوكول القياسي. ELPs مع درجات حرارة مرتفعة للغاية تمر بمرحلة انتقالية قد تكون غير مناسبة لتنقية مع هذا النهج. إذا كان التصميم من ELPs الرواية والببتيد أو البروتين ELP اندماج قد تعرض للخطر الاستجابة الحرارية للELP، يمكن إدراج علامة بسيطة لتنقية الحامض الاميني البديلة يجمد اللوني تقارب المعادن. بالإضافة إلى ذلك،خصائص تسلسل ELP قد تتطلب تعديل هذا البروتوكول إذا اتهم بقايا ضيف. التلاعب في درجة الحموضة عازلة يمكن استخدامها كوسيلة لتغيير تهمة العام للELP في محاولة للقضاء على التفاعلات مع الملوثات كهرباء 17. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو مناسبة لظرف خاص من اندماج ELP مع الببتيدات والبروتينات عند اتخاذ التدابير المناسبة لضمان عملية تنقية لا التشويش على نشاط شاردة تنصهر. مذكرات في جميع أنحاء بروتوكول بشأن هذه التعديلات تعمل على توجيه تنقية ELPs التي قد تقدم هذه التحديات فيما يتعلق تي تي، تهمة، أو مخاوف الانصهار. تنقية ELPs عن طريق السلوك LCST بهم يقدم مقاربة بسيطة وخالية من اللوني لتنقية غالبية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج المعبر عنها في E. القولونية. بروتوكول تلخيصها هنا يسمح تنقية سو ELPs في يوم واحد باستخدام المعدات التي هي مشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا. سهولة تنقية ELPs واندماج إرادتهم، ونحن نأمل، تشجيع التنوع المتزايد من التصاميم ELP التطبيقات الجديدة في علوم المواد، والتكنولوجيا الحيوية، والطب.

الإيلاستين البروتينية مثل (ELPs) هي البوليمرات الحيوية تتألف من VPGXG خماسي الببتيد مكرر حيث X، بقايا الضيف، أي الأحماض الأمينية إلا البرولين. ELPs المعرض درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) مرحلة انتقالية السلوك، مثل أن الحل ELP متجانسة سيفصل إلى مرحلتين عند التسخين لLCST لها، وهو ما يسمى عادة درجة حرارة التحول العكسي (T ر) في الأدب ELP 1. وتتكون المرحلتين من ELP المرحلة كرية مخفف جدا ومرحلة الرواسب الغنية ELP. يتم تشكيل الرواسب الغنية ELP على فترة زمنية قصيرة على تجميع سلاسل ELP الى جزيئات ميكرون الحجم التي تتجمع في وقت لاحق. يحدث هذا السلوك على مجموعة من بضع درجات مئوية وعادة ما هو عكسها، كما يتم استرداد حل متجانسة عند عودته إلى درجة حرارة أقل من T ر. وعادة ما يتم تصنيعه في ELPs كولاي (كولاي) جيئة وذهابام الجينات الاصطناعية التي هو ligated إلى البلازميد التعبير. ثم يتم تحويل هذا البلازميد إلى E. خط الخلية القولونية التي هي الأمثل للتعبير البروتين. وقد استخدمنا حصرا النظام متجه T7 لاك حيوان أليف للتعبير عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من ELPs في E. القولونية، على الرغم من أن أنظمة التعبير الأخرى في الخميرة 2-4، الفطريات 5، والنباتات 6-8 كما تم استخدامها من قبل المحققين الأخرى. ويوجد عدد من النهج لبناء وراثيا الجينات ELP المتكررة، بما في ذلك ربط العودية الاتجاه (RDL) 9، ربط الاتجاه العودية بواسطة إعادة الإعمار البلازميد (PRE-RDL) 10، وتتداخل تمديد المتداول دائرة التضخيم (OERCA) 11. القدرة على مهندس ELPs على المستوى الجيني يتيح الفرصة لاستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف لخلق ELPs مع مجموعة متنوعة من أبنية (على سبيل المثال، وحيدة، diblocks، triblocks، الخ)، والتي يمكن زيادة إلحاق مع ظيفيةالببتيدات والبروتينات. السيطرة على المستوى الجيني يضمن أيضا أن يتم التعبير عن كل ELP مع طول الدقيق وتكوين تمليها قالب البلازميد الوراثية، وتوفير منتجات البوليمر الحيوي monodisperse تماما. الخصائص الحرارية من كل ELP تعتمد على المعلمات الجوهرية إلى البوليمر الحيوي مثل الوزن الجزيئي (MW)، وتسلسل، وكذلك العوامل الخارجية بما في ذلك تركيزه في حل وجود cosolutes الأخرى، مثل أملاح. طول ELP 12 و تكوين بقايا ضيفه 1، 13، 14 هي معلمتين متعامد في تصميم ELP التي يمكن استخدامها للسيطرة على ر T، حيث تؤدي مخلفات ضيف مسعور وأطوال سلسلة يعد في أقل تي تي، في حين ماء بقايا الضيوف وأطوال سلسلة أقصر يؤدي إلى ارتفاع T ر ق. تركيز ELP يرتبط عكسيا مع ر T، حيث من الحلول غرامتركيز آكلى لحوم البشر ELP يكون أقل T ر ق 12. نوع وتركيز الأملاح تؤثر أيضا على ELP تي تي، حيث تأثير الأملاح يتبع سلسلة هوفمايستر 15. الأنيونات Kosmotropic (الكلورين - وأعلى في سلسلة هوفمايستر) خفض ELP T ر وزيادة تركيز الملح يعزز هذا التأثير. يمكن ضبطها هذه المعايير الجوهرية وخارجي للحصول على السلوك الحراري في درجة حرارة تتراوح الهدف ما هو مطلوب لتطبيق معين من ELP. سلوك التحفيز استجابة من ELPs مفيد لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing 16، 17، 18 هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات 19 و 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما تنصهر ELPs لالببتيدات أو البروتينات على المستوى الجيني، يمكن للELP بمثابة علامة تنقية بسيطة لتوفير وسيلة غير مكلفة لتنقية دفعة من الحماسي المؤتلفالمد والجزر أو البروتينات التي لا تتطلب اللوني 21. التعديل من عملية تنقية يضمن أن نشاط بروتين الببتيد أو تنصهر إلى ELP المحافظة. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يمكن تنقية للتطبيقات التي العلامة ELP مفيد 22، 23 أو بدلا من ذلك، عندما يكون مطلوبا الببتيد مجانا أو البروتين، يمكن إدراج موقع الاعتراف البروتيني بين الببتيد أو البروتين وELP. ومن ثم يمكن تحقيق إزالة العلامة ELP بواسطة الهضم مع البروتيني حرة أو ELP الانصهار البروتيني، حيث يوفر هذا الأخير سهولة إضافية من تجهيز وجولة نهائية من تنقية ELP يمكن فصل ELP العلامة والبروتيني ELP الانصهار من الببتيد الهدف أو البروتين في خطوة واحدة 24 و 25. يصف بروتوكول باتباع الإجراء لتنقية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج عن طريق خصائصها الحرارية ويناقش التقنيات الأساسية للتميزالاستجابة الحرارية من المنتجات ELP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية المتكررة التي تظهر في مرحلة الحل درجة الحرارة أقل السلوك الحرجة التي تمر بمرحلة انتقالية، كما unimers للذوبان الموجودة تحت درجة حرارة التحول مميزة وتجميع في coacervates ميكرون النطاق فوق درجة حرارة انتقالها. تصميم البروتينية مثل الإيلاستين على المستوى الجيني يسمح بالتحكم الدقيق في تسلسلها وطول، والتي تملي خصائصها الحرارية. وتستخدم البروتينية مثل الإيلاستين في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing، هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات، حيث درجة حرارة التحول والهندسة المعمارية من البوليمر الحيوي ELP يمكن ضبطها لتطبيق معين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة الانتقالية درجة حرارة المحلول السلوك أقل تنتقد البروتينية مثل الإيلاستين يسمح تنقية من خلال استجابتها الحرارية، بحيث تقوصر بهم انتقائية وresolubilization يسمح إزالة كل الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبانق التالية التعبير في الإشريكية القولونية. ويمكن استخدام هذا النهج لتنقية البروتينية مثل الإيلاستين وحدها أو بوصفها أداة لتنقية الببتيد أو البروتين اندماج حيث الببتيدات أو البروتينات المؤتلف وراثيا لإلحاق به ببتيد مثل الإيلاستين يمكن تنقيته دون اللوني. يصف هذا البروتوكول تنقية البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج ويناقش تقنيات توصيف الأساسية لتقييم السلوك الحراري للمنتجات نقية ببتيد مثل الإيلاستين.

نحن هنا وصف نتائج ممثلة لتنقية وتوصيف لالمبلمر المتجانس ELP وdiblock كوبوليمر ELP. بعد 24 ساعة من التعبير في E. القولونية، يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي و lysed بواسطة صوتنة. عادة، وهو تغيير خفية في اللون يحدث بعد صوتنة، مؤكدا تحلل الخلية كافية (الشكل 1A). بعد إضافة جزيرة الأمير إدوارد، يتم جمع مكونات الجينوم والحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي، وفصل بيليه كبيرة من الملوثات غير القابلة للذوبان من ELP للذوبان في طاف (الشكل 1B). يتم تنقيته بواسطة ELP مزيد عكسية الدراجات الانتقالية (ITC)، الذي يستغل السلوك LCST لفصل ELP كلا من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (الشكل 2) 28. يتم تشغيل المرحلة الانتقالية للELP بإضافة الحرارة و / أو الملح. النتائج الطرد المركزي في تشكيل بيليه في أسفل الأنبوب الذي يتكون من ELP لالثانية بعض الملوثات غير قابلة للذوبان (الشكل 1C). هذه الخطوة تسمى ساخنة تدور المرتجع الملوثات القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف بيليه ELP ومعلق في المخزن الباردة. يتم طرد ELP resolubilized مرة أخرى في 4 درجات مئوية. هذه خطوة يطلق البرد تدور المرتجع بيليه من الملوثات غير القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP. تكرار دورة بالتناوب يدور الساخنة والباردة يزيد من نقاء ELP، ولكن على حساب انخفاض العائد قليلا، كما يتم فقدان المتبقية ELP خلال كل جولة ITC في أنابيب الطرد المركزي وعلى نصائح ماصة. وأكد تنقية ناجحة من ELPs والببتيد أو البروتين اندماج ELP بواسطة SDS-PAGE. مأخوذة الصغيرة التي اتخذت خلال عملية تنقية تدليل على تنقية التدريجي للELP من E. المحللة القولونية. هى overexpressed ELP في E. الخام كولاي المحللة والملوثات خفض الطرافةح جولات متعاقبة من مركز التجارة الدولية (الشكل 3). المنقى ELP يظهر على شكل فرقة واحدة بالقرب من MW النظرية توقع. يتميز ELP تي تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. الملف الشخصى التعكر من المبلمر المتجانس ELP يسلك زيادة حادة في واحد OD في 350 نانومتر (ما يقرب من 2.0 وحدة فوق خط الأساس لتركيز ELP من 25 ميكرومتر) (الشكل 4A). التبريد بالاشعة التعكر تأكيد طبيعة عكسها للانتقال ELP كما ترجع OD إلى خط الأساس عندما يتم خفض درجة حرارة أقل من تي تي (الشكل 4B). ELP diblock بوليمرات يحمل لمحة التعكر أكثر تعقيدا، بالمقارنة مع المبلمر المتجانس ELPs. وOD يزيد عادة أول من 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس، وبعد ذلك الزيادات OD بشكل حاد إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس (الشكل 5A). توفير قياسات DLS المعلومات حول التغيير في R H فيما يتعلق درجة الحرارة، وشارك<html> rroborating المعلومات المكتسبة من التشكيل الجانبي التعكر (الشكل 5B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. تنقية ELP الأولية بعد 24 ساعة من التعبير، E. القولونية يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في برنامج تلفزيوني. وهي lysed A) من قبل خلايا صوتنة، الذي يصاحبه تغير في اللون خفية مثل أن يظلم المحللة بعد صوتنة. ب) بعد إضافة PEI لاختصار الملوثات الحمض النووي، والمحللة هو طرد وفصل بيليه كبيرة من الحطام غير قابلة للذوبان من ذوبان ELP في طاف. C) هو فعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وأشكال الطرد المركزي لبيليه ELP شفافة.عنخ &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. الدراجات التحول العكسي. ELP يتم تنقيته عن طريق السلوك LCST في الفترة من الملوثات سواء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان. بدءا المحللة ELP الغنية (1) وبفعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وELP يتم فصل بواسطة الطرد المركزي (تدور الساخنة) (2). يتم الاحتفاظ بيليه ELP (3A)، في حين يتم تجاهل طاف تحتوي على الملوثات القابلة للذوبان (3B). هو معلق على ELP في المخزن البارد (4) وطرد مرة أخرى في 4 درجات مئوية (تدور الباردة) (5). يتم تجاهل بيليه تحتوي على ملوثات غير قابلة للذوبان (6A)، في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP (6B). وتتكرر دورات بالتناوب يدور الساخنة والباردة حتى يتم الوصول إلى النقاء المطلوب، كما هو محدد معSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> تأكيد الشكل 3. تحليل SDS-PAGE منتجات تنقية ELP. تنقية الناجحة لELP بواسطة SDS-PAGE. بإفراط (overexpressed) ELP هو واضح في E. الخام المحللة القولونية بعد صوتنة (2). بعد إضافة PEI والطرد المركزي يتم الاحتفاظ ELP للذوبان إلى حد كبير في طاف (3)، على الرغم من بعض ELP فقدت في التخلص من الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان (4). طاف بعد الأولى تدور الساخن يحتوي على مستويات عالية من الملوثات القابلة للذوبان (5). طاف بعد الأولى تدور الباردة يشير الفصل جيدة من ELP من الملوثات غير قابلة للذوبان (6). دورات إضافية من الملفات الساخنة (7) وجيدور القديمة (8) إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية، على التوالي، حتى الساخنة (9) وتدور الباردة (10) supernatants النهائي يحمل أي العصابات الملوثة دخيلة، مؤكدا النقاء مرضية للمنتج ELP. هذا المبلمر المتجانس ELP، مع سلسلة من SKGPG (VGVPG) 80-Y، لديه الوزن الجزيئي المتوقع من 33.37 كيلو دالتون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> الشكل 4. توصيف ELP المبلمر المتجانس بواسطة يحددها درجة الحرارة قياس العكر. يتم تحديد ELP تي تي من خلال رصد OD في 350 نانومتر مع زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة. A) homopolymers ELP المعرض زيادة حادة في واحد OD أن مواطنهإيناس ر T بهم في إعطاء التركيز. B) يتم التحقق من عكس اتجاه التحول ELP من خلال رصد OD في 350 نانومتر من حل 25 μ M في حين خفض درجة الحرارة، حيث يتم تأكيد الانعكاسية التي كتبها عودة OD الى الاساس. هذا المبلمر المتجانس ELP لديه تسلسل SKGPG (VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> الرقم 5. توصيف ELP diblock كوبوليمر بواسطة قياس العكر يحددها درجة الحرارة وتشتت الضوء الحيوي. ELPs التي تخضع نانو النطاق التجميع الذاتي، مثل ELP diblock بوليمرات التي تجمع الذاتي في المذيلات كروية، يحمل ملامح التعكر أكثر تعقيدا. <stronز&gt; أ) زيادة معتدلة في التطوير التنظيمي يشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وذلك قبل الزيادة السريعة في التطوير التنظيمي الذي يشير التجميع الكامل للELP في المجاميع ميكرون على نطاق القياسات. B) DLS تأكيد السلوك يستدل من التشكيل الجانبي التعكر ل الحل عند 25 ميكرومتر من خلال توفير المعلومات حول التغيير في R H مع الاحترام لدرجة الحرارة. هنا unimer ELP لديه R H ~ 8 نانومتر ومذيلة ديه R H ~ 25 نانومتر. هذه مجموعة من البوليمرات diblock ELP لديه تسلسل GCGWPG (VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli at JoVE.com

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية باستخدام درجة حرارة المحلول المرحلة الانتقالية السلوك أقل الحرجة كبديل بسيطة لاللوني.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K Views.  Duke University.  البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية با?...

Video: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...