Ce travail a été soutenu par Research Triangle MRSEC de la NSF (DMR-1121107).

1. PEL Expression <ol><li> Inoculer 3 ml de milieu Terrific Broth stériles avec un DMSO actions ou agar colonie de plaque de E. coli appropriée pour l&#39;expression de la protéine qui contient le plasmide codant PEL désirée sous le contrôle du promoteur T7-lac. Ajouter l&#39;antibiotique approprié et incuber à 37 ° C pendant la nuit (O / N) avec agitation continue à 200 rpm. </li><li> Ajouter 1 ml de la culture O / N pour 1 L de bouillon Terrific milieu stérile dans un ballon de 4 litres. Ajouter l&#39;antibiotique approprié et incuber à 37 ° C pendant 24 heures avec agitation continue à 200 rpm. NOTE: L&#39;expression «fuite» de base vu avec le promoteur T7-lac est suffisante pour l&#39;expression de haut niveau de plusieurs PEL si la culture est incubée pendant 24 heures. Cependant, une approche plus classique peut être utilisé, dans lequel l&#39;expression des protéines est en outre induite par l&#39;addition de 0,2 à 1 mM d&#39;isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) lorsque la densité optique de la culture atteint 0,6. </li&gt; <li> Transférer la culture à partir de la 4-L à un flacon de 1 L bouteille de centrifugation et centrifuger à 4 ° C pendant 15 min à 2000 x g. </li><li> Jeter le surnageant. REMARQUE: Si plus de 1 L de la culture est cultivé ils peuvent être condensés en ajoutant un autre litre de culture au culot et l&#39;étape 1.3 répéter. Jusqu&#39;à 2 L de la culture peut être condensé en un seul culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot dans du tampon phosphate salin (PBS), de l&#39;eau, ou un autre tampon désiré pour atteindre 45 ml de suspension cellulaire et transférer dans un tube conique de 50 ml. </li></ol> 2 PEL purification:. Étapes préliminaires et premier cycle de transition inverse vélo <ol><li> Sonication du culot cellulaire remis en suspension pour un total de 9 min à des cycles de 10 sec &quot;marche&quot; et 20 secondes &quot;arrêt&quot; à une puissance de sortie de 85 W, tout en maintenant l&#39;échantillon sur de la glace. Permettre brièvement l&#39;échantillon refroidir sur glace, puis répéter le cycle 9 min une fois de plus. REMARQUE: Si le PEL est prévu d&#39;avoir une très faible T t </sub&gt; l&#39;intervalle &quot;off&quot; peut être augmenté jusqu&#39;à 40 secondes pour éviter un échauffement de la solution au-dessus de la T t. </li><li> Transférer le lysat à un rond de 50 ml tube de centrifugeuse bas. </li><li> Ajouter 2 ml de 10% (p / v) polyéthylèneimine (PEI) pour chaque litre de culture et agiter pour mélanger. REMARQUE: PEI est un polymère chargé positivement qui aide à la condensation des contaminants génétiques chargés négativement. Ne pas effectuer cette étape si le PEL est chargée négativement, comme le PEI peut aussi condenser et retirer le produit PEL. </li><li> Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 x g. </li><li> Transférer le surnageant dans un endroit propre de 50 ml tube à centrifuger fond et jeter le culot. </li><li> Option &quot;cuire sur&quot; étape: Incuber l&#39;échantillon à 60 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer les contaminants protéiques et puis transfert à 4 ° C ou à la glace jusqu&#39;à ce que le PEL est complètement resolubilisée. Centrifuger l&#39;échantillon à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 x g. Transférer le surnageant dans un clean 50 ml rondes tube à centrifuger fond et jeter le culot. NOTE: Ne pas effectuer cette étape si un peptide ou une protéine est fusionnée au PEL et on s&#39;attend à dénaturer la condition de la chaleur élevée. Cela peut provoquer la transition PEL pour devenir chaleur irréversible ou peut détruire l&#39;activité de la fraction fondue. </li><li> Induire la transition PEL avec l&#39;ajout de cristallin NaCl (ne dépassant pas 3 M). En variante, le citrate de sodium (n&#39;excédant pas 0,3 M) peut être utilisé pour les PEL qui ont plus élevée T t de s ou de faibles rendements. NOTE: La solution doit devenir trouble une fois que le sel soit dissout, indiquant la séparation de phase du PEL de la solution. PEL très hydrophiles à haute T t s peuvent nécessiter un certain degré de chauffage, en combinaison avec l&#39;addition de sel, pour provoquer la séparation de phase du PEL dans cette induction préliminaire de la transition ELP. </li><li> Centrifuger à temperatue ambiante (RT) pendant 10 min à 16 000 xg (spin chaud). REMARQUE: Une pastille PEL be observé, dont la taille dépend du rendement de l&#39;expression du PEL. Ce culot PEL peut apparaître au premier abord opaque, mais après refroidissement, il apparaît translucide et peut être de couleur brune. Le culot PEL deviendra plus incolore que des produits et contaminants purification sont supprimés. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 5.1 ml de tampon souhaitée de la pastille. Reprendre le culot par la pipette ou insérer le tube de tourner à 4 ° C. NOTE: Le volume de tampon requis dépendra de la taille de la pastille de PEL, et donc le rendement d&#39;expression ELP, où une quantité suffisante de tampon doit être ajouté pour permettre la resolubilisation de la pastille ELP. PEL à haute teneur en cystéine de bénéficier de purification dans de l&#39;eau avec du Tris 10 mM de chlorhydrate de (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP-HCl) à pH 7 afin d&#39;éliminer les interactions disulfure avec des protéines contaminantes. PEL à haute teneur de charge bénéficient de purification à un pH ajusté pour neutraliser leur charge et réduire élémentctrostatic interactions avec les protéines contaminantes. </li><li> Transférer la solution remis en suspension PEL aliquots de 1 ml dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml propres. </li><li> Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg (de filage à froid). Une petite pastille de contaminants insolubles doit être observé. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube propre et jeter le culot. </li></ol> . 3 PEL Purification: Les rounds suivants de transition inverse vélo <ol><li> Induire la transition PEL avec la chaleur et / ou l&#39;ajout de NaCl. Les échantillons peuvent être mises en incubation sur un bloc chauffant ou dans un bain-marie pendant 15 min à une température supérieure à la T t. Si, toutefois, le PEL est fusionné à une protéine (excluant l&#39;utilisation de la chaleur) ou si le PEL a un T t grande que ne peut pas être atteint avec la chaleur seule, une solution 5 M de NaCl peut être ajouté goutte à goutte à induire la transition PEL. NOTE: La solution doit devenir trouble, indiquant la séparation de phase de PEL de solution. </li><li&gt; Centrifugeuse pendant 10 min à 16 000 xg (spin chaud). Si la chaleur a été utilisé dans l&#39;étape 3.1, effectuer cette étape de centrifugation à une température supérieure à celle qui était nécessaire pour induire la transition ELP. Si NaCl seul a été utilisé dans l&#39;étape 3.1, cette étape de centrifugation à température ambiante. NOTE: Une pastille PEL doit être observé. </li><li> Jeter le surnageant, ajouter 500-750 pi de tampon souhaitée, et remettre le culot par la pipette ou insérer le tube de tourner à 4 ° C. </li><li> Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg (de filage à froid). Une petite pastille de contaminants insolubles doit être observé. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube propre et jeter le culot. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.5 jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun contaminant culot est observée lors de l&#39;étape 3.4. </li></ol> 4. Traitement post-purification (facultatif) <ol><li> Si vous le souhaitez, dialyser l&#39;échantillon contre un tampon approprié pour éliminer l&#39;excès de sel de la solution purifiée PEL. REMARQUE: PEL être lyophilisés doivent êtredialysées contre le trou DDH 2 OO / N à 4 ° C. </li><li> Si on le désire, on lyophilise le PEL pour le stockage de longue durée par la congélation de la solution à -80 ° C pendant 30 min avant la lyophilisation O / N. NOTE: La lyophilisation doit pas être utilisé pour les PEL avec des protéines annexées. </li><li> Si vous le souhaitez, récupérer gratuitement peptide ou une protéine à partir d&#39;un peptide ou une protéine PEL fusion en supprimant la balise PEL: <ol><li> Digérer le peptide ou une protéine PEL fusion avec une protéase biotinylé (tel que recommandé par le fournisseur de la protéase) ou avec une fusion protéase PEL correspondant au site de la protéase génétiquement conçu entre le peptide ou une protéine et PEL. </li><li> Le cas échéant, retirez la protéase biotinylé en utilisant des billes de streptavidine modifiée (tel que recommandé par le fournisseur de la protéase). </li><li> Induire la transition du PEL clivé et / ou protéase PEL fusion par l&#39;addition goutte à goutte d&#39;une solution 5 M de NaCl. </li><li> Centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 16 000 x g. NOTE: Une pastille PEL doit être observé. </li><li>Recueillir le surnageant et jeter le culot PEL. Dialyser le surnageant contre un tampon désiré ou d&#39;utiliser un filtre centrifuge pour effectuer un échange de tampon afin d&#39;éliminer la forte concentration en sel du peptide pur ou une solution de protéine. </li><li> Confirmer le clivage complet de libre peptide ou une protéine à partir de la balise PEL par le dodécylsulfate de sodium gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). </li></ol></li></ol> 5 Caractérisation:. SDS-PAGE <ol><li> Préparer les échantillons de PEL pour SDS-PAGE en mélangeant 10 ul de PEL dilué dans de l&#39;eau avec 10 ul de tampon d&#39;échantillon contenant du 2-mercaptoéthanol. NOTE: 40 pg de PEL est souvent suffisante pour évaluer la taille et la pureté du produit PEL. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 100 ° C pendant 2 min et ensuite charger sur un gel de polyacrylamide avec une échelle de protéines de taille appropriée. </li><li> Exécuter le gel à 180 V jusqu&#39;à ce que le colorant se rapproche du fond du gel (environ 45 min). </li><li> Colorer legel avec une solution 0,5 M CuCl2 pendant 5 min, tout en basculant. NOTE: PEL ne sont généralement pas visualisés par bleu de Coomassie tache, comme certaines séquences PEL n&#39;interagissent pas avec ce colorant. Bleu brillant de Coomassie interagit principalement avec des résidus d&#39;arginine et interagit faiblement avec d&#39;autres résidus histidine-lysine et de base-et-aromatiques des résidus de tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et 26. Ainsi PEL et peptides ou protéines ELP fusions peuvent être colorées avec Coomassie Brilliant Blue uniquement si leur séquence primaire comprend un nombre suffisant de ces résidus spécifiques. </li><li> Vérifiez que le PM de la bande PEL correspond à celle de la MW théorique attendue à partir du gène PEL et qu&#39;aucune bande de contaminants étrangers sont présents. NOTE: Certaines PEL migrent avec un poids moléculaire apparent de 20% plus élevé que leur MW attendu 9, 27. </li></ol> 6 Caractérisation:. Désorption laser assistée par matrice /ionisation à temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF-MS) <ol><li> Préparer une solution ELP dans 50% d&#39;acétonitrile aqueux contenant de l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1% pour atteindre une concentration d&#39;environ ELP 25 uM. NOTE: Cette solution doit être exempte de sel, afin PEL doit être dialysée contre H 2 O après purification. </li><li> Préparer une solution de matrice d&#39;acide sinapinique saturé à 50% d&#39;acétonitrile aqueux contenant de l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1%. </li><li> Ajouter 1 pi de la solution ELP à 9 pi de la solution de matrice pour parvenir à une concentration de PEL environ 2,5 pmol / ul. NOTE: Ce mélange peut être dilué avec une solution de matrice pour optimiser le signal de MALDI-TOF. </li><li> Caution 1-2 pi de mélange ELP-matrice sur une plaque MALDI de métal et de laisser la place sécher complètement. </li><li> Obtenir 5-10 spectres MALDI-TOF pour déterminer le rapport masse sur charge (m / z) du PEL et déduire son MW mesurée. </li></ol> 7. Characterization Température programmée Turbidimétrie et Dynamic Light Scattering <ol><li> Déterminer le T t du PEL par turbidimétrie température programmée: <ol><li> Préparer une série de dilution (par exemple, 5 à 100 uM) de solutions de PEL dans le tampon souhaité. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un spectrophotomètre UV-Vis à température contrôlée, mesurer la densité optique (DO) à 350 nm dans une gamme de températures (par exemple, 20-80 ° C) à une vitesse de 1 ° C / min de chauffage. REMARQUE: Si aucune augmentation de la DO est considéré le T t peut dépasser la limite supérieure de température de l&#39;instrument. L&#39;apparente T t peut être diminuée par l&#39;addition de NaCl. Commencez à 1 M de NaCl et d&#39;augmenter par paliers de 0,5 M jusqu&#39;à ce que la transition PEL est détectée dans une plage de température mesurable. </li><li> Vérifier la réversibilité de la transition PEL en mesurant la diminution de l&#39;OD sur la même plage de température à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min. </li><li> Déterminer le T t de l&#39;homopolymère PEL en identifiant le point du profil de la turbidité de l&#39;inflexion (OD tracée en fonction de la température). NOTE: Cette température peut être aisément définie à partir de la dérivée de la courbe de DO, où la température correspondant au maximum de la dérivée est calculée selon la T t. Architectures PEL plus complexes affichent des profils de turbidité plus complexes et doivent être analysés plus comme décrit dans la section 7.2. </li></ol></li><li> Caractérisation supplémentaire de PEL qui affichent des propriétés thermiques plus complexes (par exemple, les copolymères diblocs PEL qui s&#39;auto-assemblent en micelles sphériques) est réalisé par diffusion dynamique de la lumière (DLS): <ol><li> Préparer une solution PEL dans le tampon souhaité faire passer l&#39;échantillon à travers un filtre avec une taille de pores 20-450 nm. NOTE: Le choix de la taille des pores filtre dépendra de la présence, la taille et la stabilité de tous les assemblages de PEL en solution. La plus petite taille possible des pores du filtre est préférable d&#39;éliminer les contaminants, tels quepoussière, qui diminuent la qualité des mesures DLS. Un filtre de plus grande taille des pores doit être utilisé lorsque la résistance importante est vécue lors du passage d&#39;une solution PEL par le biais de plus petites tailles filtre de pores. </li><li> Mesurer le rayon hydrodynamique (R H) sur une plage de températures qui correspond à une région d&#39;intérêt identifiés dans le profil de la turbidité. REMARQUE: unimères PEL ont généralement un R H &lt;10 nm, les assemblages de nanoparticules ont une R H ~ 20-100 nm, et les agrégats ont une R H&gt; 500 nm. Chaque augmentation de R H doit correspondre à une augmentation de la DO à 350 nm mesurée par spectrophotométrie UV-visible, en fonction de la température, qui est proportionnelle à la taille de la particule. </li></ol></li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+thermally+responsive+nanoparticles+of+a+genetically+encoded+peptide+polymer+by+drug+conjugation.">Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation.</a> Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.

PEL offrent un moyen peu coûteux et sans chromatographie-de purification par l&#39;exploitation de leur comportement de phase de stimulus-réponse. Cette approche tire parti du comportement LCST de PEL et de peptides ou de protéines PEL fusions d&#39;éliminer les contaminants solubles et insolubles après l&#39;expression de PEL codés génétiquement dans E. coli. Cette facilité de purification peut être utilisée pour produire des PEL pour une variété d&#39;applications, ou peut être exploitée pour la purification de peptides ou de protéines recombinantes dans laquelle le PEL peut agir comme un marqueur de purification qui peut être enlevée avec un traitement post-purification. Purification PEL implique des étapes préliminaires à lyser E. coli et éliminer les débris cellulaires insolubles et génomique à partir du lysat brut de culture (Figure 1), suivie de l&#39;élimination des contaminants solubles et insolubles résiduelles par le CCI (figure 2). Centrifugation après le déclenchement de la transition PEL par l&#39;ajouttion de chaleur ou de sel se sépare du PEL de contaminants solubles dans le surnageant, dans une étape appelée un spin chaud. Après resolubilisation du PEL, la solution est centrifugée à nouveau à une température inférieure à la T t pour éliminer le contaminant culot insoluble, dans une étape appelée un spin froid. Alternant tours chauds et froids améliore la pureté de la solution PEL à chaque cycle, à un faible coût de céder. rendements de purification varient selon le PEL T t, longueur, et des peptides ou des protéines de fusion. Typiquement, ce protocole donne 100 mg de PEL purifié par litre de E. culture coli, mais les rendements peuvent atteindre jusqu&#39;à 500 mg / L. La pureté finale du produit PEL est confirmée par SDS-PAGE (figure 3). Le MW du PEL purifiée doit correspondre étroitement avec le MW théorique codée par le gène PEL. Cependant, certains PEL migrent en SDS-PAGE avec un poids moléculaire apparent allant jusqu&#39;à 20% plus élevée que leur MW attendu 9, 27. Une analyse plus précise du PELMW peut être obtenue par MALDI-TOF-MS, qui peut également fournir des informations supplémentaires sur la pureté du produit ELP ainsi que des techniques analytiques orthogonales telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Après purification, le PEL T t est mesurée par turbidimétrie température programmée. Cette technique surveille la densité optique d&#39;une solution ELP tandis que la température est augmentée. Le T t est dépendante de la concentration il est donc conseillé de caractériser une série de concentration pertinent pour l&#39;application prévue du PEL. Pour PEL homopolymères le profil de turbidité présente une forte augmentation unique qui correspond à la transition du PEL de Unimer agrégats à l&#39;échelle du micron (figure 4A). Le T t est définie comme étant la température correspondant au point dans le profil de la turbidité de l&#39;inflexion, précisément déterminé comme le maximum de la dérivée première de la DO à l&#39;égard de la température. La réversibilité de l&#39;ELP transition de phase est confirmée par une baisse de la DO à la ligne de base en tant que la température est abaissée en dessous de la T t (Figure 4B). Le profil de la turbidité avec l&#39;augmentation et la diminution des rampes de température varie en amplitude et la cinétique due à régler des coacervats PEL et hystérésis variable de PEL redissolution. Peptide ou protéine ELP fusions présentent un comportement similaire LCST de cette façon, où le peptide ou la protéine de fusion à l&#39;ELP affecte la T t. Pour les protéines ELP fusionne la transition est réversible en dessous de la température de fusion de la protéine. Alors que turbidimétrie température programmée est une excellente méthode pour la caractérisation thermique initiale des produits PEL, techniques alternatives, telles que la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), peut également être utilisé pour mesurer le PEL T t. PEL ayant des comportements thermiques des architectures plus complexes exposition plus complexes qui peuvent aussi être caractérisées par la température prograturbidimétrie MMed. PEL copolymères diblocs, par exemple, présentent un profil de turbidité caractéristique correspondant à leur auto-assemblage déclenché de température dans des micelles sphériques à leur température de micellisation critique. Pour ces copolymères diblocs PEL la DO augmente généralement la première 0,1-0,5 unités au-dessus de référence indiquant le passage de unimères de micelles, après quoi, une forte augmentation de la DO (2,0 unités par rapport au départ) à une température supérieure indique la formation de l&#39;échelle du micron agrégats (figure 5A). Informations supplémentaires sur les structures PEL déclenché température auto-assemblées est obtenu avec DLS, une technique qui mesure la R H d&#39;ensembles de PEL en solution. Les variations de R H conviennent en étroite collaboration avec les changements dans OD mesurées avec turbidimétrie (figure 5B). Unimères PEL présentent généralement un R H &lt;10 nm tandis que les ensembles de nanoparticules présentent une R H ~ 20-100 nm et agrégats présentent une R H </sub &gt;&gt; 500 nm. Informations supplémentaires sur les nanoparticules auto-assemblées PEL, tels que le nombre d&#39;agrégation et de la morphologie, peut être obtenue par diffusion de lumière statique ou microscopie cryogénique électronique à transmission 17, 23, 29. En raison de l&#39;accordabilité de propriétés thermiques PEL, une gamme de T t s est obtenue par différents modèles de PEL. Il est important de garder à l&#39;esprit que le propre T t influencera l&#39;optimisation du protocole de purification pour chaque PEL, où extrêmement basses ou élevées T t s, il faudra le plus modification de ce protocole standard. PEL avec des températures de transition extrêmement élevées peuvent être inappropriés pour la purification de cette approche. Si la conception de nouveaux PEL et peptides ou protéines PEL fusions peut compromettre la réponse thermique du PEL, une étiquette histidine simple peut être inclus pour la purification de remplacement par chromatographie d&#39;affinité sur métal immobilisé. De plus,caractéristiques de la séquence PEL peuvent nécessiter une modification de ce protocole si le résidu d&#39;hôtes est chargée. Manipulation du pH du tampon peut être utilisé comme une méthode pour modifier la charge globale du PEL dans un effort pour éliminer les interactions électrostatiques avec les contaminants 17. En outre, ce protocole est appropriée dans le cas particulier des fusions PEL avec des peptides et des protéines lorsque des mesures appropriées sont prises pour s&#39;assurer que le processus de purification ne perturbe pas l&#39;activité du groupe fusionné. Remarques à travers le protocole relatif à ces modifications servent à diriger la purification des PEL qui peuvent présenter ces défis par rapport à T t, charge, ou de fusion préoccupations. La purification de PEL par le biais de leur comportement LCST présente une approche simple et gratuit Chromatographie à purifier la majorité des PEL et de peptides ou de protéines PEL fusions exprimé dans E. coli. Le protocole résumées ici permet de purifier of PEL en un seul jour à l&#39;aide de l&#39;équipement qui est commun à la plupart des laboratoires de biologie. La facilité de purification des PEL et leurs fusions sera, nous l&#39;espérons, encourager une diversité toujours croissante de modèles de PEL pour de nouvelles applications en science des matériaux, la biotechnologie et la médecine.

Polypeptides élastine (PEL) sont des biopolymères composé de la VPGXG pentapeptidique répétition où X, le résidu d&#39;hôtes, est un acide aminé sauf la proline. PEL exposition température de solution critique inférieure (LCST) un comportement de transition de phase, de telle sorte qu&#39;une solution homogène PEL va se séparer en deux phases lors du chauffage à la LCST qui est communément appelé la température de transition inverse (T t) dans la littérature ELP 1. Les deux phases sont constituées d&#39;une phase très diluée de globule PEL et une phase riche en sédiment de ELP. Les riches sédiments PEL est formée sur une courte échelle de temps sur l&#39;agrégation des chaînes de PEL en particules micrométriques qui fusionnent par la suite. Ce problème se produit dans une plage de un quelques degrés Celsius et est typiquement réversible, sous forme de solution homogène, on récupère lors de son retour à une température inférieure à la T t. PEL sont typiquement synthétisés dans Escherichia coli (E. coli) from un gène artificiel qui est ligaturé dans un plasmide d&#39;expression. Ce plasmide est ensuite transformé dans un E. Lignée cellulaire coli qui est optimale pour l&#39;expression de protéines. Nous avons utilisé exclusivement le système de vecteur T7-lac animal de compagnie pour l&#39;expression d&#39;une grande variété de PEL dans E. coli, bien que d&#39;autres systèmes d&#39;expression dans la levure 2-4, 5 champignons, plantes et 6-8 ont également été utilisés par d&#39;autres chercheurs. Un certain nombre d&#39;approches existent pour construire génétiquement gènes PEL répétitives, y compris la ligature récursive directionnelle (RDL) 9, récursif ligature directionnelle par la reconstruction de plasmide (pré-RDL) 10, et se chevauchent prolongation amplification par cercle roulant (OERCA) 11. La capacité de construire PEL au niveau génétique offre la possibilité d&#39;utiliser des techniques de l&#39;ADN recombinant pour créer PEL avec une variété d&#39;architectures (par exemple, monoblocs, diblocs, triblocs, etc), qui peut encore être ajouté avec fonctionnellepeptides et protéines. Contrôle au niveau génétique garantit également que chaque PEL est exprimée par la longueur et la composition exacte dicté par son modèle de plasmide génétique, la fourniture de produits de biopolymères parfaitement monodisperses. Les propriétés thermiques de chaque PEL dépendent des paramètres intrinsèques au biopolymère tel que son poids moléculaire (PM) et de la séquence, ainsi que des facteurs extrinsèques, notamment sa concentration en solution et la présence d&#39;autres co-solutés, tels que des sels. La longueur du PEL 12 et sa composition de résidus d&#39;hôtes 1, 13, 14 sont deux paramètres orthogonaux dans la conception du PEL qui peuvent être utilisés pour contrôler la T t, où les résidus de voyageurs hydrophobes et des longueurs de chaîne entraînent inférieure T t s, tandis hydrophile résidus de voyageurs et des longueurs de chaînes plus courtes donnent une plus haute T t s. Concentration PEL est inversement proportionnelle à la T t, où des solutions de grconcentration mangeur de PEL ont inférieure T t s 12. Le type et la concentration de sels influencent aussi le PEL T t, où l&#39;effet de sels suite à la série de Hofmeister 15. Anions kosmotropiques (Cl - et plus sur la série de Hofmeister) abaissent le PEL T t et l&#39;augmentation de la concentration en sel augmente cet effet. Ces paramètres intrinsèques et extrinsèques peuvent être ajustées pour obtenir un comportement thermique dans une plage de température cible qui est nécessaire pour une application spécifique d&#39;un PEL. Le comportement de stimulus-réponse de PEL est utile pour un large éventail d&#39;applications, y compris les biocapteurs 16, 17, ingénierie tissulaire 18, et l&#39;administration de médicaments 19, 20. En outre, lorsque les PEL sont fusionnés à des peptides ou des protéines au niveau génétique, le PEL peut servir de marqueur de purification simple de proposer un procédé de traitement par lots peu coûteux pour la purification de pep recombinantmarées ou des protéines qui ne nécessite pas Chromatographie 21. Modification du procédé de purification permet de s&#39;assurer que l&#39;activité du peptide ou de la protéine fusionnée à l&#39;ELP est maintenue. Peptide ou protéine ELP fusions peuvent être purifiés pour des applications dans lesquelles le mot-clé PEL est utile 22, 23 ou en variante, lorsque la protéine ou le peptide libre est nécessaire, un site de reconnaissance de protéase peut être inséré entre le peptide ou la protéine et le PEL. Retrait de l&#39;étiquette PEL peut alors être obtenue par digestion avec une protéase libre ou un PEL fusion de la protéase, lorsque celui-ci fournit la facilité supplémentaire de traitement comme une ronde finale de purification PEL peut séparer le PEL tag et protéase PEL fusion du peptide cible ou protéine en une seule étape 24, 25. Le protocole suivant décrit la procédure de purification pour les PEL et les peptides ou protéines ELP fusions au moyen de leurs propriétés thermiques et traite des techniques de base pour caractériserla réponse thermique de produits de PEL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1503">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pET-24a(+) 
			pET-25b(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69749-3 
			69753-3</td>
			<td>T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra BL21 (DE3) competent cells</td>
			<td>Edge BioSystems</td>
			<td>45363</td>
			<td>Competent E. coli for recombinant protein expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media</td>
			<td>MO BIO Laboratories</td>
			<td>12105</td>
			<td>Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C</td>
			<td>IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524650</td>
			<td>These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>195444</td>
			<td>PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td>These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td>A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 &#956;l</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>161-1105</td>
			<td>These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C454-500</td>
			<td>A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter: 
			0.02 &#956;m 
			0.1 &#956;m 
			0.2 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6809-1002 
			6809-1012 
			6809-1022</td>
			<td>These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV filter: 
			0.45 &#956;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHVX13NK</td>
			<td>These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-chromatographic purification of recombinant elastin-like polypeptides and their fusions with peptides and proteins from escherichia coli

Polypeptides d&#39;élastine sont des biopolymères tels que répétitives qui présentent un comportement critique inférieure de transition de phase de la température de solution, comme unimères solubles existant en dessous d&#39;une température de transition caractéristique et en agrégeant coacervats l&#39;échelle du micron au-dessus de leur température de transition. La conception de polypeptides de type élastine au niveau génétique permet un contrôle précis de leur séquence et de la longueur, qui dicte leurs propriétés thermiques. Polypeptides élastine sont utilisés dans une variété d&#39;applications, y compris les biocapteurs, ingénierie tissulaire, et l&#39;administration de médicaments, où la température de transition et de l&#39;architecture de biopolymère du PEL peuvent être accordés pour l&#39;application spécifique d&#39;intérêt. En outre, le comportement de transition de phase de la température de solution critique inférieure de polypeptides d&#39;élastine-like permet leur purification par leur réponse thermique, de telle sorte que leur coacervation sélective et resolubilisation permet l&#39;élimination des contaminants à la fois solubles et insolubless suivant l&#39;expression dans Escherichia coli. Cette approche peut être utilisée pour la purification seuls ou comme un outil de purification pour peptides ou de protéines fusions où des peptides ou des protéines recombinantes génétiquement annexées à étiquettes de polypeptide de type élastine peut être purifié sans chromatographie polypeptides de type élastine. Ce protocole décrit la purification de polypeptides de type élastine et de leurs peptides ou de protéines fusions et traite des techniques de base de caractérisation afin d&#39;évaluer le comportement thermique de produits de polypeptides de type élastine pures.

Nous décrivons ici des résultats représentatifs pour la purification et la caractérisation d&#39;un homopolymère et d&#39;un PEL copolymère dibloc ELP. Après 24 h d&#39;expression dans E. coli, les cellules sont recueillies par centrifugation et lysées par sonication. En général, un changement subtil de couleur commence après la sonication, la lyse des cellules confirmant suffisant (figure 1A). Après l&#39;addition de PEI, les composants génomiques et les débris cellulaires sont récupérés par centrifugation, la séparation d&#39;un grand culot de contaminants insolubles de la ELP soluble dans le surnageant (figure 1B). PEL est encore purifié par inverse cycle de transition (ITC), qui exploite le comportement LCST pour séparer le PEL de contaminants solubles et insolubles (figure 2) 28. La transition de phase de l&#39;ELP est déclenchée par l&#39;addition de chaleur et / ou de sel. les résultats de la centrifugation dans la formation d&#39;un culot au fond du tube qui est constitué d&#39;un PELe certains contaminants insolubles (figure 1C). Cette étape appelée une chaude spin-rejets contaminants solubles dans le surnageant tandis que le culot PEL est conservé et remis en suspension dans un tampon froid. Le resolubilisée PEL est de nouveau centrifugé à 4 ° C. Cette étape appelée le rhume spin-rejets le culot de contaminants insolubles tandis que le surnageant contenant PEL soluble est conservée. Répéter le cycle d&#39;alternance des tours chauds et froids augmente la pureté du PEL, mais au prix d&#39;une légère baisse de rendement, comme PEL résiduelle est perdue à chaque tour ITC dans des tubes de centrifugation et sur les embouts de pipette. Purification réussie de PEL et peptides ou de protéines fusions PEL est confirmée par SDS-PAGE. De petites aliquotes prises pendant le processus de purification démontrent la purification progressive de PEL de l&#39;E. lysat coli. PEL est surexprimée dans E. brut coli lysat et contaminants diminuent l&#39;esprith cycles successifs de l&#39;ITC (Figure 3). Purifiée PEL apparaît comme une seule bande près de la MW théorique prédit. Le PEL T t est caractérisé par turbidimétrie température programmée. Le profil de la turbidité d&#39;un homopolymère PEL présente une forte augmentation unique de DO à 350 nm (environ 2,0 unités au-dessus de base pour une concentration de 25 uM PEL) (figure 4A). Refroidissement des balayages de turbidité confirment la nature réversible de la transition ELP comme la DO retourne à la ligne de base lorsque la température est abaissée en dessous de la T t (Figure 4B). PEL copolymères diblocs présentent un profil plus complexe de la turbidité, par rapport au homopolymère PEL. La DO augmente généralement la première à 0,1-0,5 unités au-dessus de base, après quoi les OD augmente fortement à 2,0 unités au-dessus de base (figure 5A). DLS mesures fournissent des informations sur le changement de R H par rapport à la température, co<html> rroborating l&#39;information obtenue à partir du profil de turbidité (figure 5B). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. D&#39;épuration PEL préliminaire. Après 24 h d&#39;expression, E. coli cellules sont collectées par centrifugation et remises en suspension dans du PBS. A) Les cellules sont lysées par sonication, qui est accompagnée par un changement subtil de couleur de telle sorte que le lysat s&#39;assombrit après sonication. B) Après addition de PEI pour condenser les contaminants d&#39;ADN, le lysat est centrifugée et un grand culot de débris insoluble est séparé du PEL soluble dans le surnageant. C) La transition PEL est induite par l&#39;addition de chaleur et / ou de sel et des formes de centrifugation une pastille PEL translucide.ank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2. Inverse transition vélo. PEL est purifié par son comportement LCST de contaminants solubles et insolubles. En commençant par le PEL riche lysat (1) la transition PEL est induite par l&#39;addition de chaleur et / ou de sel et le PEL est séparé par centrifugation (spin chaud) (2). Le culot est conservé ELP (3a), tandis que le surnageant contenant les contaminants solubles est jeté (3b). Le PEL est remis en suspension dans du tampon froid (4) et de nouveau centrifugé à 4 ° C (essorage à froid) (5). Le culot contenant les contaminants insolubles est éliminée (6a), tandis que le surnageant contenant PEL soluble est retenue (6b). Les cycles de rotations alternées chaudes et froides sont répétées jusqu&#39;à ce que la pureté souhaitée est atteinte, telle que déterminée avecSDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3. Analyse SDS-PAGE de PEL produits de purification. Purification réussie d&#39;un PEL est confirmée par SDS-PAGE. Surexprimée PEL est évident dans le E. brut coli lysat après sonication (2). Après l&#39;addition de PEI et centrifugation du PEL soluble est largement conservée dans le surnageant (3), bien que certains PEL est perdue dans le culot écarté de contaminants insolubles (4). Le surnageant après la première centrifugation à chaud contient des niveaux élevés de contaminants solubles (5). Surnageant après la première rotation froid indique une bonne séparation des PEL de contaminants insolubles (6). Cycles supplémentaires de chaud (7) et cvieux tourne (8) éliminer les contaminants solubles et insolubles résiduels, respectivement, jusqu&#39;à ce que chaudes (9) et d&#39;essorage à froid (10) les surnageants ne présentent pas de bandes finales de contaminants extérieurs, ce qui confirme la pureté satisfaisante du produit ELP. Cette homopolymère de PEL, avec une séquence de SKGPG (VGVPG) 80-Y, a un poids moléculaire attendu de 33,37 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4. Caractérisation des PEL homopolymère par turbidimétrie température programmée. L&#39;PEL T t est déterminée par le suivi de la DO à 350 nm tout en augmentant la température à une vitesse de 1 ° C / min. A) homopolymères de PEL présentent une forte augmentation unique OD que defines leur T t à une concentration donnée. B) La réversibilité de la transition PEL est vérifié par surveillance de la DO à 350 nm d&#39;une solution à 25 μ M, tout en diminuant la température, où la réversibilité est confirmée par le retour de l&#39;OD au niveau de référence. Cette homopolymère PEL a la séquence SKGPG (VGVPG) 80-Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" width="600" /> Figure 5. Caractérisation des PEL copolymère dibloc par turbidimétrie température programmée et la diffusion dynamique de la lumière. PEL qui subissent nano-échelle d&#39;auto-assemblage, comme PEL copolymères diblocs qui s&#39;auto-assemblent en micelles sphériques, des profils de turbidité plus complexes d&#39;exposition. <strong&gt; A) Augmentation modérée OD indique la transition de unimères de micelles, avant une augmentation rapide de la DO qui indique l&#39;agrégation complète du PEL en agrégats micrométriques. B) DLS mesures confirment le comportement déduit du profil de la turbidité pour un solution à 25 uM en fournissant des informations sur la variation de R H par rapport à la température. Voici la unimère PEL a une R H ~ 8 nm et la micelle a une R H ~ 25 nm. Ce copolymère dibloc PEL a la séquence GCGWPG (VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30 PGGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51583/51583fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Polypeptides élastine sont des biopolymères de relance sensible avec des applications allant de la purification de protéines recombinantes à l&#39;administration de médicaments. Ce protocole décrit la purification et la caractérisation de polypeptides d&#39;élastine-like et leurs fusions peptidiques ou protéiques provenant d&#39;Escherichia coli en utilisant leur comportement critique inférieure de transition de phase de la température de la solution comme une simple alternative à la Chromatographie.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

non-chromatographic-purification-recombinant-elastin-like

Research

JoVE Journal

Biology

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

21.5K vues.  Duke University.  Polypeptides élastine sont des biopolymères de relance sensible avec des applications allant de la purification de protéines recombinantes à l'administration de médicaments. Ce protocole décrit la purification et la caractérisation de polypeptides d'élastine-like et leurs fusions peptidiques ou protéiques provenant d'Escherichia coli en utilisant leur comportement critique inférieure de transition de phase de la température de la solution ...

Vidéo: Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Et<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...