<ol>
	<li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+'debris'.">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li><li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression.">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li><li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells.">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li><li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+exosomes:+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery.">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li><li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes.">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+sizing+of+nano/microparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor.">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li><li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors.">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li><li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions.">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li><li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions.">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li><li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors.">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li><li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions.">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li><li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing.">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li><li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing.">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li></ol>

تطوير بروتوكول الواردة وكتابة هذه المخطوطة وقد تم دعم ماليا، في جزء منه، من قبل مؤسسة الهولندية الدماغ، مؤسسة شوماخر كرامر، وصندوق Bohnenn. تم sponsorted إنتاج هذا المقالة الفيديو جزئيا Izon.

البروتوكولات الموضحة في هذه المنهجيات عرض مخطوطة لتقدير حجم وخصائص المركبات الكهربائية باستخدام الحزب الراديكالي عبر الوطني. أهم مزايا منصة الحزب الراديكالي عبر الوطني هي صغر حجم العينة، النسبية قياس مدة قصيرة وغياب المطلوبة التلاعب العينة. شرط أساسي لقياس دقيق الحزب الراديكالي عبر الوطني هو الحفاظ على ظروف مماثلة بين معايرة والعينة. هذا يشمل استخدام مخازن مماثلة وكذلك إعدادات أداة مماثلة، مثل حجم ثقب النانو، والجهد والضغوط التي مورست. وVPM الأصلي يفتقر الى آلية لتحديد الدقيق للضغط المطبق، مما يسبب اختلافات طفيفة في الضغوط التي مورست بين العينات. أيضا، تبخر السوائل في فتيلة VPM يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة عند قياس الضغط عند نقاط زمنية مختلفة وVPM يجب بالتالي غالبا ما يعاد معبي. ويحتمل أن تكون هذه القيود تم حلها بواسطة إدخال VPM2، التيلديه القياس القائم على نقرة ويقوم ضغط الهواء. بروتوكول بديل وصفها في هذه المخطوطة هي مناسبة خاصة لقياس المركبات الكهربائية في العينات البيولوجية غير المنقى 17. ونحن نعتقد أن مكونات العازلة، مثل السكريات والدهون والبروتينات وغيرها من الحطام أكبر، ويمكن في بعض الحالات تؤثر على الكثير من شروط القياس لبروتوكول قياسي لتكون قابلة للتطبيق. إضافة الخرز المعايرة للعينة بدلا من المقارنة بين اثنين من القياسات منفصلة يقدم &quot;المعايرة في الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة عند مقارنة عينات (مثل بلازما الدم من مختلف الجهات المانحة) التي لديها مختلفة و / أو غير معروفة محتويات خلفية الموائعية. على الرغم من وجود اختلافات بين المركبات الكهربائية وجزيئات البوليستيرين (مثل كثافة الجسيمات وتهمة السطحية)، والنماذج النظرية وكذلك البيانات التجريبية تؤكد على قابليتها للاستخدام من الخرز البوليسترين لتقدير حجم والتنميط من المركبات الكهربائية،تحت شرط أن يتم تطبيق ضغط كبير 15،19. للحد من تأثير القوى حركي كهربي، وينصح استخدام من أكبر نسبيا NP150 / NP200 ثقب النانو وضغط إيجابي كبير. وتتميز السيارات الكهربائية والخرز المعايرة من حيث الحجم. وبالتالي، فإن ثقب النانو لابد من فتح طريق تطبيق تمتد، إلى قطر حيث لوحظ الكشف عن كل من المركبات الكهربائية ومعايرة جزيئات أكبر. منذ افتتاح المسام وتقلل من حساسية تجاه جسيمات أصغر، المركبات الكهربائية فقط أكبر من حجم معين يتم تسجيلها (غالبا المركبات الكهربائية&gt; 120 نانومتر عند استخدام 335 نانومتر المعايرة حبة). يمكن انخفض الحد الأدنى لكشف المركبات الكهربائية إلى حوالي 90 نانومتر، وذلك باستخدام 203 نانومتر الخرز المعايرة على ثقب النانو NP150. ومع ذلك، قد يكون هذا الإعداد غير مجدية عندما المركبات الكهربائية الكبيرة تحفز انسداد المتكرر للثقب النانو. وجود هذه المركبات الكهربائية عرقلة قد يجبر الاستفادة من الإعداد حيث يبلغ عدد سكانها المركبات الكهربائية، صغير جدا لالجرميةCH يقع عتبة الكشف، لن يتم الكشف عنها. صعوبة لتشغيل يزيد النظام عند محاولة قياس جسيمات أصغر من 100 نانومتر في الحجم. في مثل هذه الحالات، يمكن تحسين الكشف عن طريق زيادة تركيز ملح بالكهرباء. ومن شأن زيادة تركيز أيون تحفز زيادة نسبيا مقادير الحصار عن جزيئات صغيرة (أكبر نسبة الإشارة إلى الضوضاء). جدوى هذه التقنية لقياس المركبات الكهربائية لابد من التحقق من صحتها على الرغم، كما زاد تركيز الملح قد يؤثر على حجم المركبات الكهربائية. في الختام، ومنصة الحزب الراديكالي عبر الوطني يمكن استخدامها لتقدير حجم المباشر وتوصيف المركبات الكهربائية. منذ لا يلزم العزلة أو التلاعب EV (الضد ملزمة أو وضع العلامات الفلورية)، ومنصة مناسبة لتقدير EV المباشر في السوائل البيولوجية. يتم توفير بروتوكول بديل يمكن أن تكون مفيدة للعينات حيث مكونات عازلة تحفز cloggin المسام الكبيرةز الأحداث، مما يجعل استخدام موثوق لبروتوكول قياسي غير مجدية.

الحويصلات من أصل الخلوي وفيرة للغاية في سوائل الجسم 1. تتشكل - (1،000 نانومتر في حجم 50) إما الانصهار هيئات متعددة حويصلي مع الغشاء الخلوي أو عن طريق التبرعم الخارجي المباشر للغشاء الخلوي هذه يسمى الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية). في السنوات الأخيرة، والفائدة العلمية في المركبات الكهربائية ازداد الى حد كبير، مما أدى إلى عدد كبير من المطبوعات التي تركز على EV، التي تم وصفها وظائف وخصائص المركبات الكهربائية الجديدة 1. ويعتقد أن المركبات الكهربائية الآن أن تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل نقل الإشارة، وتنظيم المناعة، وتخثر الدم 1-4. في السرطان، يبدو أن السيارات الكهربائية للعب دور في تشكيل منافذ premetastatic 5،6، ونقل المحتوى الموالية لل7،8 السرطاني وتنشيط الأوعية الدموية 8. بالإضافة إلى ذلك، يتم استكشاف المركبات الكهربائية كوكلاء تسليم العوامل العلاجية 9. على الرغم من هذه ديvelopments، الكمي موثوق بها من المركبات الكهربائية لا يزال تحديا. تقليديا، يتم استخدام أساليب القياس الكمي غير المباشرة، التي تعتمد على القياس الكمي لمحتوى البروتين الكلي أو بروتينات معينة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، وهذه التقنيات لا تشكل البروتين لكل EV الاختلافات، ولا تميز بين تلويث المجاميع البروتين والبروتينات في المركبات الكهربائية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تتطلب عزل المركبات الكهربائية، مما يجعل المقارنة بين تركيزات EV في العينات البيولوجية مستحيلا في كثير من الحالات. ولذلك، تبذل جهود لتطوير أساليب جديدة تسمح لقياس EV أكثر دقة ومباشرة 10. ويصف هذا التقرير استخدام الانضباطي الاستشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني) لتقدير موثوق بها وحجم التنميط من المركبات الكهربائية. حاليا، وqNano أداة (الشكل 1A) هو منصة فقط متاحة تجاريا للالحزب الراديكالي عبر الوطني. في الحزب الراديكالي عبر الوطني، تتخللها غشاء مرن غير موصل وايعشر المسام نانو الحجم وفصل خليتين السوائل. يتم تعبئة إحدى الخلايا السوائل مع عينة من الفائدة، في حين يتم تعبئة الخلايا الأخرى مع خالية من الجسيمات بالكهرباء. عن طريق تطبيق الجهد، يتم إنشاء ل/ تدفق التيار الكهربائي الأيونية، والتي يتم تبديل على نقل الجزيئات من خلال المسام (الشكل 1B). حجم هذا الحصار الحالي (&#39;نبض مقاوم&#39;) يتناسب مع حجم الجسيمات 11 (الشكل 1C). مدة الحصار يمكن استخدامها لتقييم إمكانات زيتا من الجزيئات، التي تعتمد على خصائص الجسيمات مثل تهمة أو شكل 12. حجم الجسيمات التنميط غير معروفة يمكن أن يؤديها من خلال مقارنة النبضات مقاوم تسببها الجزيئات غير معروفة مع نبضات مقاوم الناجمة عن الجسيمات التي يبلغ قطرها المعايرة المعروفة. إلى جانب ضخامة الحدث الحصار، ويقاس معدل هذه التي تحدث. هذا RELI معدل عددوفاق على تركيز الجسيمات. حيث أن تركيز ومعدل الحصار هم خطيا النسبي 13، باستخدام عينة معايرة واحدة مع تركيز جزيئات معروفة وحجم الجسيمات يسمح لقياس تركيز 14 و 11 من توزيع حجم عينة مجهولة. يتم تحديد حركة الجزيئات من خلال ثقب النانو من قبل قوات الكهربائية kinetic- (الكهربي والكهربائية التناضحي) والموائعية 15. باستخدام وحدة ضغط متغير (VPM) فرق الضغط بين الخلايا السوائل يمكن أن يتسبب كقوة إضافية. تطبيق الضغط الايجابي يزيد من معدل تدفق الجسيمات، والتي قد تكون ذات فائدة عندما يكون تركيز الجسيمات منخفضة. أيضا، يمكن تطبيق ضغط للحد من تأثير القوى الكهربائية الحركية. هذا مهم خصوصا عند استخدام نانوية بقطر النسبي مسام صغيرة (NP100، NP150 وربما NP200) وغالبا ما تستخدم للكشف عن المركبات الكهربائية.لهذه نانوية حتى عند تطبيق ضغط كبير وقوى الكهربائية الحركية يمكن، اعتمادا على الجسيمات تهمة السطح، تبقى nonnegligible 16. عن طريق قياس معدل الجسيمات في ضغوط متعددة، وهو كهربية تصحيح حركيا، وبالتالي أكثر دقة، يمكن حساب تركيز EV. هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتحديد حجم التوزيع وتركيز المركبات الكهربائية. بجانب بروتوكول تشغيل منتظم، وصفت نهج بديل حيث ارتفعت العينات مع الخرز البوليسترين من حجم معروف وتركيز 17. هذه التقنية المعايرة في الوقت الحقيقي يمكن استخدامها للتغلب على بعض التحديات التقنية واجهتها عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية، مثل البول، والبلازما وزراعة الخلايا طاف، أو عند استقرار ثقب النانو على مدى فترة طويلة من الزمن قياس لا يمكن أن يكون ضمان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية)، بما في ذلك &quot;microvesicles &#39;و&#39; exosomes، وفيرة للغاية في سوائل الجسم. وقد شهدت السنوات الأخيرة زيادة هائلة في الاهتمام المركبات الكهربائية. وقد ثبت المركبات الكهربائية للعب أدوار مهمة في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، والسرطان. بالإضافة إلى ذلك، المركبات الكهربائية المحتملة لها كعوامل علاجية، على سبيل المثال بوصفها وسائل إيصال المخدرات أو الطب التجديدي. بسبب صغر حجم (50 إلى 1،000 نانومتر) الكمي الدقيق وحجم التنميط من المركبات الكهربائية يمثل تحديا تقنيا. يصف هذا البروتوكول كيف الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار (الحزب الراديكالي عبر الوطني) والتكنولوجيا، وذلك باستخدام نظام qNano، يمكن أن تستخدم لتحديد تركيز وحجم المركبات الكهربائية. الطريقة التي تعتمد على الكشف عن المركبات الكهربائية على نقلهم من خلال المسام نانو الحجم، سريع نسبيا، يكفي استخدام أحجام عينة صغيرة ولا تتطلب بورification وتركيز المركبات الكهربائية. ارتفعت عينات المقبلة لبروتوكول عملية منتظمة يوصف نهج بديل يستخدم مع الخرز البوليسترين من حجم معروف والتركيز. هذا في الوقت الحقيقي تقنية المعايرة يمكن استخدامها للتغلب على العقبات الفنية اجه عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية.

<html> لاستخدام أداة الحزب الراديكالي عبر الوطني، وهو ثقب النانو غير موصل لابد من وضعها على 4 أحضان آلة (الشكل 1A) والجهد (الشكل 1B) لابد من تطبيقها. بمجرد تحديد خط أساس التيار الكهربائي، وسيتم الكشف عن نبضات مقاوم الناجمة عن الجسيمات التي تمر عبر المسام كما هو موضح في الشكل 1C. تم تنقيته من المركبات الكهربائية طاف ثقافة الخلية من ورم أرومي دبقي خط الخلية U87-MG / EGFRvIII بواسطة تنبيذ فائق. ويلاحظ وجود الجسيمات مستقرة معدل مؤامرة عند قياس المركبات الكهربائية معزولة (الشكل 2A) على ثقب النانو NP100. هذا مطلوب مستقرة الجسيمات معدل مؤامرة لقياس تركيز موثوق EV. بعد الاقتران تسجيل EV-العينة إلى تسجيل 115 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة، توزيع حجم (الشكل 2B) وتقدير تركيز EV-عينة يمكن الحصول على (لا تظهر البيانات). وتم قياس كمية = &quot;jove_content&quot;&gt; المركبات الكهربائية أيضا مباشرة في ورم أرومي دبقي زراعة الخلايا طاف. عند قياس المركبات الكهربائية في العينات البيولوجية، ثقب النانو انسداد غالبا ما يؤدي إلى انقطاع و / أو تقلبات في مؤامرات معدل الجسيمات (Figrue 3A). وهذا يؤدي إلى عدم دقة تقديرات تركيز EV. بواسطة ارتفاعه العينة مع الخرز البوليسترين تركيز معروف والحجم، يمكن تحديد نسبة EV إلى حبة. يوضح الشكل 3B النتائج المتحصل عليها بعد ارتفاعه خلية ثقافة طاف مع الخرز البوليسترين من 335 نانومتر في الحجم. لوحظ اثنين من السكان واضح. الجسيمات الأمر الذي أدى إلى حصار أقل من 0.46 غ المركبات الكهربائية هي مصممة، يتم تحديد الجزيئات الكبيرة الخرز البوليسترين. يتم استخدام نسبة من المركبات الكهربائية لالخرز البوليسترين لحساب تركيز الخام من المركبات الكهربائية (الجدول 1). يوضح الشكل 3C تقدير حجم السكان اثنين بناء على الخرز البوليسترين ارتفعت. إعادة الإعداد ثقب النانو المستخدمةsulted في الكشف عن المركبات الكهربائية&gt; 140 نانومتر في الحجم. هذا يمكن تخفيضها عن طريق الحد من فتح ثقب النانو، ولكن هذا سوف يؤدي أيضا إلى انسداد الأحداث أكثر. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1: qNano أداة وطريقة عملها. (A) صورة من الصك. يتم وضع وثقب النانو على الصك، وفصل خلية السوائل أقل من خلية السوائل العليا. محمية خلايا السائل من التداخل الكهربائي البيئي من خلال الغطاء التدريع. (B) رسم توضيحي يبين الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني). وهناك ثقب النانو مرونة غير موصل وفصل خليتين السوائل. عن طريق تطبيق الجهد ينشأ تيار كهربائي من خلال المسام ثقب في ثقب النانو. كما الحويصلات خارج الخلية التحرك من خلال ثقب النانو، يتم تبديل تدفق الأيونية والكشف عن نبض مقاوم. في الحزب الراديكالي عبر الوطني يمكن ضبطها حجم افتتاح ثقب النانو (خفض أو زيادة) التي تمتد من ثقب النانو عن طريق زيادة المسافة بين أحضان المعارضة الصك، أو الحد من هذه المسافة. (C) مثال توضيحي من البقول مقاوم. حجم نبض مقاوم واحد يتناسب مع حجم الجسيمات: البقول أكبر تشير الجسيمات الأكبر حجما <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2: الجسيمات العد المؤامرة وحجم التوزيع تم الحصول عليها من قياس المركبات الكهربائية المعزولة من U87-MG / EGFRvIII زراعة الخلايا طاف (A) الجسيمات العد مؤامرة تشير كشف الجسيمات المستمر الشامل. تخفيض موجز لparticوقد لوحظ لو كشف ما بين 80 و 100 ثانية من التسجيل. بعد التوقف تسجيل والتنصت الغطاء التدريع، استقر معدل الجسيمات التي استؤنفت بعد التسجيل. (B) يتم رسم توزيع حجم المركبات الكهربائية المعزولة بعد معايرة عينة غير معروفة (السيارات الكهربائية) إلى 115 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة. (5 نانومتر بن حجم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> الشكل 3: الحزب الراديكالي عبر الوطني الكمي من المركبات الكهربائية في خلية ثقافة طاف باستخدام بروتوكول بديل. (A) المؤامرات معدل الجسيمات النموذجية التي تم الحصول عليها عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السائل البيولوجي. انسداد المسام يسبب انقطاع قصيرة والتقلبات في معدل كشف الجسيمات. كلتمثل مؤامرة قياس تكرار لنفس العينة. الرسوم البيانية (B) ثلاثة تكرار حجم التوزيع التي تم الحصول عليها بعد ارتفاعه خلية ثقافة طاف مع 335 نانومتر الخرز البوليسترين المعايرة. ويتم اختيار جميع الجزيئات الأمر الذي أدى إلى نبض مقاوم أقل من 0.46 غ والمركبات الكهربائية. يمكن استخدامها (C) والخرز البوليسترين ارتفعت للحصول على حجم توزيع العينة. (5 نانومتر بن حجم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> قياس </td><td> المعايرة فقط # 1 </td><td> المعايرة فقط # 2 </td><td> طاف # 1 </td><td> طاف # 2 </td><td> طاف # 3 </td></tr><tr><td> متوسط ​​الحالية (غير متوفر) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;TD&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> معدل الجسيمات </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> قطع يستخدم (NA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> مجموع الجسيمات </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> الحويصلات خارج الخلية </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> ارتفعت الخرز المعايرة </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> المركبات الكهربائية / الخرز المعايرة </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0.788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> عينة - الخلفية </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> الحويصلات Extracelullar (10 7) / مل </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> عينة 2.5x و المخفف </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> المركبات الكهربائية تركيز الخام (10 7) / مل </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: مثال لحساب تركيز EV باستخدام بروتوكول بديل قيمة قطع عازمة على التمييز بين المركبات الكهربائية من الخرز المعايرة. بعد ذلك، يمكن استرداد إجمالي عدد المركبات الكهربائية والخرز. لكل قياس يتم احتساب نسبة EV إلى حبة. يتم حساب كمية من الجسيمات الخلفية في الكهارل (للبروتين المجاميع سبيل المثال) عن طريق حساب متوسط ​​نسبة EV إلى حبة للقياسات الفردية من &#39;الخرز المعايرة فقط &quot;عينة. لكل عينة وطرح نسبة من خلفية النسبة التي حصل عليها. هذا adjusteيتم ضرب نسبة د من تركيز حبات المعايرة في العينة (في هذا المثال: 9.33e7 / مل). لتحديد تركيز الخام من المركبات الكهربائية، يتم ضرب تركيز حصلت عليها عامل المركبات الكهربائية التخفيف الكلي (في هذا المثال: 2.5).

Watch this Scientific Journal Video about Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing at JoVE.com

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الحويصلات خارج الخلية تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، وسرطان أو وكلاء العلاجية المحتملة كما في تسليم المخدرات أو الطب التجديدي. يعرض هذا البروتوكول أساليب لتقدير حجم وخصائص الحويصلات خارج الخلية المعزولة وغير المعزولة في السوائل المختلفة باستخدام الاستشعار عن الانضباطي مقاوم النبض.

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  الحويصلات خارج الخلية تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، وسرطان أو وكلاء العلاجية المحتملة كما في تسليم المخدرات أو الطب التجديدي. يعرض هذا البروتوكول أساليب لتقدير حجم وخصائص الح...

Video: Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

أجوف Microneedle المستندة إلى الاستشعار عن تعدد في الإرسال الاستشعار الكهروكيميائية عبر الجلد

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

الاستشعار من الجدار الأنسجة تعطيل مع الترانزستور العضوي الكهروكيميائية

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة استشعار لتقدير حجم انتشار غشائي، الحاجز وظيفة، والحركة

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

تصنيع ميكانيكيا الانضباطي والحيويه المعادن سقالات للتطبيقات الطبية الحيوية

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

تقرير زيتا المحتملة عبر جسيمات متناهية الصغر إزفاء السرعات من خلال الانضباطي ثقب النانو: استخدام الجسيمات المعدلة الحمض النووي كمثال

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...