الهدف العام من هذا المقال، هو إعداد الضامة وخلايا الدم الحمراء opsonized لتصور البلعوم بواسطة المجهر الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل كيفية التقاط الفأبعات وابتلاع الجسيمات. تسمح هذه التقنية بالتصور من امتصاص الجسيمات في الوقت الحقيقي، على عكس في أكثر التقليدية نهاية نقطة المقايسات التي تسمح فقط لتقييم ما إذا كان ولكن ليس كيف، تم تناول الجسيمات.
عموما، قد الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال حتى أنها تصبح معتادة على إجراءات عزل الخلية. كان لدينا فكرة لأول مرة لهذا الأسلوب عندما أدركنا مزايا الغزل هذا المجهر confocal لتصوير 3D الفاصل الزمني من البلعوم. لعزل الضامة البريتونية ، ضع قسطرة بلاستيكية قياس 24 في الصفاق من فأر عمره ثلاثة إلى أربعة أشهر ، واستخدم حقنة بلاستيكية خمسة ملليلتر لتجميف التجويف مرتين مع 4.5 ملليلتر من HBSS الجليد البارد دون الكالسيوم والمغنيسيوم في lavage.
نقل التعليق المستنشق إلى أنبوب قاع دائري من البولي بروبلين 14 ملليلتر كما يتم جمعه. عندما تم حصاد كل من العينات، الطرد المركزي الpirate، وrsuspend الخلايا البريتونية في ملليلتر واحد من كامل بيكربونات 1640 1640 المتوسطة مجانية لتحقيق حوالي ست مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر التركيز. بعد ذلك ، لإضافة الشرائح قبل التعبئة ملليلتر واحد من HEPES كاملة تكملها المتوسطة إلى خزان واحد من شريحة قناة مغلفة ليفينيكتين ، وإمالة الشريحة للسماح للوسيط أن يستنشق من خزان المصب.
لإزالة فقاعات الهواء غير المرغوب فيها، إضافة 1 إلى 2 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى واحد من الخزانين، وتطبيق بإحكام غطاء الخزان. ثم تطبيق ضغط الإبهام الإيقاعي على الغطاء لضخ أي هواء من الشريحة، إمالة الشريحة حسب الضرورة. عندما يتم طرد كل الهواء ، قم بإمالة الانزلاق نحو الخزان المتوسط غير المغطا ، وإزالة الغطاء لتجنب امتصاص الهواء مرة أخرى في القناة.
الآن الماصات حل الخلية عدة مرات للحد من تكتل، وإضافة 100 ميكرولتردات من الخلايا في قناة واحدة من الشريحة لمدة ساعتين حضانة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية في غياب ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة استبدال HEPES التي تحتوي على المتوسطة في كل شريحة مع بيكربونات كاملة تكمل المتوسطة كما أظهرت للتو. ثم ضع الخلايا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لزراعتها بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي نقل ملليلتر واحد من الدم المتبرع صحية حديثا حصلت على اثنين ملليلتر جولة أسفل البولي بروبلين microcentrifuge أنبوب. ثم الطرد المركزي العينة. إزالة البلازما ومعطف بافي التي تحتوي على افر.
ونقل بعناية 100 ميكرولترات من خلايا الدم الحمراء الرسوبية في أنبوب mircocentrifuge ملليلتر اثنين تحتوي على 100 ميكرولترات من HEPES كاملة تكمل المتوسطة. تسمية أنبوب 1:1 ونقل أربعة ميكرولترات من خلايا الدم الحمراء المخففة في أنبوب جديد ميليلتر microcentrifuge تحتوي على اثنين من ملليلتر من كامل HEPES تكمل المتوسطة. ثم تسمية هذا الأنبوب 4:2000 ووضع كل من تخفيف أنابيب عينة خلايا الدم الحمراء على الجليد.
لتسمية الضامة البريتونية استبدال الوسيط بيكربونات في كل شريحة قناة مع وسائل كاملة تكملها HEPES. ثم إمالة الشريحة للسماح 100 ميكرولترات من الضامة الماوس الموسومة الفلورية محددة من مصلحة أن تضاف قطرة الحكمة لفتح قناة 100 ميكرولتر من الشريحة. التبخر المتوسطة التي تتدفق في خزان المصب، وتحتضن الخلايا لمدة 20 دقيقة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية في غياب ثاني أكسيد الكربون.
في حين أن الخلايا الصفاقية يتم تصنيفها بلطف مزيج 4:2000 عينات خلايا الدم الحمراء ونقل 400 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب جديد ميليلتر microcentrifuge، في كتلة الألومنيوم ساخنة داخل غطاء تدفق لامينر لمدة خمس إلى ثماني دقائق. عندما تكون الخلايا قد ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية مزيج 0.4 ميكرولترات من غشاء البلازما الفلورسنت الأحمر المناسبة وصمة عار مع الخلايا. ثم ضع الخلايا مرة أخرى في كتلة الحرارة.
بعد خمس دقائق غسل الخلايا عن طريق إضافة 1.6 ملليلتر من HEPES الطازجة تكمل المتوسطة الكاملة والطرد المركزي. تدوير الأنبوب لتحديد بيليه خلايا الدم الحمراء. باستخدام واحد إلى 1.5 ملليلتر ماصة تلميح بعناية إزالة عظمى في مجلدين دون إزعاج بيليه ومزيج 2000 ميكرولترات من HEPES جديدة تكمل المتوسطة كاملة مع الخلايا.
الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 400 ميكروليتر من المتوسط. ثم تسمية أنبوب الدورة الشهرية ل STAIN غشاء البلازما. في نهاية 20 دقيقة بيليتونية خلية وضع العلامات الحضانة غسل الشريحة مع ملليلتر واحد من الهيب الطازجة كاملة تكمل المتوسطة.
لopsonize خلايا الدم الحمراء إضافة ميكرولتر واحد من الماوس IGG2B أحادية النسيلة المضادة للجسم المضاد CD235A الإنسان إلى أنبوب عينة PMS. بعد ثماني دقائق في 37 درجة مئوية مع خلط مرة واحدة في الدقيقة نقل 100 ميكرولترات من غشاء البلازما ملطخة IGG opsonized خلايا الدم الحمراء البشرية إلى الضامة البريتونية التي تحتوي على شريحة القناة. بمجرد إضافة خلايا الدم الحمراء البشرية جبل الشريحة على المجهر القرص الغزل confocal.
مع مرحلة الحاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية والبدء فورا التصوير الخلايا. الوقت الفاصل بين التصوير ثلاثي الأبعاد للضامة الفلورية الخضراء المقدمة مع خلايا الدم الحمراء الحمراء الفلورية البشرية تمكن من تصور الأحداث البلعومية الجسيمات واحد. على سبيل المثال، يمكن ملاحظة التقاط الماوس IGG opsonized خلية الدم الحمراء البشرية بواسطة الفيلولوبيوم الضامة.
وكذلك، والضغط على خلايا الدم الحمراء البشرية خلال تشكيل كأس البلعوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الضامة البريتونية المقيمة بالماوس ، والخلايا المسماة بالفلورية ، والجسيمات opsonized.
