We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

بيان الأخلاق: استخدمت عيون المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للإعلان على الانفتاح على البحوث الحيوانية: 1. تصنيع PLGA تحلل الأغشية مجهزة Micropockets <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إنشاء السقالات عصابة من قبل مجموعة من microstereolithography وتقنيات electrospinning 31. في جوهرها، عملية يمكن تلخيصها في 2 أجزاء (ط) إنشاء قوالب PEGDA بواسطة microstereolithography و (ii) electrospinning على نماذج لاستنساخ هيكل PEGDA الكامنة (في هذه الحالة حلقة microfabricated). يتم وصف هذه الخطوات اثنين بالتفصيل أدناه (الشكلان 1 و 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيع قوالب PEGDA بواسطة microstereolithography (microSL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال حلقات باستخدام نموذج 2 طبقة، مع الطبقة الأولى (L1) كونها قاعدة لهيكل والطبقة الثانية (L2) عرض 6 micropockets مع morphologi حدوة حصانوفاق في مجموعة من أحجام 300-500 ميكرون. وصفت تلفيق حلقات PEGDA مؤخرا من قبل هذه المجموعة 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلق L1 عن طريق رسم دائرة 1.2 سم سوداء باستخدام أي برنامج رسم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلق L2 في نفس الطريق ولكن تشمل 8 هياكل على شكل حدوة حصان أبيض 0.5 X 0.35 ملم. توزيع الأشكال حدوة حصان صغيرة بيضاء داخل هيكل دائرة سوداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ L1 و L2 في شكل JPEG. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قارورة زجاجية داكنة، مزيج البولي ايثيلين جلايكول diacrylate (PEGDA، المنغنيز = 250 جم / مول) مع 1٪ ث / ث Camphorquinone، وهو photoinitiator، على محرك مغناطيسي لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع شعاع الليزر من microstereolithography انشاء باستخدام الترتيب عدسة منظار وفوق المشروع فإنه على الكمبيوتر للبرمجة جهاز multimirror الرقمي (تمكين الأشعة فوق البنفسجية DMD كاتب كيت). ملاحظة: إن DMD يعكس الصورة (في هذه الحالة حلقة) على مرآة عبر 10 سم البعد البؤري عدسة أنبوب. الصورة ثم إخراج الفضة التميمتيد تعكس إلى قارورة تحتوي على البوليمر photocurable (PEGDA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وتنظيف بعناية البصريات من microstereolithography اقامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 300 ميكرولتر من الخليط PEGDA في بئر من 12 لوحة جيدا زراعة الأنسجة. تأكد من الآبار قبل المغلفة مع تفلون أو غيرها من المواد غير عصا لسهولة إزالة الهيكل بعد علاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على الليزر الأزرق (MBL-III 473 نانومتر، و 150 ميغاواط) وتحميل L1 في البرمجيات ALP3 الأساسية المثبتة مسبقا على الكمبيوتر. أشرق الطبقة الأولى لمدة 60 ثانية. ملاحظة: ALP3-الأساسي هو واجهة USB الذي يوفر وصلة بين الكمبيوتر والجهاز micromirror الرقمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى البئر 250 ميكرولتر أكثر من PEGDA، وتحميل L2 كما هو موضح أعلاه وأشرق L2 لمدة 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البوليمر غير مخمر وتغسل الحلبة مع الأيزوبروبانول O / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيع الأغشية القابلة للتحلل PLGA باستخدام electrospinning ملاحظة: استخدمت حلقات PEGDA كقالبق على الذي electrospun PLGA مع PLGA استنساخ تضاريس الأساسي كما هو نسج على مدى هذه القوالب. بعد الغزل، ومقشر ورقة من البوليمر PLGA من جامع. لم الغشاء PLGA النهائي لا يحتوي على حلقات PEGDA التي تركت تعلق على جامع المعدنية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع حلقات PEGDA على ورقة الألمنيوم مطلي (12 سم × 20 سم) لإنشاء مجمع electrospinning ساكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق حلقات باستخدام موصل الشريط الكربون. ملاحظة: هذه الحلقات مرة واحدة شكلت يمكن إعادة استخدامها كقوالب لelectrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل البوليمر للغزل. حل PLGA (50/50 DL-lactide (52٪ مول): glycolide (48٪ مول)، 44 كجم / مول) في ثنائي كلورو ميثان (DCM) بنسبة 20٪ ث / ث التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضجة O / N قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحقن 4 الأنسولين (كليلة العضوية، والإبر قطرها 0.8 سم الداخلية) على ضخ حقنة. ملاحظة: ضمنت أربعة المحاقن electrospinning أسرع من العمل مع حقنة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 2.5 مل من محلول PLGA في كل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin باستخدام 30 ميكرولتر / دقيقة معدل التدفق والفولتية تتراوح من 12 إلى 15 كيلو فولت. ترك المسافة بين الإبر وجامع 15 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة وأخيرا تقشر بعناية ورقة electrospun PLGA من جامع دعم حلقات PEGDA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع السقالات electrospun إلى 22 دوائر مم باستخدام حفرة لكمة دائرية وترك هيكل حلقة المتمركزة في المركز. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. التخزين على المدى الطويل PLGA Microfabricated الأغشية ملاحظة: تم تلفيق حلقات PLGA وتعقيمها قبل شركات خارجية معتمدة. تم المشع في عينات مجموعة جرعة الخارجي من 25-40 كيلو جراى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الغشاء في وعاء صغير (طبق بتري البلاستيك) ووضعه داخل كيس الصف الطبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ورق الترشيح لخلق مرشح أكياس صغيرة للالمجففات. Tس تهيئة الحقائب، وأضعاف ورقة الترشيح (125 مم) وقطع نصف دائرة مما أدى إلى النصف. ثم ختم نهايات معا باستخدام الشريط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ثلاثة أكياس ورق الترشيح مع 1 غرام من البرتقال السيليكا والكوبالت (II) كلوريد، والنحاس (II) كبريتات، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أكياس من ثلاثة المجففة داخل كيس الصف الطبية جنبا إلى جنب مع غشاء electrospun. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حقيبة والمتاحة تجاريا ستة بقعة بطاقة مؤشر الرطوبة للكشف عن أي تراكم الرطوبة خلال فترة التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فراغ آلة ختم الحرارة إلى فراغ وختم الحقيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرسال الأغشية حلقة إلى شركة خارجية لγ-التشعيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر γ-المشع الأغشية PLGA في مجموعة واسعة من درجات الحرارة من -20 درجة مئوية إلى +37 درجة مئوية في بيئة رطبة داخل حاضنة تحتوي على 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين آخر، دراسة مؤشر الرطوبة للتأكد من أن مستوى الرطوبة تحت 30٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uحد ذاته المجهر الإلكتروني (SEM) لتقييم سلامة الألياف. </li></ol> 3. عزل الحوفي إإكسبلنتس تم عزل الأرانب إإكسبلنتس الحوفي من عيون الأرانب (تم الحصول عليها من المزرعة حيث تربى الأرانب للاستهلاك). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير عيون الأرانب باستخدام محلول مطهر (3٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف العين من خلال إزالة أي نوع من الأنسجة الزائدة المحيطة القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المنطقة الحوفي (التي تم تحديدها كمنطقة دائرية رقيقة بين القرنية (شفافة) والصلبة (أبيض)) عن بقية القرنية باستخدام مجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقطعة إلى شرائح (حوالي 1.5 سنتيمترا) تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير قطاعات الحوفي في 1.5٪ محلول مطهر لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع شرائح الحوفي الى قطع صغيرة (100-500 ميكرون) بشفرة المشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين قطع صغيرة من الأنسجة في وسائل الإعلام ثقافة (DMEM + Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1)، و 10٪ مصل بقري جنيني، 1 U / مل القلمicillin، 100 ملغ / مل الستربتوميسين، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين، 10 نانوغرام / مل من EGF، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى استخدام (لا يزيد عن 60 دقيقة). </li></ol> 4. ثمرة من خلايا من الحوفي إإكسبلنتس وضعت الأرنب إإكسبلنتس الحوفي على كل من الأغشية والأغشية microfabricated نسج حديثا التي كانت وتخزينها لمدة 6 أشهر في -20 ° C-معبأة فراغ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف السقالات حلقة مع 15 ميكرولتر من الغراء الليفين (1: 1 خليط من الفيبرينوجين من البلازما البشرية بتركيز 18.75 ملغ / مل والثرومبين من البلازما البشرية عند تركيز 2.5 U / مل) باستخدام مكشطة خلية لتوزيع الليفين بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إإكسبلنتس الأنسجة مباشرة على micropockets PLGA باستخدام إبرة 25 G ومجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وسائط زراعة الخلايا بلطف شديد لتجنب فصل لل explants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام (وصفة وسائل الإعلام هو موضح في القسم 3.7) و kالآثار البيئية في الثقافة لمدة 2 أسابيع في في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح عينات مع 3.7٪ الفورمالديهايد مخزنة لمدة 10 دقيقة تليها 3 غسلات مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين بواسطة حضانة في 1 ميكروغرام / مل من 4 &#39;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) أو يوديد propidium (PI) لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني وتخزين العينات مغطاة بورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة العينات باستخدام مجهر مضان في موجات من 543 نانومتر و 800 نانومتر (ثنائي الفوتون). </li></ol> 5. إعداد ما يصل الأرنب الجرحى القرنية 3D نماذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف وتطهير عيون الأرانب كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجرح عيون الأرانب عن طريق غمر لهم في هيدروكسيد الأمونيوم 0.14٪ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينين في برنامج تلفزيوني وكشط بعيدا ظهارة بسكين مبضع الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وعزل زر القرنية صلبوية إزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القرنيات الجانب الظهارية أسفل علىكوب معقم وملء مع 0.5٪ أجار المحرز في DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة مرة واحدة، ووضع القرنيات الجانب الظهارية تصل، في أطباق بتري الصغيرة وإضافة وسائط الثقافة (وصفة المذكورة أعلاه) حتى منطقة الحوفي. ملاحظة: لا تغطي القرنية بأكملها. الحفاظ على الثقافة الجهاز في واجهة الهواء السائل. </li></ol> 6. عزل الحوفي إإكسبلنتس وإدراج حلقة السقالات في القرنية الأرنب 3D نماذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الأغشية حلقة مع 15 ميكرولتر من الغراء الليفين (1: 1 خليط من الفيبرينوجين بتركيز 18.75 ملغ / مل والثرومبين بتركيز 2.5 U / مل). استخدام مكشطة خلية كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إإكسبلنتس الأنسجة مباشرة على micropockets PLGA باستخدام إبرة 25 G ومجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حلقات مع لل explants الأنسجة على القرنيات الجرداء مع إإكسبلنتس مواجهة الظروف وعلى واجهة الهواء السائل. (هذه الشروط وقد وصفت سابقا 22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على نماذج الثقافة الجهاز ل4 أسابيع في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2. </li></ol> 7. تقييم القرنية تجديد وصيانة الخلايا الجذعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 أسابيع، وإصلاح القرنيات باستخدام 3.7٪ الفورمالديهايد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة القرنيات عن الأنسجة التقليدية لإنتاج 6 ميكرون أقسام البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمناعية، dewax المقاطع في الزيلين (المتوسطة 3min) وترطيب في الإيثانول بنسبة 100٪ (1 دقيقة)، 70٪ من الإيثانول (1 دقيقة)، والماء المقطر (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيم أقسام باستخدام قلم داكو لتحديد مناطق صغيرة وتجنب الاستخدام المفرط للأجسام المضادة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج المناطق المحددة مع 0.05٪ التربسين (100 ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة (37 درجة مئوية). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر من المصل 10٪ الماعز (حجب) لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات مع 100 ميكرولتر من الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة cytokeraالقصدير 3 (CK3) و 100 ميكرولتر من P63 في 1٪ الماعز المصل O / N في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع برنامج تلفزيوني وعلاج مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز الثانوي المضادة للماوس (1: 1 في 1،000٪ مصل الماعز) لمدة 1 ساعة عند RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من FITC-streptavidin (1: 100 في 1٪ مصل الماعز) لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة العينات مع دابي كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة العينات باستخدام مجهر مضان في موجات من 800 نانومتر (ثنائي الفوتون) و 488 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Ambati, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+avascularity+is+due+to+soluble+VEGF+receptor-1.">Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1.</a> Nature. 443, 993-997 (2006).</li><li>Reinach, P., Cap&#243;-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K., Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophthalmic+Diseases+And+Drug+DeliveryOphthalmology+Research.">Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research.</a> Ch 2, Ocular Transporters. 2, 17-46 (2008).</li><li>Kinoshita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+Human+Ocular+Surface+Epithelium.">Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).</li><li>Fatt, I., Bieber, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady-state+distribution+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+the+in+vivo+cornea:+I.+The+open+eye+in+air+and+the+closed+eye.">The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye.</a> Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).</li><li>Shortt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Limbal+Epithelial+Stem+Cell+Niche:+Novel+Imaging+Techniques+Permit+In+Vivo+Observation+and+Targeted+Biopsy+of+Limbal+Epithelial+Stem+Cells.">Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells.</a> STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).</li><li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).</li><li>Thoft, R. A., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X,+Y,+Z+hypothesis+of+corneal+epithelial+maintenance.">The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).</li><li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+epithelial+repair:+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation.">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).</li><li>Djalilian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Notch+signaling+during+corneal+epithelial+proliferation.">Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation.</a> Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).</li><li>Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem+Cells+of+the+Corneal+Epithelium.+Survey+of+Ophthalmology.">Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology.</a> Survey. 44, 415-425 (2000).</li><li>Dravida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+scaffold+for+culturing+limbal+stem+cells:+a+promising+alternative+for+clinical+transplantation.">A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).</li><li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem-Cell+Therapy+and+Long-Term+Corneal+Regeneration.">Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).</li><li>Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivated+corneal+epithelial+stem+cell+transplantation+in+ocular+surface+disorders.">Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders.</a> Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+cultivating+limbal+derived+corneal+epithelium+on+human+amniotic+membrane+for+clinical+transplantation.">Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation+for+the+management+of+corneal+epithelial+defects:+an+in+vivo+confocal+microscopic+study.">Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study.</a> British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Stromal+Integration+of+Multilayer+Amniotic+Membrane+Transplantation+in+Corneal+Ulcers.">In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers.</a> American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).</li><li>Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation.">Amniotic membrane transplantation.</a> British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).</li><li>Gicquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor+Variations+in+Amniotic+Membrane+Used+for+Ex+Vivo+Tissue+Constructs.">Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).</li><li>Connon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variation+in+transparency+of+amniotic+membrane+used+in+ocular+surface+regeneration.">The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).</li><li>Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Membrane+for+Ocular+Surface+Reconstruction:+Donor+Variations+and+the+Effect+of+Handling+on+TGF-&#946;+Content.">Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-&#946; Content.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).</li><li>Sitalakshmi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Cultivation+of+Corneal+Limbal+Epithelial+Cells+in+a+Thermoreversible+Polymer+(Mebiol+Gel)+and+Their+Transplantation+in+Rabbits:+An+Animal+Model.">Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).</li><li>Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microfabricated+artificial+limbus+with+micropockets+for+cell+delivery+to+the+cornea.">Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea.</a> Biofabrication. 5, (2013).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+poly(lactide-co-glycolide)+electrospun+scaffolds+to+deliver+cultured+epithelial+cells+to+the+cornea.">Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea.</a> Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants.">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).</li><li>Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+Hydrogels+for+Stem+Cell+Bioengineering+and+Tissue+Regeneration.">Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration.</a> Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+Materials+for+Controlling+Stem+Cell+Fate.">Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate.</a> Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).</li><li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing.">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies.">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li><li>Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

توضح هذه الدراسة (أ) تقنية لتصنيع الأغشية electrospun microfeatures تحتوي داخلها و (ب) كيفية تحضير هذه الأغشية للاستخدام السريري بواسطة التعبئة فراغ، وأشعة جاما ثم التخزين قبل استخدامها. في هذا التطبيق معينة قمنا بتطوير أغشية PLGA تحتوي micropockets التي تحاكي الميزات المادية للالحوفي محاريب الخلايا الجذعية. أهداف هذه الدراسة هي (ط) لوصف طرق لتزويد القراء بالمعرفة اللازمة لتصميم وتصنيع السقالات التي تحتوي على microfeatures للبحث في مساهمة محاريب الخلايا الجذعية لتجديد أنسجة و (ii) لتزويد القارئ بفهم أفضل كيفية تخزين السقالات electrospun لفترات طويلة من الزمن. من حيث التطبيق السريري، تخزين الأغشية الدائري هو من أهمية قصوى. في هذا العمل، تم دراسة تدهور حلقة على مدى فترة 6 أشهر. تدهوروالدافع الأغشية قبل التحلل ذلك ببساطة عن طريق الحفاظ على الأغشية وتوقف المجانية الرطوبة العملية. بلاكوود آخرون ذكرت أن من خلال تغيير نسبة لجيش التحرير الشعبى الصينى PGA، وتدهور الغشاء يغير 32. وأظهرت هذه الدراسة أيضا أن زيادة كمية PGA، فإن معدل تدهور الأغشية electrospun زيادة في الجسم الحي 22. هنا وقد تبين أنه مع فراغ التعبئة الأغشية مع بعض المجففة واضاءة عليها وتخزينها لهم في درجات حرارة منخفضة لمدة 6 أشهر، ليس هناك تغيير في نزاهة الألياف وتدهورها. في الوقت الحاضر، 6 أشهر هي بقدر ما درسنا مع هذه الأغشية تحتوي على micropockets لكن تخزين البيانات لتم الإبلاغ 1 سنة على الأغشية electrospun العادي في -20 ° C 22 و لدينا الآن بيانات غير منشورة لتخزينها في -20 ° C لمدة 2 سنة من دون أي علامات التدهور. وبالتالي لتخزين على المدى الطويل وسيكون موضع أوصى لتخزينها في -20 الجاف6؛ C ولكن من الممكن تخزينها في RT حتى في الهند لمدة 6 أشهر على الأقل (ربما أكثر من ذلك بكثير). إدراج مؤشر الرطوبة يعطي وسيلة سهلة للتحقق من أن العبوة أبقت الأغشية الجافة في هذه الحالة سيكون لائقا لهذا الغرض. وقد تبين نقل الخلايا من هذه الحلقات لنماذج 3D القرنية عند وضع إإكسبلنتس الحوفي داخل micropockets. وذكرت هذه المجموعة مؤخرا نقل الخلايا في المختبر على أرنب نموذج القرنية عن طريق وضع إإكسبلنتس على الأغشية PLGA العادي (الأغشية دون الهياكل حلقة) 24. باستخدام السقالات microfabricated نقل خلية الحالي قد اتخذت خطوة أبعد ويمكننا الآن تحديد موقع على وجه التحديد إإكسبلنتس الأنسجة داخل microfeatures. القدرة على وضع إإكسبلنتس مباشرة داخل محاريب أيضا يسمح للجراح لاستخدام الأغشية مباشرة في المسرح الجراحي تجنب الحاجة لغرف الأبحاث لتوسيع أولا الخلايا الجذعية الحوفي. على الرغم من أن هذه القطعة من العوقد تركز ك على تطوير أجهزة لمرض القرنية، ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا التصنيع الدقيق أيضا للأجهزة العديد من التطبيقات الأخرى النامية. والعمل المستقبلي استكشاف تصنيع التركيبات لتجديد الأنسجة الأخرى مثل الجلد والعظام. في حين تصميم وتصنيع الأولي للPEGDA المجهرية يمكن أن يكون مضيعة للوقت، مرة واحدة ملفقة الهياكل يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة دون تدهور. ولذلك، فإن تلفيق لاحقة من الأغشية القابلة للتحلل PLGA microstructured بواسطة electrospinning يمكن أن يؤديها بنفس المعدل لإنتاج العادي (&#39;غير منظم&#39;) الأغشية التالية تجميع المجمع. على الرغم من أن في هذا العمل استخدمنا microstereolithography لافتعال قوالب وأساليب أخرى مثل تصنيع 3D الطباعة أو حقن صب يمكن أن تستخدم أيضا. وفقا لذلك، يمكن إجراء القالب الكامنة من البوليمرات أو المعادن الأخرى بدلا من PEGDA. ومثل هذه التقنية متعددة جدا، ويمكن أن تتكيف بسهولة الباحثين طريقة لتتناسب مع احتياجات والمرافق الخاصة بها. وmicrostereolithography في المنزل انشاء المستخدمة في هذه الدراسة لن تسمح إعداد بنيات مع ميزات تحت 30μm. هذا ليس وجود قيود لتطبيق القرنية وصفها هنا ولكن يمكن أن يكون حاسما في تصميم نماذج أخرى. في هذه الحالة تقنيات أخرى مثل 2 الفوتون البلمرة (2PP) يمكن أن تكون ذات فائدة إلا أن تقنية electrospinning قد لا تسمح للاستنساخ الهياكل على مقياس الفرعي ميكرون (وهذا ما يجري حاليا دراستها من قبل مجموعتنا). الخطوات الحاسمة في إطار عملية تصنيع هي (ط) تجنب overcuring من القوالب PEGDA التي يمكن التحكم فيها عن طريق ضبط الوقت وكميات photoinitiator. (ب) السيطرة على الأوضاع electrospinning مثل درجة الحرارة والرطوبة. (ج) تخزين مناسب electrospuالأغشية ن حلقة باستخدام فراغ التعبئة والمجففات. وباختصار، من خلال وضع إإكسبلنتس الأنسجة الحوفي داخل microfeatures الغشاء أظهرنا ثمرة خلية من إإكسبلنتس على المناطق المتخصصة، ونقل الخلايا إلى أرنب جرح القرنية وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري لاحقة من القرنية. كما تم درس تدهور الأغشية المخزنة في درجات حرارة مختلفة، ولقد تم تطوير بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تتيح تخزين على المدى الطويل من الأغشية، وهذا الأخير هو أساسي في تطوير أغشية للاستخدام السريري.

القرنية، واوعائي المركزية معظم الأنسجة الخارجية للعين، هو واحد من الأنسجة أهم المشاركين في الرؤية 1. هناك عدة أنواع من الخلايا التي تحافظ على وظيفة القرنية. الطبقة الخارجية العليا من القرنية تتكون من خلايا الظهارية التي يمكن أن تكون في حوالي 5-7 طبقات سماكة 2. هذه الطبقة تمنع الغزو البكتيري في القرنية 3 وتسمح بدخول الأكسجين 4. وقد أفيد أن الخلايا الجذعية تكمن ظهارة القرنية في محاريب أو أقبية (مع أحجام 120-150 ميكرون) في المنطقة الطرفية من القرنية المعروفة باسم حوف 5،6. كما تنقسم الخلايا الجذعية، وخلايا ابنة المعروف أيضا باسم خلايا تضخيم عابرة السفر من محاريب ويستمر انقسام الخلايا وتتحرك centripetally الداخل والناجمة صعودا في خلايا متباينة عضال في المنطقة القرنية المركزية 7،8. يتم محو هذه الخلايا بشكل روتيني بعيدا مع طرفة العين الإلكترونيةxposing الخلايا الجديدة تحت 9. بالإضافة إلى كونه موقع الخلايا الجذعية الظهارية، حوف أيضا يلعب دورا في الحفاظ على الملتحمة أوعية دموية بعيدا عن المنطقة القرنية 10. يمكن أن يكون سبب الأضرار التي لحقت حوف بواسطة الحروق الحرارية / الكيميائي والإشعاع والأمراض الوراثية أيضا 10. عندما يحدث هذا، هو كسر حاجز حوف أسفل السماح للخلايا الملتحمة للتحرك على القرنية، vascularizing المنطقة، مما تسبب الألم والعمى في بعض الحالات. ومن المعروف أن الشرط كما نقص الخلايا الجذعية الحوفي (LSCD) 10. وقد تم الإبلاغ عن ركائز طبيعية مختلفة ممكن ناقلات الخلايا الجذعية للمساعدة في تجديد القرنية. على سبيل المثال، تم استخدام الأغشية القائم على الكولاجين بواسطة درافيدا وآخرون 11 وراما وزملاء العمل 12 ذكرت استخدام الليفين في الدراسة 112 مرضى. في الوقت الحاضر ولكن الطريقة الأكثر شيوعا للعلاجهو استخدام الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري من بنك الأنسجة والثقافة الخلايا الظهارية الحوفي على سطحه 13،14. مرة واحدة وقد شكلت أحادي الطبقة، يتم لصقها الغشاء الذي يحيط بالجنين جانب خلية حتى على القرنية المتضررة، والتي لديها كل خلايا الملتحمة وندبا ازالتها جراحيا منه قبل ذلك زرع الخلايا 14. ويتحلل الغشاء الذي يحيط بالجنين في غضون أسابيع أو شهور تاركة الخلايا الظهارية التي تعلق على منطقة الجرداء لتجديد البشرة 15،16. وكان هذا الأسلوب ناجحا في استعادة الرؤية ولكن لا يزال هناك عدد قليل من القضايا العملية التي تقيد امتصاص على نطاق واسع سريريا. كما الغشاء الذي يحيط بالجنين والأنسجة البشرية التي يحتاج للخضوع لفحص الأنسجة باستخدام إجراءات مصرفية جيدة قبل استخدامها لزرع الخلايا في المرضى. هذا الفحص يقلل فقط من خطر انتقال الأمراض ولكن لا يمكن القضاء عليه تماما 17. وبالإضافة إلى ذلك كانت هناك تقارير من التباين في صerformance من الغشاء الذي يحيط بالجنين بسبب أمور الاختلاف 18،19 المانحة وطرق المعالجة المختلفة 19،20. إلى جانب خطر صغير من انتقال المرض هناك شرط المراكز الجراحية في الحصول على بنوك الأنسجة التي تتمتع بإدارة جيدة، وليس المتاحة للجميع. على الرغم من أن الغشاء الذي يحيط بالجنين ناجحا نسبيا، وهناك حاجة لتطوير البدائل الاصطناعية القابلة للتحلل الناقل خلية جديدة لعلاج مرض القرنية. ان ناقلات الاصطناعية التغلب على الحاجة إلى الإجراءات المصرفية، فضلا عن القضاء على خطر صغير من انتقال المرض وتقلبه بين الجهات المانحة. في هذا المعنى، وقد درست مواد مثل البولي ايثيلين جلايكول 21،22 و 23،24 PLGA. على إيجاد بديل اصطناعي لغشاء يحيط بالجنين البشري هناك أيضا إمكانية لتصميم فيه ميزات مرغوبة للمساعدة نأمل بقاء الخلايا المستزرعة. والمؤتمر الوطني العراقيlusion من microfeatures داخل أجهزة بيولوجية لمراقبة معينة من سلوك الخلية هو المجال الناشئ للاهتمام. وأفادت العديد من المؤلفين العمل نحو تطوير خلايا جذعية مصطنعة الكوات 25-30. وقد ذكرت هذه المجموعة مؤخرا إنشاء PEGDA-biofunctionalized فبرونيكتين حوف الاصطناعي microfabricated لإيصال الخلايا الظهارية الحوفي 22 و منهجية لتصنيع الأغشية القابلة للتحلل electrospun تحتوي على جيوب microfabricated لدعم الخلايا الظهارية الحوفي 31. الهدف من هذا العمل هو تطوير تقنية التصنيع الجديدة لتطوير الأجهزة التي تحتوي على مادة بيولوجية microfeatures التي تحاكي إلى حد ما في microenvironments فيها الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم. قمنا بتطوير الأسلوب الذي يجمع بين microstereolithography وelectrospinning التي تسمح للتصنيع الأغشية microstructured القابلة للتحلل التي تظهر العظمى!ر إمكانات التطبيقات تجديد الأنسجة. من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من تم تطبيق هذه التقنية في هذا العمل إلى تلفيق من حلقات عن تجديد القرنية، والتكنولوجيا يمكن تطبيقها على تصنيع أجهزة لتجديد مجموعة واسعة من الأنسجة الطلائية، مثل الجلد، عن طريق الفم الظهارة المخاطية والأمعاء والجهاز التنفسي، والمثانة. على وجه التحديد، في هذه الدراسة قمنا بتطوير غشاء القابلة للتحلل الاصطناعية التي تعمل بطريقة مماثلة لالغشاء الذي يحيط بالجنين لتقديم الخلايا القرنية. يحتوي هذا الغشاء micropockets حوالي 300 ميكرون (أكبر من الخبايا الحوفي من Pallisades من فوغت (حوالي 150 ميكرون)). أخيرا، قمنا بتأسيس بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تسمح هذه الأغشية ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أكثر من 6 أشهر دون أن تظهر أي علامات على انهيار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

مشاكل القرنية تؤثر على الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم خفض نوعية حياتهم إلى حد كبير. يمكن أن يكون سبب مرض القرنية من الأمراض مثل انعدام القزحية أو متلازمة ستيفن جونسون، فضلا عن العوامل الخارجية مثل الحروق الكيميائية أو الإشعاع. العلاجات الحالية هي (ط) استخدام الطعوم القرنية و (ب) استخدام الخلايا الجذعية توسعت في المختبر وتسليمها في ناقلات (مثل الغشاء الذي يحيط بالجنين). هذه العلاجات الناجحة نسبيا ولكن للأسف أنها يمكن أن تفشل بعد 3-5 سنوات. هناك حاجة إلى تصميم وتصنيع الأجهزة الجديدة مادة بيولوجية القرنية قادرة على تقليد بالتفصيل البيئة الفسيولوجية حيث توجد الخلايا الجذعية في القرنية. تقع الخلايا الجذعية الحوفي في حوف (منطقة دائرية بين القرنية والصلبة) في قطاعات محددة تعرف باسم الحواجز من فوغت. في هذا العمل قمنا بتطوير تقنية المنصة الجديدة التي تجمع بين اثنين من تقنيات التصنيع المتطورة (microstereolithography وelectrospinnجي) لتصنيع أغشية القرنية التي تحاكي إلى حد ما حوف. الأغشية لدينا تحتوي على micropockets اصطناعية والتي تهدف إلى توفير حماية الخلايا مع مثل الحواجز من فوغت القيام به في العين.

تم تصنيع Electrospun microfabricated حلقات باستخدام مزيج من microstereolithography وelectrospinning (الشكلان 1 و 2). ملفقة حلقات PEGDA من أحجام مختلفة باستخدام microstereolithography (الشكل 3)؛ هذه التقنية تسمح للتصنيع الهياكل في ترتيب سم وإدراج المتزامن لmicrofeatures. في هذه الحالة، وخواتم من أقطار تتراوح 1،2-1،6 سم تحتوي على micropockets من 350-500 ميكرون ملفقة (الشكل 4). من حيث إنتاج والتعقيم والتعبئة والتغليف من المواد للاستخدام السريري في المستقبل تبين أن التعبئة في أكياس فراغ الصف الطبية تحسن كبير في القدرة على تحقيق التخزين على المدى الطويل من الأغشية PLGA (الشكل 5)؛ استخدام حقيبة الصف الطبية (PET / احباط / LDPE) مع سمك 0.12 مم سمح لنا لتحقيق حياة أطول الرف. وكان التحقيق هذا عن طريق إرسال membrتم تخزينها أنيس إلى المتعاونين لدينا في الهند والأغشية لمدة أشهر في -20 درجة مئوية، في RT وعند 37 درجة مئوية في ظروف رطبة عمدا (حاضنة الرطبة). الشكل 5 يظهر أن استخدام الظروف استفزازية عمدا من التخزين في 37 درجة مئوية تحت ظروف رطبة، كانت الأغشية مستقرة فقط لحوالي 1 شهر تحت ظروف غير فراغ معبأة، ولكن حققت تخزين 3 أشهر تحت فراغ معبأة الشروط (الشكل 5 والجدول 1). يوضح الجدول 1 التحسن في ظروف التخزين الذي يمكن تحقيقه حتى في ظل ظروف المحددة لأن تفضي إلى امتصاص الماء والألياف تورم إذا كان أحد يدفع الانتباه إلى اختيار حقيبة المستخدمة. حلقات دعمت ثمرة خلية من إإكسبلنتس الحوفي في ظروف مختلفة (ط) حلقات الطازجة و (ب) حلقات تخزينها لمدة 6 أشهر (الشكل 6). وقد تحقق نقل الخلية بعد 4 أسابيع عند رر<html> التفوق الأغشية PLGA على نماذج 3D الجرحى. نمت خلايا الخروج من إإكسبلنتس الأنسجة وضعت على الأغشية خلق ظهارة جديدة على القرنيات الجرداء سابقا (الشكل 7). واستمرت الإيجابية (القرنيات دون أي علاج) والضوابط السلبية (القرنيات الجرحى) أيضا في الثقافة لنفس الفترات الزمنية. وأكدت الضوابط السلبية عدم وجود تشكيل ظهارة جديدة في غياب أي خلايا المضافة. أظهرت أن خلايا مناعية نابتا من لل explants كانت الخلايا الظهارية القرنية لأنها كانت إيجابية للالقرنية التمايز علامة CK3 (الشكل 7E). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> ضبط الشكل 1. تخطيطي لmicrostereolithography تصل لإنشاء حلقات PEGDA. <html> her.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. تخطيطي لعملية electrospinning باستخدام حلقات PEGDA microfabricated بمثابة القوالب. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. (A) يظهر مثال على (ورقة الألمنيوم مطلي مع حلقات PEGDA) جامع ثابت للغزل الأغشية PLGA microfabricated. (B) و (E) تظهر الحصير electrospun مختلفة يجري مقشر من جامعي ثابتة. (C) المعارض قوالب PEGDA من مختلف الأحجام تسليط الضوء على براعة استخدام microstereolithography لتصنيع السطح السفلي (D) يظهر PLGA microfabricated المتماثلة./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4. SEM صورة من حلقة PEGDA مع microfeature حدوة حصان (A). تضخم عالية SEM صورة لجيب microfabricated (B). المرحلة تباين الصورة من حلقة PLGA مع microfeature حدوة حصان (C). عالية التكبير صورة المرحلة النقيض من جيب microfabricated (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /><bص /&gt; الشكل 5. تأثير درجة الحرارة والوقت على تخزين فراغ وغير فراغ معبأة PLGA (50/50) الأغشية (44 كجم / مول) مع حلقات ملفقة الصغيرة أكثر من 6 أشهر. وسجل سلامة الأغشية والألياف سليمة تماما (+ + +)، وبعض الألياف تورم (+ +)، دمج الألياف (+) أو أي ألياف سليمة (-). الصور SEM وثلاثة المجففات (السيليكا البرتقالي والكوبالت (II) كلوريد، والنحاس (II) كبريتات) لا تظهر أي تغيرات في سلامة الألياف أو الرطوبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. الصور الإسفار تظهر ثمرة كرا من إإكسبلنتس الحوفي على الطازجة حلقات PLGA القابلة للتحلل (A، B) وعلى حلقات بعد 6 أشهر التخزين في -20° C (C، D). الصور (A) و (B) تتوافق مع الخلايا ملطخة دابي (الأزرق) ويوديد propidium (الحمراء) على التوالي. صورة ب هي وجهة نظر متعامد من متحد البؤر Z-كومة من ازدراع ضعت على جيب microfabricated. الصور (C) و (D) تظهر تلطيخ إيجابي لP63 (الخضراء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. (A) يظهر أرنب الجرحى نموذج القرنية مع حلقة سقالة والأنسجة إإكسبلنتس تقع على منصة الاعدام الذي كان سابقا المغلفة مع الغراء الليفين (B) و (C) والضوابط الإيجابية والسلبية؛ السيطرة الإيجابية هي حاخام جديدة<html> ر القرنية والسيطرة السلبية على القرنية حيث تمت إزالة الظهارة عمدا (كانت سيطرة سلبية أيضا تربيتها لمدة 4 أسابيع) (D) هي H &amp; E صورة الأنسجة المهندسة القرنية بعد 4 أسابيع في الثقافة. يوضح الشكل ظهارة متعددة الطبقات الجديدة التي شكلتها خلايا الخروج من إإكسبلنتس وضعت على المنافذ (E) هو صورة مناعية تظهر ثمرة خلية من ازدراع الحوفي؛ هي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق) والخلايا يظهر تلطيخ إيجابي لcytokeratin 3، علامة التمايز القرنية (الخضراء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td><html> س؛ &quot;&gt; سلامة الألياف لأغشية المخزنة عند 37 درجة مئوية رطبة </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> اليوم 0 </td><td style="width:64px;"> 1 شهر </td><td style="width:64px;"> شهر 2 </td><td style="width:64px;"> شهر 3 </td><td style="width:64px;"> شهر 4 </td><td style="width:64px;"> شهر 5 </td><td style="width:64px;"> شهر 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> غير فراغ معبأة </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> فراغ فضاء (حقيبة A) (PE، PA المركب) السماكة: 0.14 ملم </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px؛ &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> فراغ فضاء (حقيبة B) (PET / احباط / LDPE) السماكة: 0.75 مم </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> الجدول 1. تأثير الفراغ وتخزين أكياس مختلفة على سلامة PLGA (50/50) الأغشية فحص (44 كجم / مول) أكثر من 6 أشهر من التخزين. وسجل سلامة الأغشية والألياف سليمة بالكامل (+ + +)، وبعض الألياف تورم (+ +)، دمج الألياف (+) أو أي ألياف سليمة (-).

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration at JoVE.com

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

نفيدكم تقنية لتصنيع micropockets داخل الأغشية electrospun للدراسة سلوك الخلية. على وجه التحديد، ونحن تصف مزيج من microstereolithography وelectrospinning لإنتاج PLGA (بولي (lactide-CO-glycolide)) أجهزة بيولوجية القرنية مجهزة microfeatures.

مزيج من Microstereolithography وElectrospinning لإنتاج أغشية مجهزة الكوات لتجديد القرنية

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  University of Sheffield.  نفيدكم تقنية لتصنيع micropockets داخل الأغشية electrospun للدراسة سلوك الخلية. على وجه التحديد، ونحن تصف مزيج من microstereolithography وelectrospinning لإنتاج PLGA (بولي (lactide-CO-glycolide)) أجهزة بيولوجية القرنية مجهزة microfeatures. 

Video: Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Electrospinning أساسيات : الحل الأمثل ومعلمات جهاز

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

استخدام الخلايا الجذعية البشرية ارتشاح لتجديد العظام

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

إعداد الأغشية ضوء استجابة من قبل التطعيم سطح الجامع وعملية Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج جدار مجرى الهواء

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

دمج ايون الاستقطاب التركيز بين جنبا إلى جنب التبادل الأيوني الأغشية لمنع الانتشار من منطقة الاستقطاب

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

توليف الهلاميات المائية مع خصائص المضادة للحشف والأغشية لتنقية المياه

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...