We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

הצהרת אתיקה: העיניים שימשו במחקר זה נעשו שימוש בבהתאם להצהרה על פתיחות למחקר בבעלי חיים: 1 ייצור של ממברנות מתכלים PLGA מצויד בMicropockets <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי הטבעת נוצרו על ידי שילוב של טכניקות microstereolithography וelectrospinning 31 ב. בעיקרו של דבר, ניתן לסכם את התהליך ב2 חלקי יצירה (i) של תבניות PEGDA ידי microstereolithography ו( ii) electrospinning על התבניות לרבייה של מבנה PEGDA בסיס (במקרה זה טבעת microfabricated). שני צעדים אלה מתוארים בפירוט בהמשך (איורים 1 ו -2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור של תבניות PEGDA ידי microstereolithography (microSL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק טבעות תוך שימוש במודל 2 שכבה, עם השכבה הראשונה (L1) להיות הבסיס של המבנה והשכבה השנייה (L2) מציגה 6 micropockets עם Morphologi הפרסהes במגוון של גדלים 300-500 מיקרומטר. הייצור של טבעות PEGDA תואר לאחרונה על ידי קבוצה זו 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור L1 ידי ציור עיגול 1.2 סנטימטר שחור באמצעות כל תוכנת ציור מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור L2 באותה הדרך, אבל כולל 8 מבנים בצורת פרסה 0.5 x 0.35 מ&quot;מ לבן. להפיץ צורות פרסה הלבנות הקטנות בתוך המבנה העיגול השחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת L1 וL2 בפורמט JPEG. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבקבוקון זכוכית כהה, לערבב diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA, Mn = 250 גרם / mol) עם 1% w / w Camphorquinone, photoinitiator, על בוחש מגנטי עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את קרן הלייזר של microstereolithography באמצעות הסדר עדשה טלסקופית הגדרה ולאחר מכן להקרין את זה על גבי מכשיר מחשב לתכנות דיגיטלי multimirror (ערכת Starter-אפשר UV DMD). הערה: DMD משקף את התמונה (במקרה זה טבעת) על גבי מראה באמצעות עדשת צינור אורך מוקד 10 סנטימטר. התמונה מופנה לאחר מכן על ידי הכסף-CoAטד לשקף לתוך בקבוקון המכיל פולימר photocurable (PEGDA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ולנקות בזהירות אופטיקה של microstereolithography להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 300 μl של תערובת PEGDA לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 12 גם. ודא הבארות מראש מצופות בטפלון או חומר שאינו מקל אחר להסרת קלה של המבנה לאחר הריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר הכחול (MBL-III 473 ננומטר; 150 mW) ולהעלות L1 לתוך תוכנת ALP3 הבסיסית שהותקנו בעבר במחשב. מכשיר את השכבה הראשונה ל60 שניות. הערה: ALP3 הבסיסי הוא ממשק USB המספק את הקשר בין המחשב ומכשיר micromirror הדיגיטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לטוב 250 μl יותר של PEGDA, להעלות L2 כפי שתואר לעיל ולהקרין L2 ל60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפולימר הדפוק ולשטוף את הטבעת עם O isopropanol / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצאה של מתכלה PLGA קרומים באמצעות electrospinning הערה: טבעות PEGDA שמשו כתבניתנגמר שPLGA היה electrospun עם PLGA לשחזר את הטופוגרפיה הבסיסית כפי שהוא הסתובב על תבניות אלו. אחרי ספינינג, הגיליון של פולימר PLGA התקלף מהאספן. קרום PLGA הסופי לא יכיל את טבעות PEGDA שנותרו מחובר לאספן המתכתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ טבעות PEGDA על גיליון אלומיניום electroplated (12 סנטימטר x 20 סנטימטר) ליצירת אספן electrospinning סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הטבעות באמצעות קלטת פחמן מוליך. הערה: טבעות אלה נוצרו פעם אחת יכול להיות שימוש חוזר כתבניות לelectrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הפולימר לטווייה. לפזר PLGA (50/50 DL-lactide (52% mol): glycolide (48% mol), 44 קילוגרם / mol) בdichloromethane (DCM) בשעה 20% w / w ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> O מערבבים / N לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים מקום 4 אינסולין (להקהות מחטים הסתיימו, 0.8 סנטימטר פנימי קוטר) על משאבת מזרק. הערה: ארבעה מזרקים הבטיחו electrospinning המהיר יותר מאשר עבודה עם מזרק יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון 2.5 מ&quot;ל של תמיסת PLGA בכל מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 30 μl / דקת קצב זרימת Electrospin ומתחים הנעים 12-15 ק. השאר מרחק בין המחטים והאספן של 15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin עבור שעה 1 ו30 דקות ולבסוף לקלף בזהירות את סדין electrospun PLGA מהאספן תומך טבעות PEGDA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את פיגומי electrospun ל22 חוגי קוטר מ&quot;מ באמצעות אגרוף חור עגול ומשאירים את מבנה הטבעת ממוקם במרכז. </li></ol></li></ol></li></ol> חפצים .2 לטווח ארוך של ממברנות microfabricated PLGA הערה: טבעות PLGA היו מפוברקות ומעוקרות על ידי חברות חיצוניות מוכרים; דגימות היו מוקרנים בטווח מינונים חיצוני של 25-40 KGy. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקרום במכל קטן (צלחת פטרי פלסטיק) ומניח אותו בתוך שקית כיתה רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר מסנן כדי ליצור מסנן שקיות קטנות לdesiccants. To ליצור השקיות, לקפל את נייר הסינון (בקוטר מ&quot;מ 125) ולחתוך בחצי עיגול וכתוצאה מהמחצית; אז לאטום את הקצוות יחד באמצעות קלטת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שלוש שקיות נייר סינון עם 1 גרם של תפוז סיליקה, כלוריד קובלט (II), ונחושת גופרתית (II), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שלוש שקיות של יבוש בתוך התיק הרפואי הכיתה יחד עם קרום electrospun. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לשקית כרטיס מחוון לחות שש נקודה זמינה מסחרי כדי לאתר את כל הצטברות לחות בתקופת האחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכונת חותם חום ואקום ואקום ולאטום את התיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח קרומי טבעת לחברה חיצונית לγ-הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות γ-מוקרן קרומי PLGA במגוון רחב של טמפרטורות של C ° -20 ל37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה בתוך חממה המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון הודעה, לבחון את מחוון לחות כדי לוודא שרמת לחות היא מתחת 30%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) כדי להעריך את היושרה של סיבים. </li></ol> .3 בידוד של Explants limbal explants limbal ארנב היו מבודד מעיני ארנב (המתקבלות מחווה שבה ארנבים הם התרבו לצריכה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את עיני הארנב באמצעות תמיסת חיטוי (3%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את העיניים על ידי הסרת כל רקמה עודפת המקיפה את הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את אזור limbal (זוהה כאזור עגול דק שבין הקרנית (השקופה) ולובן העין (לבן)) משאר הקרנית באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך לפלחים (כ -1.5 סנטימטר) תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את מגזרי limbal בתמיסת חיטוי 1.5% דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את פלחי limbal לחתיכות קטנות (100-500 מיקרומטר) עם להב סכין מנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את החתיכות הקטנות של רקמה בתקשורת והתרבות (DMEM + Glutamax: F12 Ham&#39;s (1: 1), 10% בסרום שור עוברי, 1 U / עט מ&quot;לicillin, 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל amphotericin, 10 / מ&quot;ל ng של EGF, ו5 מיקרוגרם / מ&quot;ל של אינסולין) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 עד לשימוש (לא יותר מ60 דקות). </li></ol> .4 תולדה של תאים מExplants limbal explants limbal ארנב הונח על שני קרומים טריים הסתובבו microfabricated והקרומים שהיו ומאוחסן במשך 6 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס באריזת ואקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל פיגומי טבעת עם 15 μl של דבק הפיברין (1: תערובת 1 של פיברינוגן מפלזמה אנושית בריכוז של 18.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ותרומבין מפלזמה אנושית בריכוז של 2.5 U / ml) באמצעות מגרד תא להפצת הפיברין באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את explants הרקמה ישירות על micropockets PLGA באמצעות 25 מחט G ומיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה תרבית תאים מאוד בעדינות כדי למנוע ניתוק explants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת כל 3 ימים (מתכון תקשורת מתואר בסעיף 3.7) וkיפ בתרבות עבור 2 שבועות בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הדגימות עם .3.7% פורמלדהיד שנאגרו עבור 10 דקות ואחריו 3 שוטף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain על ידי דגירה ב1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או יודיד propidium (PI) ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב PBS ולאחסן הדגימות מכוסות בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל של 543 ננומטר ו800 ננומטר (שני פוטונים). </li></ol> .5 מודלי הקרנית 3D ארנב פצוע קמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ולחטא את עיני הארנב כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פצע עיני ארנב על ידי שיקוע שלהם ב0.14% אמוניום הידרוקסיד למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העיניים בPBS ולגרד ממנו את האפיתל עם סכין sclerotome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולבודד את כפתור הקרנית-scleral הסרת כל רקמה שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרניות הצד אפיתל מטה אלכוס וסטרילי למלא עם אגר 0.5% תוצרת DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרה, לשים בצד אפיתל הקרני עד, בצלחות פטרי קטנות ולהוסיף מדיה תרבות (מתכון שתואר לעיל) עד ​​לאזור limbal. הערה: אין לכסות את כל הקרנית; לשמור על תרבות האיבר בממשק האוויר הנוזלי. </li></ol> .6 בידוד של Explants limbal והכללה של טבעת פיגומים במודלי הקרנית 3D ארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל קרומי טבעת עם 15 μl של דבק הפיברין (1: 1 תערובת של פיברינוגן בריכוז של 18.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ותרומבין בריכוז של 2.5 U / ml) .Use מגרד תא כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את explants הרקמה ישירות על micropockets PLGA באמצעות 25 מחט G ומיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטבעות עם explants הרקמה על הקרניות הערומות עם explants פונה כלפי מעלה ובתנאי ממשק אוויר נוזלי. (תנאים אלה תוארו בעבר 22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על המודלים תרבות איבר ל4 שבועות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לשנות את התקשורת בכל 2 ימים. </li></ol> .7 הערכה של קרנית התחדשות וגזע תחזוקה נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שבועות, לתקן את הקרניות באמצעות פורמלדהיד .3.7%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הקרניות להיסטולוגיה הקונבנציונלית כדי לייצר 6 מיקרומטר חלקי פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunocytochemistry, dewax הסעיפים בקסילן (3min) ורעננותם ב100% אתנול (1 דקות), 70% אתנול (1 דקות), ומים מזוקקים (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את החלקים באמצעות עט Dako כדי לתחום אזורים קטנים ולהימנע משימוש מופרז בנוגדן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את האזורים שמסומן עם טריפסין 0.05% (100 μl) עבור 20 דקות (37 מעלות צלזיוס). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות עם PBS ולהוסיף סרום של 10% עזים (חסימה) 100 μl עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם של cytokera נוגדן חד שבטי עכבר 100 μlפח 3 (CK3) ושל p63 100 μl בO הסרום של 1% עזים / N ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ולטפל עם נוגדן biotinylated המשני אנטי עכבר 100 μl (1: 1,000 ב1% עזים בסרום) לשעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של FITC-streptavidin 100 μl (1: 100 ב1% עזים בסרום) ל30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות עם DAPI כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל של 800 ננומטר (שני פוטונים) ו488 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Ambati, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+avascularity+is+due+to+soluble+VEGF+receptor-1.">Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1.</a> Nature. 443, 993-997 (2006).</li><li>Reinach, P., Cap&#243;-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K., Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ophthalmic+Diseases+And+Drug+DeliveryOphthalmology+Research.">Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research.</a> Ch 2, Ocular Transporters. 2, 17-46 (2008).</li><li>Kinoshita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+Human+Ocular+Surface+Epithelium.">Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).</li><li>Fatt, I., Bieber, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady-state+distribution+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+the+in+vivo+cornea:+I.+The+open+eye+in+air+and+the+closed+eye.">The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye.</a> Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).</li><li>Shortt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Limbal+Epithelial+Stem+Cell+Niche:+Novel+Imaging+Techniques+Permit+In+Vivo+Observation+and+Targeted+Biopsy+of+Limbal+Epithelial+Stem+Cells.">Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells.</a> STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).</li><li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+epithelial+crypts:+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche.">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).</li><li>Thoft, R. A., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X,+Y,+Z+hypothesis+of+corneal+epithelial+maintenance.">The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).</li><li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+epithelial+repair:+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation.">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).</li><li>Djalilian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Notch+signaling+during+corneal+epithelial+proliferation.">Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation.</a> Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).</li><li>Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem+Cells+of+the+Corneal+Epithelium.+Survey+of+Ophthalmology.">Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology.</a> Survey. 44, 415-425 (2000).</li><li>Dravida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+scaffold+for+culturing+limbal+stem+cells:+a+promising+alternative+for+clinical+transplantation.">A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).</li><li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+Stem-Cell+Therapy+and+Long-Term+Corneal+Regeneration.">Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).</li><li>Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivated+corneal+epithelial+stem+cell+transplantation+in+ocular+surface+disorders.">Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders.</a> Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+of+cultivating+limbal+derived+corneal+epithelium+on+human+amniotic+membrane+for+clinical+transplantation.">Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation+for+the+management+of+corneal+epithelial+defects:+an+in+vivo+confocal+microscopic+study.">Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study.</a> British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).</li><li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Stromal+Integration+of+Multilayer+Amniotic+Membrane+Transplantation+in+Corneal+Ulcers.">In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers.</a> American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).</li><li>Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+transplantation.">Amniotic membrane transplantation.</a> British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).</li><li>Gicquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Growth+Factor+Variations+in+Amniotic+Membrane+Used+for+Ex+Vivo+Tissue+Constructs.">Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).</li><li>Connon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variation+in+transparency+of+amniotic+membrane+used+in+ocular+surface+regeneration.">The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).</li><li>Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Membrane+for+Ocular+Surface+Reconstruction:+Donor+Variations+and+the+Effect+of+Handling+on+TGF-&#946;+Content.">Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-&#946; Content.</a> Investigative Ophthalmolog., &amp; Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).</li><li>Sitalakshmi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Cultivation+of+Corneal+Limbal+Epithelial+Cells+in+a+Thermoreversible+Polymer+(Mebiol+Gel)+and+Their+Transplantation+in+Rabbits:+An+Animal+Model.">Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).</li><li>Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microfabricated+artificial+limbus+with+micropockets+for+cell+delivery+to+the+cornea.">Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea.</a> Biofabrication. 5, (2013).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+poly(lactide-co-glycolide)+electrospun+scaffolds+to+deliver+cultured+epithelial+cells+to+the+cornea.">Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea.</a> Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants.">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).</li><li>Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+Hydrogels+for+Stem+Cell+Bioengineering+and+Tissue+Regeneration.">Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration.</a> Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+Materials+for+Controlling+Stem+Cell+Fate.">Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate.</a> Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).</li><li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing.">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies.">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li><li>Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מחקר זה מתאר (א) טכניקה לייצור של ממברנות electrospun מכיל microfeatures בתוכם וכן (ב) כיצד להכין קרומים כאלה לשימוש קליני על ידי אריזת ואקום, קרינת גמא ולאחר מכן אחסון לפני שימוש. ביישום מסוים זה פיתחנו ממברנות PLGA מכילות micropockets המחקה את התכונות הפיזיות של הנישות של תאי גזע limbal. מטרותיו של מחקר זה הן (i) כדי לתאר את השיטות לספק לקוראים עם הידע הדרוש כדי לתכנן ולייצר פיגומים המכילים microfeatures לחקר התרומה של נישות של תאי גזע להתחדשות רקמות וכן (ii) כדי לספק את הקורא עם הבנה טובה יותר כיצד לאחסן פיגומי electrospun לפרקי זמן ארוכים. במונחים של יישום קליני, האחסון של קרומי הטבעת הוא בעלת חשיבות עליונה. בעבודה זו, את ההשפלה של הטבעת נחקרה על פני תקופה של 6 חודשים. השפלה שלקרומים הוא מונעים על ידי הידרוליזה כך פשוט על ידי שמירה על ממברנות לחות ללא התהליך נעצר. בלקווד et al. דיווח כי על ידי שינוי היחס של PLA לPGA, השפלה של הקרום משתנה 32. מחקר זה הראה גם כי על ידי הגדלת הכמות של PGA, קצב הפירוק של קרומי electrospun מוגבר in vivo 22. כאן זה כבר הראה כי עם ואקום אריזת הקרומים יחד עם כמה יבוש והקרנתם ואחסונם בטמפרטורות נמוכות למשך 6 חודשים, אין שינוי בשלמות הסיבים והשפלה. נכון לעכשיו, 6 חודשים הוא ככל שלמדנו עם הקרומים האלה מכילים micropockets אבל נתונים אחסון לשנה 1 דווחה על קרומי electrospun רגילים ב -20 מעלות צלזיוס 22 ועכשיו יש לנו נתונים שלא פורסמו לאחסון שלהם ב -20 ° C 2 שנים ללא כל סימנים של השפלה. כך עבור אחסון לטווח ארוך זה יהיה מומלץ לאחסן אותם יבש ב-206; C אבל זה אפשרי לאחסן אותם ב RT גם בהודו במשך לפחות 6 חודשים (ואולי עוד הרבה זמן). הכללתו של מדד לחות נותנת אמצעי קל של בדיקת שהאריזה שמרה קרומים יבשים ובמקרה כזה הם יהיו כשירים לצורך. העברה של תאים מטבעות אלה לדגמי קרנית 3D הוצגה בעת ביצוע explants limbal בתוך micropockets. קבוצה זו דיווחה לאחרונה על העברה של תאים על במבחנה מודל קרנית ארנב על ידי הצבת explants על קרומי PLGA רגילים (ממברנות ללא מבני טבעת) 24. באמצעות העברת תא פיגומי microfabricated הנוכחית כבר נלקח צעד אחד קדימה כפי שאנו יכולים כעת באופן ספציפי לאתר explants רקמה בתוך microfeatures. היכולת להציב explants ישירות בתוך הנישות גם מאפשרת למנתח להשתמש בממברנות ישירות בתיאטרון כירורגית למנוע את הצורך של חדר נקי לראשון להרחיב את תאי גזע limbal. למרות שפיסת wor זהk כבר מתמקד בפיתוח התקנים לטיפול במחלת קרנית, טכנולוגית microfabrication זה יכול להיות מיושמת גם לפיתוח מכשירים ליישומים רבים אחרים. לעבוד בעתיד יהיה לחקור את הייצור של מבנים להתחדשות של רקמות אחרות כגון עור ועצמות. בעוד העיצוב והייצור ראשוני של microstructures PEGDA יכולים להיות זמן רב, פעם אחת מפוברק ניתן לעשות שימוש חוזר במבנים פעמים רבות ללא השפלה. לכן, הייצור הבא של ממברנות מתכלות PLGA microstructured ידי electrospinning יכול להתבצע בקצב דומה לייצור של ממברנות רגילים (&#39;בלתי מובנים&#39;) בעקבות ההרכבה של האספן. למרות בעבודה זו השתמשנו microstereolithography עבור בודה התבניות, שיטות ייצור אחרות כגון 3D-הדפסה או הזרקה יכולות לשמש גם. בהתאם לכך, העובש שבבסיס יכול להיות עשויים מפולימרים או מתכות אחרים במקום PEGDA. ככזה בטכניקה זו היא מאוד תכליתית וחוקרים יכולים בקלות להתאים את השיטה כדי להתאים לצרכימים שלהם ומתקנים. הגדרת microstereolithography הבית ב- שימשה במחקר זה לא יאפשר ההכנה של מבנים עם תכונות תחת 30μm; זו היא לא מגבלה עבור היישום קרני שתואר כאן, אבל זה יכול להיות מכריע בעיצוב של דגמים אחרים. שבטכניקות אחרות מקרה פילמור כגון 2 פוטון (2PP) יכול להיות עניין עם זאת טכניקת electrospinning יכולה שלא לאפשר הרבייה של מבנים בקנה המידה תת מיקרון (היום זה נחקר על ידי הקבוצה שלנו). שלבים קריטיים בתהליך הייצור הם (i) הימנעות overcuring של תבניות PEGDA אשר יכול להיות נשלטו על ידי התאמת זמן וכמויות של photoinitiator. (Ii) שליטה תנאי electrospinning כגון טמפרטורה ולחות. (Iii) אחסון כראוי electrospuקרומי טבעת n באמצעות ואקום ומוצרי החלב וdesiccants. לסיכום, על ידי הצבת explants רקמת limbal בתוך microfeatures של הקרום שהראינו תוצאה תא מexplants על תחומי נישה, העברת תאים על גבי קרנית נפצעה ארנב ומחדש epithelization הבא של הקרנית. השפלה של הקרומים המאוחסנים בטמפרטורות שונות גם נחקרה ופרוטוקול אריזה המאפשר אחסון לטווח הארוך של ממברנות פותח, האחרון להיות חיוני בפיתוח ממברנות לשימוש קליני.

הקרנית, רוב הרקמות החיצוניות המרכזיות avascular של העין, היא אחת הרקמות החשובות ביותר מעורבות בחזון 1. ישנם מספר סוגים של תאים השומרים על התפקוד של הקרנית. השכבה החיצונית ביותר העליונה של הקרנית מורכבת מתאי האפיתל שיכול להיות על 5-7 שכבות בעובי 2. שכבה זו מונעת פלישת חיידקים לתוך הקרנית 3 ומאפשרת כניסה של חמצן 4. זה כבר דווח כי תאי הגזע של שקר קרנית אפיתל בנישות או מאורות (עם גדלים של 120-150 מיקרומטר) באזור הפריפריה של הקרנית הידוע בשם 5,6 ימבוס. כתאי הגזע מתחלקים, תאי הבת המכונים גם תאי הגברה חולפים לנסוע אל מחוץ לנישות וכחטיבה ממשיכה התאים לנוע centripetally פנימה וכלפי מעלה וכתוצאה מכך תאי סופני מובחנים באזור קרני המרכזי 7,8. תאים אלה מחו באופן שגרתי כהרף עין האלקטרוניxposing תאים חדשים יותר מתחת 9. בנוסף להיות המיקום של תאי גזע אפיתל, לימבוס גם משחק תפקיד בשמירה על כלי הדם בלחמית מאזור הקרנית 10. נזק לימבוס יכול להיגרם על ידי כוויות תרמיים / כימיות, קרינה וגם מחלות גנטיות 10. כאשר זה קורה, את מחסום ימבוס מתפרק מאפשר לתאי הלחמית להעביר על גבי הקרנית, vascularizing האזור, בגרימת כאב ועיוורון במקרים מסוימים. המצב ידוע כחסר בתאי גזע limbal (LSCD) 10. מצעים טבעיים שונים דווחו כנישאי תאי גזע אפשריים לסיוע בהתחדשות של קרנית. לדוגמא, קרומים המבוסס על קולגן שמשו Dravida et al. 11 וראמה ועמיתים לעבודה 12 דיווחו על השימוש בהפיברין במחקר עם 112 חולים. כיום לעומת זאת השיטה הנפוצה ביותר של טיפולהוא להשתמש בקרום מי שפיר אנושי מבנק רקמות ותאי אפיתל limbal תרבות על פני השטח שלו 13,14. ברגע שmonolayer יצר, הקרום מי השפיר מודבק תא בצד לעלות על הקרנית הפגומה שבה יש את כל תאי הלחמית ורקמת צלקת הוסרו בניתוח ממנו לפני השתלת תאים זה 14. הקרום מי שפיר מדרדרת בתוך שבועות עד חודשים עוזבים את תאי האפיתל שצורפו לאזור הערום להתחדש האפיתל 15,16. טכניקה זו נוסתה בהצלחה בשיקום ראייה עם זאת יש עדיין כמה סוגיות מעשיות המגבילות את הספיגה הנרחבת שלה מבחינה קלינית. כקרום מי השפיר היא רקמה אנושית שהוא צריך לעבור בדיקות סקר באמצעות נהלי בנקאות רקמה טובים לפני שמשמש להשתלת תאים בחולים. הקרנה זה מורידה רק את הסיכון להעברת מחלות, אך לא יכולה לחסל אותו לחלוטין 17. בנוסף לכך היו דיווחים של השתנות בעמ &#39;erformance של הקרום מי השפיר עקב וריאציה בין תורם 18,19 ושיטות עיבוד שונים 19,20. לצד הקטן הסיכון להעברת מחלה יש דרישה למרכזי כירורגיים גישה לבנקי רקמות מנוהלים היטב, אינו זמינים לכל. למרות שהקרום מי השפיר הוא מוצלח יחסית, יש צורך בפיתוח של חלופות חדשות סינתטיות מתכלות תא ספק לטיפול במחלה בקרנית. ספקים סינטטיים יהיו להתגבר על הצורך בבנקאי נהלים כמו גם ביטול הקטן סיכון להעברת מחלה ולהבדלים בין תורם. במובן זה, חומרים כגון 21,22 פוליאתילן גליקול וPLGA 23,24 נחקרו. בפיתוח אלטרנטיבה סינתטית לקרום מי שפיר האדם יש גם האפשרות לעצב לתוכו תכונות רצויות בתקווה לעזור להישרדות של התאים בתרבית. Inclusion של microfeatures בתוך מכשירים ביולוגי לשליטה מסוימת של התנהגות תא הוא אזור מתפתח של עניין. מחברים רבים דיווחו עבודה לקראת הפיתוח של תאי גזע מלאכותיים נישות 25-30. קבוצה זו לאחרונה דיווחה יצירת ימבוס microfabricated PEGDA-biofunctionalized פיברונקטין המלאכותי עבור המשלוח של תאי האפיתל limbal 22 והמתודולוגיה לייצור של ממברנות מתכלות electrospun המכילות כיסי microfabricated לתמיכה של תאי אפיתל limbal יום 31. מטרת עבודה זו היא לפתח טכנולוגיית ייצור חדשה לפיתוח של התקנים ביולוגי המכילים microfeatures המחקה במידה microenvironments בי תאי גזע מתגוררים בגוף. פיתחנו טכניקה המשלבת microstereolithography וelectrospinning המאפשרת הייצור של ממברנות microstructured מתכלות שמראות greaפוטנציאל t עבור יישומי התחדשות רקמות. זה חשוב לשים לב שלמרות שבעבודה זו טכניקה זו הוחל הייצור של טבעות להתחדשות קרנית, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על הייצור של מכשירים להתחדשות של מגוון רחב של רקמות אפיתל, למשל, עור, דרך הפה epithelia רירית, מעי, בדרכי הנשימה, ושלפוחית ​​שתן. באופן ספציפי, במחקר זה פיתחנו קרום מתכלה סינטטי המתפקד באופן דומה לקרום מי השפיר, כדי לספק לתאי הקרנית. קרום זה מכיל micropockets של כ 300 מיקרומטר (גדול יותר ממאורות limbal של Pallisades של וגט (150 סביב מיקרומטר)). לבסוף, הקמנו פרוטוקול אריזה המאפשר הקרומים האלה להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס למשך יותר מ -6 חודשים בלי להראות שום סימנים של התמוטטות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

בעיות בקרנית משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם ולפגום באיכות חיים שלהם באופן משמעותי. מחלה בקרנית יכולה להיגרם על ידי מחלות כגון Aniridia או סטיבן ג&#39;ונסון תסמונת, כמו גם על ידי גורמים חיצוניים כגון כוויות כימיות או הקרנות. טיפולים הנוכחיים (i) השימוש בשתלים בקרנית וכן (ii) השימוש בתאי גזע הרחיבו במעבדה ונמסרו על ספקים (למשל, קרום מי שפיר); טיפולים אלה בהצלחה יחסית, אך למרבה הצער הם יכולים להיכשל לאחר 3-5 שנים. יש צורך לתכנן ולייצר מכשירים בחומר ביולוגי של קרנית חדשים מסוגלים לחקות בפירוט את הסביבה הפיזיולוגית שבו תאי גזע נמצא בקרנית. תאי גזע limbal ממוקמים בימבוס (האזור העגול בין קרנית ולובן עין) בנישות ספציפיות הידועות כPalisades של וגט. בעבודה זו פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית חדשה המשלב את שתי טכניקות ייצור חדשניות (microstereolithography וelectrospinning) עבור הייצור של ממברנות של קרנית המחקות לימבוס במידה מסוימת. ממברנות שלנו מכילות micropockets המלאכותי שמטרתם לספק הגנת תאים כPalisades של וגט לעשות בעין.

טבעות electrospun microfabricated יוצרו באמצעות שילוב של microstereolithography וelectrospinning (איורים 1 ו -2). טבעות PEGDA בגדלים שונים היו מפוברקות באמצעות microstereolithography (איור 3); טכניקה זו מאפשרת למבני הייצור בצו של סנטימטר וההתאגדות בו זמנית של microfeatures. במקרה זה, טבעות של קטרים ​​הנעות 1.2-1.6 סנטימטר המכיל micropockets של 350-500 מיקרומטר היו מפוברקים (איור 4). במונחים של ייצור, עיקור ואריזה של חומרים לשימוש קליני בעתיד נמצא כי אריזות ואקום בשקיות כיתה רפואיות שיפרו את היכולת להשיג אחסון לטווח ארוך של ממברנות PLGA (איור 5) באופן משמעותי; השימוש בשקית כיתה רפואית (PET / לסכל / פוליאתילן) עם עובי של 0.12 מ&quot;מ אפשר לנו להשיג חיי מדף ארוכים יותר. זה נחקר על ידי שליחת membranes למשתפי הפעולה שלנו בהודו וקרומים אוחסנו לתקופה של חודשים ב -20 מעלות צלזיוס, ב RT ועל 37 מעלות צלזיוס בתנאים בכוונה לחים (חממה לחה). איור 5 מראה כי שימוש בתנאים במכוון הפרובוקטיביים של אחסון ב 37 C ° בתנאים לחים, קרומים היו רק יציבים למשך כ 1 חודש תחת שאינו ואקום ארוז תנאים, אך השיגו אחסון 3 חודשים בתנאי ואקום ארוז (איור 5 ובלוח 1). טבלה 1 מדגימה את השיפור בתנאי אחסון שניתן להשיג גם בתנאים שנבחרו להיות תורם לספיגת מים וסיבים תזונתיים נפיחות אם אחד מקדיש תשומת לב לבחירה של תיק משמשת. הטבעות נתמכות תולדת תא מexplants limbal בתנאים שונים (i) טבעות טריות וכן (ii) טבעות מאוחסנים במשך 6 חודשים (איור 6). תא העברה הושגה לאחר 4 שבועות כאשר pl<html> acing קרומי PLGA על מודלים 3D פצועים. תאי צמח מתוך מexplants הרקמה מונח על קרומי יצירת אפיתל חדש על הקרניות הערומות בעבר (איור 7). חיוביות (קרניות ללא כל טיפול) ובקרות שליליות (קרניות פצועים) גם נשמרו בתרבות לתקופות של זמן. הבקרות השליליות אישרו את חוסר ההיווצרות של האפיתל חדש בהעדר כל תאים הוסיפו. Immunocytochemistry הוכיח כי התאים צומחים מתוך מexplants היו תאי האפיתל של קרנית מאז שהיו חיוביים לCK3 סמן בידול הקרנית (איור 7E). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 סכמטי של microstereolithography להגדיר ליצירת טבעות PEGDA. <html> her.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 סכמטי של electrospinning תהליך באמצעות טבעות PEGDA microfabricated כתבניות. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 (א) מראה דוגמא של אספן סטטי (גיליון אלומיניום electroplated עם טבעות PEGDA) לספינינג של קרומי PLGA microfabricated. (B) ו( E) מראה מחצלות electrospun שונות שקלפו מאספני סטטי. מופעים (C) תבניות PEGDA בגדלים שונים המדגישים את הרבגוניות של שימוש microstereolithography עבור הייצור של משטח הבסיס. (D) מראה העתק PLGA microfabricated.&quot;Target =&quot; /files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 תמונת SEM של טבעת PEGDA עם microfeature פרסה (); תמונת SEM הגדלה גבוהה של כיס microfabricated (B). תמונה בניגוד שלב של טבעת PLGA עם microfeature פרסה (ג); תמונה בניגוד שלב הגדלה גבוהה של כיס microfabricated (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /> איור אפקט .5 של טמפרטורה וזמן במערכות אחסון של ואקום ולא ואקום ארוז PLGA (50/50) ממברנות (44 קילוגרם / mol) עם טבעות-מפוברק מיקרו מעל 6 חודשים. יושרת ממברנה, נכבש כסיבים בשלמות באופן מלא (+++), כמה סיבי נפיחות (++), סיבי מיזוג (+) או לא סיבים ללא פגע (-). תמונות SEM ושלושה desiccants (כתום סיליקה, קובלט (II) כלוריד, והנחושת (II) סולפט) לא מראים שינויים בשלמות סיבים או לחות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 תמונות הקרינה מראה תולדה של LEC מexplants limbal על טבעות PLGA מתכלות טריות (A, B) ועל טבעות לאחר אחסון 6 חודשים ב -20מעלות צלזיוס (C, D). תמונות () ו (ב) מתאים לתאים מוכתמים DAPI (כחול) ויודיד propidium (אדום) בהתאמה. תמונה ב הוא נוף מאונך מz-ערימת confocal של explant מונח על כיס microfabricated. תמונות (C) ו( ד &#39;) מראים צביעה חיובית לp63 (ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7 (א) מראה מודל קרנית ארנב פצוע עם explants פיגום ורקמת טבעת נמצא על הפיגום שהיה מצופה בעבר עם דבק הפיברין (ב) ו (ג) הם בקרות חיוביות ושליליות.; הביקורת החיובית היא רב טרי<html> . קרנית t והבקרה השלילית קרנית שבו האפיתל הוסר במכוון (הבקרה השלילית הייתה גם בתרבית למשך 4 שבועות) (ד) היא תמונת H &amp; E של קרנית רקמות מהונדסת לאחר 4 שבועות בתרבות; איור מציג את האפיתל רב שכבתי החדש שהוקם על ידי התאים שיוצאים מexplants מונח על הנישות (E) היא תמונת immunocytochemistry מראה תולדת תא מexplant limbal.; גרעיני מגואלות DAPI (כחולה) והתאים מראה צביעה חיובית לcytokeratin 3, סמן קרנית בידול (ירוקה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td><html> x; &quot;&gt; שלמות סיבים לממברנות המאוחסנות על 37 מעלות צלזיוס לחות </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> יום 0 </td><td style="width:64px;"> חודש 1 </td><td style="width:64px;"> חודש 2 </td><td style="width:64px;"> חודש 3 </td><td style="width:64px;"> חודש 4 </td><td style="width:64px;"> חודש 5 </td><td style="width:64px;"> חודש 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> ללא אבק ארוז </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> עובי בשואב אבק (תיק) (PE, PA Composite): 0.14 מ&quot;מ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> בשואב אבק (תיק B) (PET / לסכל / פוליאתילן) עובי: 0.75 מ&quot;מ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> (50/50) קרומי אפקט .1 טבלה של שקיות ואקום ואחסון שונה בשלמות PLGA (44 קילוגרם / mol) בחן מעל 6 חודשים של אחסון. יושרת ממברנה, נכבש כסיבים בשלמות באופן מלא (+++), קצת נפיחות סיבים (++), מיזוג סיבים (+) או לא סיבים ללא פגע (-).

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration at JoVE.com

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  University of Sheffield.  אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures. 

Video: Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

יסודות Electrospinning: פתרון אופטימיזציה פרמטרים Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

הכנה של ממברנות אור תגובה על ידי הארכת משטח משולבת ותהליך Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

מיזוג קיטוב ריכוז יון בין חופפי Ion Exchange ממברנות כדי לחסום את ההתפשטות של אזור הקיטוב

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...