The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.

بيان الأخلاق: أخلاقيات البحوث لوحات كل من جامعة مانيتوبا ومستشفى كينياتا الوطني / جامعة نيروبي وافقت على هذه الدراسة وتم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من جميع المشاركين في الدراسة. 1. إعداد وسائل الإعلام وأنابيب جمع CMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137.93 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.67 ملي بوكل، 8.1 ملي نا 2 هبو 4، 1.47 ملي KH 2 PO 4). الأوتوكلاف للعقم. هذا ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل قسامة 5 مل PBS في أنبوب 50 مل الصقر (واحد لكل عينة التي سيتم جمعها) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى وقت جمع العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 2-4 cryovials أو 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لكل عينة لجمع غسيل للتخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا سائل الإعلام والثقافة: 1640 RPMI + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الأمفوتريسين B (تركيز النهائي 100 وحدة / مل، 100 ميكروغرام / مل و 250 نانوغرام / مل، respectivوأضاف اعل، مع عدم وجود FCS / FBS. </li></ol> 2. جمع عينات Cytobrush جمع عينات cytobrush هو إجراء غير الغازية التي يجب تنفيذها من قبل MD المدربين أو طبيب نسائي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا وحيدات النوى عنق الرحم (CMC) باستخدام كلا من cytobrush ومكشطة خشبية أو بلاستيكية. جمع CMC من المشارك تحت الفحص عن طريق إدخال منظار مكشطة وتدور حول فوهة عنق الرحم (الشكل 1). إدراج cytobrush في نظام التشغيل وباطن عنق الرحم، وتناوب 360 درجة، ووضع على الفور كلا من cytobrush ومكشطة في أنبوب 50 مل الصقر تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتفاظ بعينات على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة. للحفاظ على بقاء الخلية، وعينات العملية في غضون 2 ساعة من جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ممكنا، وجمع عينات الدم المتطابقة باللون الأخضر أعلى vacutainers الهيبارين لالمحيطية وحيدات النوى الدم الخلية (PBMC) العزلة ليكون بمثابة مقارنة / تحكم لتحليل CMC. </لى&gt; </ol> 3. عزل المجالس البلدية للأطفال أداء تجهيز العينات في المختبر مستوى السلامة الأحيائية 2، في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة مع قفازات مزدوج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال جمع ويمكن عينات CMC تصبح ملوثة بالدماء. استبعاد العينات مع تلوث الدم مرئية من الدراسة من أجل منع إدراج الخلط بين PBMC في العينة النهائية. ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد الخلايا الليمفاوية المعزولة من عينات CMC، يمكن أن تلوث الدم الطفيفة تطغى بسهولة المكون اللمفاويات CMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب دوامة الصقر تحتوي على كلا من cytobrush ومكشطة لمدة 45 ثانية لفصل الخلايا من الفرش. قد تصبح عينات رغوي خلال هذه العملية؛ هذا أمر طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام cytobrush لتتخلص من أي المواد المتبقية قبالة مكشطة، وتجاهل مكشطة في محلول التبييض. لجمع أي الخلايا المتبقية تعلق على فرشاة / مكشطة، واستخدام القفازات جديدة للضغط على مكشطة بين الإبهام والسبابة.تنزلق الفرشاة، والسماح للخلايا وPBS التي سيتم جمعها في نفس أنبوب 50 مل. تجاهل cytobrush في محلول التبييض، وتجاهل القفازات. هام: استخدم قفاز جديد لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب 100 ميكرومتر مصفاة الخلية النايلون لالطازجة أنبوب 50 مل الصقر. باستخدام ماصة نقل، وجمع تعليق PBS خلية من أنبوب العينة وتصفية من خلال مصفاة في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من 1640 RPMI إلى أنبوب العينة الأصلية. باستخدام ماصة نقل، وغسل الجانبين من أنبوب عينة مع RPMI، ونقل من خلال فلتر لأنبوب المجموعة الجديدة. غسل الجزء السفلي من مرشح من النايلون مع RPMI كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 514 ز س. فمن الأهمية بمكان أن يترك الفرامل الطرد المركزي من خلال هذه الخطوة، من أجل منع بإزاحة بيليه CMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة طاف من الأنبوب، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. سوف حجم بيليه تكون متغيرة بصورة كبيرة؛ في ذلكلي العينات، بيليه هو كبير جدا بسبب وجود أعداد كبيرة من الخلايا الظهارية، بينما في حالات أخرى، بيليه هو بالكاد مرئية وشفافة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية التي كتبها الإثارة لطيف من الأنبوب الصقر. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 514 x ج مع عدم وجود الفرامل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بعناية طاف واعادة تعليق بيليه على النحو الوارد أعلاه. الخلايا مستعدون لأي الحفظ بالتبريد (باستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد PBMC)، والتحفيز أو التدفق الخلوي phenotyping. </li></ol> 4. CMC تلطيخ السطح والتدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية من الخطوة 3.10 في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل ونقل إما في لوحة 96 جيدا أو أنبوب FACS. عرقلة الحل (لمنع المستقبلات Fcγ) هو وصفة على النحو التالي: 1.8 ميكرولتر مفتش الماوس (تركيز النهائي 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر FBS و93.2 ميكرولتر FACS غسل (PBS +2٪ FBS).تلطيخ لا يمكن أن يؤديها في 96 لوحة جيدا إذا أحجام بيليه صغيرة بما فيه الكفاية، ولكن قد تحتاج إلى القيام بها في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية إذا الكريات كبيرة بشكل روتيني. من المهم أن يعاير الأجسام المضادة وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع عينات لمدة 10 دقيقة على الجليد / في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من FACS غسل (PBS +2٪ FBS) في لوحات 96 جيدا أو 500 ميكرولتر في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل على انخفاض (أو إيقاف تشغيله، وإذا كان إعداد الفرامل منخفضة غير متوفرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف واعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق التحريض. إضافة وصمة عار الجدوى (لايف الميت قابل للتثبيت الجدوى صبغة). إعداد الجدوى صبغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قد تحتاج إلى معاير للاستخدام في كل الإعداد مختبر / عداد الكريات. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا μl/500 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (لمدة 96 لوحة جيدا أنابيب / نظام مراقبة الأصول الميدانية). أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة مع انخفاض / لا الفرامل. إزالة supernatanر وResuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة علامة السطح، في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. هام: تحسين ويعاير كل التدفق الخلوي لوحة قبل عينة تلطيخ. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.5. إذا تلطيخ في 96 لوحة جيدا، وخلايا نقل إلى أنبوب FACS وتضعف إلى الحجم النهائي من 750 ميكرولتر من FACS غسل تحتوي على 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) (أو CytoFix، المخفف في 1 4). انتقل إلى الحصول على البيانات على عداد الكريات التدفق. </li></ol> 5. جمع وإعداد عنق الرحم المهبلي الغسل (CVL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل cytobrush أخذ العينات، واستخدام حقنة لغسل باطن عنق الرحم مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح غسيل من القبو الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العينة غسيل يستنشق في أنبوب 15 مل الصقر والحفاظ على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 7 دقائق لإزالة الحطام الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاركllect طاف، قسامة العينة في 1 مل أو 500 ميكرولتر مأخوذة، وتخزينها في -70 درجة مئوية. مأخوذة يمكن إذابة لELISA أو تحليل مجموعة من البروتينات حبة CVL، ولكن تجنب متعددة دورات تجميد / الذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، resuspend الكرية من الحطام الخلوية في وقت لاحق لقياس الحمض النووي الريبي RNA التعبير باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. </li></ol> 6. الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة من أنابيب التعويض الذي يطابق لوحة الأجسام المضادة. تشغيل أنابيب تعويضات لضبط التداخل الطيفي. تشغيل العينات على أي تدفق عداد الكريات متعدد الألوان الذي تم تكوينه لاستخدام الأجسام المضادة مترافق تألقي في لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينة PBMC الأولى لضبط الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الجهد من أجل الكشف عن السكان لمفاوية. محاولة الاحتفاظ بها في كل محور على 100 على نطاق والخطية. وسوف يعمل على التحكم PBMC جعله أسهل بكثير للعثور على السكان لمفاوية CMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عتبة FSC لعينات CMC قد تحتاج إلى زيادة النسبي لعينات PBMC بسبب تشويه يصل محور SSC في القيم FSC منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة كل أنبوب قبل الحصول. الحصول على أنبوب بأكمله إلى زيادة عدد الأحداث بوابة اللمفاويات التي تم جمعها. رصد الجهاز بعناية لتجنب انسداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات إلى برنامج تحليل تدفق cytometric مثل FlowJo. </li></ol> 7. استراتيجية المحاصرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد إعادة توجيه الجانب مبعثر عالية (FSC-H) / الى الامام منطقة الجانب مبعثر (FSC-A) لتحديد السكان القميص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التوقيت مقابل علامة نيون (كمثال FITC) للسيطرة على جودة عملية الاستحواذ. التغير في معدل التدفق قد يعرض القطع الأثرية في البيانات. استبعاد أي منطقة يظهر التباين في معدل التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد السكان اللمفاويات على SSC-A/FSC-A المؤامرة. استخدام عنصر تحكم PBMC لتسهيل تحديد الهوية. لاحظ أن السكان اللمفاويات CMC قد لا تكون واضحة مثل السيطرة PBMC &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> البوابة على SSC-A/viability صبغ لاستبعاد الخلايا الميتة من خلايا حية. الخلايا الميتة يمكن أن تتضمن على وجه التحديد غير الأجسام المضادة، والتي سوف أعرض التحف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البوابة على SSC-A/CD3 لتحديد السكان الخلايا التائية. من هذه البوابة، وتحديد السكان CD4 + و CD8 +. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNAIDS.+Global+Report+2013.">UNAIDS. Global Report 2013.</a> http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+anti-HIV+immune+responses+in+the+female+reproductive+tract.">Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract.</a> Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).</li><li>Douek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+disease+progression:+immune+activation,+microbes,+and+a+leaky+gut.">HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut.</a> Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).</li><li>Hofer, U., Speck, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance+of+the+gut-associated+lymphoid+tissue+is+associated+with+disease+progression+in+chronic+HIV+infection.">Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection.</a> Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).</li><li>Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+in+the+female+genital+tract:+discrete+influence+of+the+local+mucosal+microenvironment.">HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment.</a> American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).</li><li>Hladik, F., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+of+the+genital+mucosa+in+women.">HIV infection of the genital mucosa in women.</a> Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).</li><li>Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+induces+leukocyte+recruitment+and+cytokine+and+chemokine+mRNA+expression+in+the+human+cervix+after+coitus.">Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus.</a> Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).</li><li>St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+activation+and+maturation+induced+by+mucosal+fluid+from+women+with+bacterial+vaginosis.">Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis.</a> Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).</li><li>Liebenberg, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+transport+of+cervical+cytobrushes+for+isolation+of+mononuclear+cells+from+the+female+genital+tract.">Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract.</a> Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).</li><li>Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+distribution+of+HIV-binding+CCR5+and+C-type+lectin+receptors+in+the+human+endocervical+mucosa.">In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa.</a> PloS one. 6, (2011).</li><li>Hasselrot, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+and+safety+of+cervical+biopsy+sampling+for+mucosal+immune+studies+in+female+sex+workers+from+Nairobi,+Kenya.">Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials:+an+international+multi-site+study.">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Lajoie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+cytokine+and+chemokine+profile+at+the+genital+mucosa+is+associated+with+HIV-1+protection+among+HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers.">A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers.</a> Mucosal immunology. 5, (2012).</li><li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Proteomic+Study+Identifies+Serpin+and+Cystatin+Antiproteases+as+Novel+Correlates+of+HIV-1+Resistance+in+the+Cervicovaginal+Mucosa+of+Female+Sex+Workers.">Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers.</a> Journal of proteome research. 10, (2011).</li><li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+examination+of+the+human+female+genital+tract+shows+compartmentalization+of+immune+factor+expression.">A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression.</a> Journal of virology. 87, (2013).</li><li>Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+T+cell+responses+detected+in+the+genital+tract+of+chronically+HIV-infected+women+are+largely+monofunctional.">HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional.</a> Immunology. 139, (2013).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Human+Cervical+CD4++T+Cell+Subset+Coexpressing+Multiple+Markers+of+HIV+Susceptibility.">Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility.</a> Journal of immunology. , (2011).</li><li>Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyclonal+expansion+of+cervical+cytobrush-derived+T+cells+to+investigate+HIV-specific+responses+in+the+female+genital+tract.">Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract.</a> Immunology. 130, 23-33 (2010).</li><li>Iqbal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+T+cell+counts+and+RANTES+expression+in+the+genital+mucosa+of+HIV-1-resistant+Kenyan+commercial+sex+workers.">Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers.</a> The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).</li><li>Hirbod, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+CD4+expression+and+local+immune+activation+in+the+ectocervical+mucosa+of+HIV-infected+women.">Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women.</a> Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).</li><li>Horton, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+gene+expression+patterns+and+cell+phenotypes+between+cervical+and+peripheral+blood+mononuclear+cells.">A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Begaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+CD4+T+cell+activation+and+in+vitro+susceptibility+to+HIV-1+infection+in+exposed+uninfected+Central+Africans.">Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans.</a> Retrovirology. 3, 35 (2006).</li><li>McLaren, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers+show+a+quiescent+phenotype+in+the+CD4++T+cell+compartment+and+reduced+expression+of+HIV-dependent+host+factors.">HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors.</a> The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).</li><li>Card, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Cellular+Susceptibility+to+In+Vitro+HIV+Infection+Is+Associated+with+CD4T+Cell+Quiescence.">Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Prodger, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreskin+T-cell+subsets+differ+substantially+from+blood+with+respect+to+HIV+co-receptor+expression,+inflammatory+profile,+and+memory+status.">Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status.</a> Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).</li><li>Reusch, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopy+and+ultrasound+imaging+of+human+cervical+structure.">Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure.</a> Journal of biomedical optics. 18, (2013).</li><li>Oertelt-Prigione, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+the+menstrual+cycle.">Immunology and the menstrual cycle.</a> Autoimmunity reviews. 11, (2012).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+serpin+A1+and+A3+levels+in+HIV+highly+exposed+sero-negative+women+are+affected+by+the+menstrual+cycle+and+hormonal+contraceptives+but+are+independent+of+epidemiological+confounders.">Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders.</a> American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نظرا للفجوات كبيرة في المعرفة فيما يتعلق بالحصانة في المسالك التناسلية للإناث (FGT)، ويمكن تحليل المظهري من المجالس البلدية للأطفال توفر مجموعة واسعة من نظرة ثاقبة السكان اللمفاويات متعددة في عنق الرحم. إلى جانب تحليل البروتين والقياسات الحمل الفيروسي في غسل عنق الر?...

غالبية الإصابات الجديدة بفيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم من خلال نقل تنشأ الغيرية، وتمثل النساء 47٪ من الإصابات الجديدة في عام 2011 (برنامج الأمم المتحدة المشترك 1). فهم المسالك التناسلية للإناث (FGT)، واحدة من بوابات الدخول الرئيسية لفيروس نقص المناعة البشرية وغيره من مسببات الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي، له أهمية كبيرة على طريق إيجاد استراتيجيات فعالة لمنع العدوى. الاستجابات المناعية في الغشاء المخاطي التناسلية بشكل واضح فريدة من نوعها وتختلف عن تلك التي قيست في الدم المحيطي 2. ومع ذلك، والمعرفة الحالية لديناميات المناعة في FGT يقتصر في أحسن الأحوال. حتى الآن، ركزت دراسات البيئة المناعة المخاطية إلى حد كبير على الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (GALT)، حيث أصبح من الواضح أن الأحداث في وقت مبكر من الأنسجة المخاطية بعد الإصابة يكون لها تأثير قوي على تطور المرض لاحقا 3،4. جمع عينات من الغشاء المخاطي التناسلية يمثل تحديا كبيرا، وهي مسؤولة جزئيا على الأقل في أمريكا اللاتينية والكاريبيك من فهم علم المناعة من FGT. حل اللغز من ديناميكية المناعة بين المضيف والممرض في سياق البيئة المتميزة التي هو FGT يتطلب أساليب فعالة لجمع وتحليل عينات من هذه اللغة. ينقسم FGT إلى قسمين: الجهاز التناسلي العلوي الذي يتضمن أنابيب فالوب، بطانة الرحم وباطن عنق الرحم، والجهاز الذي يحتوي على أقل الجزء المهبلي من العنق والمهبل (استعرضها Kaushic آخرون 5). فإنه لا يزال من غير الواضح ما المساهمة النسبية لهذه المواقع المختلفة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، ولكن يعتقد أن كلا الموقعين يمكن أن تسهم في إدخال فيروس نقص المناعة البشرية 6. خلايا T تمثل 40-50٪ من كريات الدم البيضاء في مساحات الإنجابية العلوي والسفلي، في حين تضم ما يقرب من 10٪ الضامة (إعادة النظر في رودريغيز غارسيا، وآخرون 2). ويمكن الكشف عن خلايا T في المهبل وعنق الرحم وبطانة الرحم و. الضامة هي أكثر locali بقوةزد في بطانة الرحم والنسيج الضام عضلة الرحم من عنق الرحم، على الرغم من أنها يمكن أن يتم الكشف عن في كل الأنسجة. أخيرا، الخلايا الجذعية بلازماوية (pDCs) وخلايا لانغرهانس يمكن أيضا أن يتم الكشف عن FGT في الأنسجة. النمط الظاهري ونسب السكان المناعة، وقابليتها للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية قد تختلف الأهم وفقا لدورات الهرمونية، واستخدام وسائل منع الحمل الهرمونية، التهاب المهبل الجرثومي أو أنشطة جنسية 5،7-9. وقد تم تطوير أساليب متنوعة لدراسة السكان والبيئة المناعي من FGT. خزعة عنق الرحم، وعنق الرحم وcytobrushes lavages العنقية المهبلية (CVL) 10-12 هي الأكثر استخداما عبر الأدب. جمع CVL بواسطة PBS غسل هو أبسط طريقة ويسمح دراسة البروتينات المناعية تغييري ولكن النتائج في العائد خلية منخفضة للغاية، وبالتالي فهي ليست مناسبة لدراسة السكان الخلايا المناعية من FGT 13. عينات CVL هي، من ناحية أخرى، والخامسريها مفيدة لتقييم البيئة المناعي للFGT عن طريق قياس التعبير عن مختلف السيتوكينات، كيموكينات أو عوامل مضادة للميكروبات باستخدام أساليب مثل ELISA، خلوى حبة مجموعة 14 أو قياس الطيف الكتلي 15،16. لا يمكن أن يتحقق توصيف الترددات الخلايا المناعية، والظواهر وظائف الخلايا وحيدات النوى من خلال جمع عنق الرحم (CMC) من خلال عنق الرحم cytobrush أو عنق الرحم أخذ عينات الخزعة. عنق الرحم أخذ عينات الخزعة هو أسلوب الغازية التي تزيد من مشقة وخطر النزيف ويأخذ 2-11 أيام للشفاء بعد إجراء اعتمادا على الوضع المناعي للمرأة 12. من ناحية أخرى، cytobrushes عنق الرحم، على الرغم من انخفاض العائد من الخلايا التي تم جمعها، هو وسيلة أقل الغازية وأكثر ملاءمة لجمع الخلايا المناعية من FGT. كلتا الطريقتين يمكن الوصول إلى نفس العائد من كريات الدم البيضاء CD45 +، ولكن اثنين cytobrushes عنق الرحم متتابعة ضرورية للحصول على نفس الكمية من الخلايا الموجودة طن واحد خزعة 13. مع ذلك، وأخذ العينات cytobrush لا يزال يوفر عددا مقبولا من خلايا (CD45 + حوالي 5،000 خلية / cytobrush) لمزيد من فيفو السابقين phenotyping بواسطة التدفق الخلوي 14. أيضا، وتوصيف وظيفي يمكن القيام بها على هذه العينات، حيث تم تنفيذ التحفيز وتدفق الخلايا الخلوي أو باستخدام QPCR المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush لتحديد الاستجابات المناعية فيروس نقص المناعة البشرية محددة 17 أو الاستقطاب الخلية ال 18. قد توسع من السكان الخلايا التائية أيضا تسهيل الدراسات الفنية مع المجالس البلدية للأطفال 19. من المهم أن نلاحظ أن الخزعات وcytobrushes عينة أجزاء متميزة من FGT. وتستمد الخزعات من الجزء العلوي للظهارة وسدى من الجزء المهبلي من العنق 12،13، في حين cytobrushes عنق الرحم أخذ عينات من فوهة عنق الرحم، وجمع الخلايا المشتقة من ظهارة باطن عنق الرحم ويفترض أن منطقة التحول. لذا عينات عينة Cytobrush إعادةجيون تتألف من طبقة واحدة من ظهارة عمودية، في حين الخزعات، وتشمل منطقة مبطنة من قبل ظهارة الحرشفية الطبقية 5. ونتيجة لذلك، فإن طبيعة السكان الكرية البيضاء التي جمعتها خزعة عنق الرحم وcytobrush يختلف. الخزعات جمع نسبة أعلى من الخلايا CD3 + T، في حين cytobrushes يؤدي إلى مجموعة من نسبة أعلى من حيدات CD14 + / 13 الضامة. وكانت دراسة علم المناعة من FGT مصلحة لسنوات عديدة 20-22 وتراكمت لدينا قدرا كبيرا من الخبرة مع دراسة المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush. تركز دراساتنا في الغالب على دراسة المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وغير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تتعرض سلبيين (الحصن) عاملات الجنس من نيروبي، كينيا. فيروس نقص المناعة البشرية يعيد تفضيلي في تنشيط خلايا تي 23 وانخفاض أعداد خلايا تنشيط التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل فيروس نقص المناعة البشرية في FGT يمكن أن تسهم في الحماية من فيروس نقص المناعة البشرية الاستحواذ. تمشيا مع هذه الفرضية، عدة ستوديوقد وصفت وفاق تنشيط جهاز المناعة أقل بين العاملات في تجارة الجنس الحصن الذين يتعرضون للغاية لفيروس نقص المناعة البشرية لا تزال حتى الآن غير مصاب 24،25، ويلاحظ هذا النمط الظاهري هادئة أيضا في FGT 14. هنا، نحن تصف منهجية لمعالجة وتقييم تفعيل الخلايا التائية في عينات CMC المستمدة من cytobrushes عنق الرحم بواسطة فيفو السابقين التدفق الخلوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:205px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:136px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">352360</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:136px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30027.01</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fetal Bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Life technology</td>
			<td style="width:133px;">16000044</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fungizone</td>
			<td style="width:136px;">Life technology</td>
			<td style="width:133px;">15290-018</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P4333-20ml</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">50ml Falcon tube</td>
			<td style="width:136px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">14-959-49A</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Blood Bank disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:136px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:133px;">13-711-6M</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cytobrush plus</td>
			<td style="width:136px;">Cooper surgical</td>
			<td style="width:133px;">C0121</td>
			<td>CMC sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable cervical scraper</td>
			<td style="width:136px;">Quick medical</td>
			<td style="width:133px;">2183</td>
			<td>CMC sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">15 ml Falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:133px;">14-959-70c</td>
			<td>CVL processsing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">1.5ml tube ependroff</td>
			<td style="width:136px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">05-402-18</td>
			<td>CVL storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td>Flow cytometry reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer (4% PFA)</td>
			<td style="width:136px;">BD</td>
			<td>554655</td>
			<td>Flow cytometry regeant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">IgG mouse&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">I8765</td>
			<td>Flow cytometry regeant&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

التدفق الخلوي Multiparameter هو أداة قوية لتشريح الظواهر وظائف فرعية الخلايا في الأنسجة uncharacterized سابقا. تحليل عينات CMC يمكن أن تسفر عن معلومات عن كل من اللمفاويات والوحيدات السكان مع استراتيجيات النابضة المناسبة. ممثل استراتيجية الناب?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples at JoVE.com

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

collection-isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical

Research

JoVE Journal

Medicine

19.0K Views.  University of Manitoba. The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays. 

Video: Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

بروتوكول لجمع البنكرياس الإنسان

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both with and without preexisting conditions. Rapid processing of these samples is essential to avoid degradation of key cellular components. Included here are methods for simultaneous peripheral blood mononuclear cell (PBMC), DNA, RNA and serum isolation from a single blood draw performed in the homes of consenting participants across a metropolitan area, with processing initiated within 2 hr of collection. We have used these techniques to process over 1,600 blood specimens yielding consistent, high quality material, which has subsequently been used in successful DNA methylation, genotyping, gene expression and flow cytometry analyses. Some of the methods employed are standard; however, when combined in the described manner, they enable efficient processing of samples from participants of population- and/or community-based studies who would not normally be evaluated in a clinical setting. Therefore, this protocol has the potential to obtain samples (and subsequently data) that are more representative of the general population.

We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.

التقطير السريع وعزل مكونات الدم الكامل في عينات تم الحصول عليها من إعداد المجتمعية

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the body&#39;s circulatory system demands a reliable and multiparametric approach that evaluates the possible hematologic complications caused by these devices (i.e., activation and destruction of blood components). Comprehensive in vitro hemocompatibility testing of blood-contacting implants is the first step towards successful in vivo implementation. Therefore, extensive analysis according to the International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) is mandatory prior to clinical application. The presented flow loop describes a sensitive model to analyze the hemostatic performance of stents (in this case, neurovascular) and reveal adverse effects. The use of fresh human whole blood and gentle blood sampling are essential to avoid the preactivation of blood. The blood is perfused through a heparinized tubing containing the test specimen by using a peristaltic pump at a rate of 150 mL/min at 37 &#176;C for 60 min. Before and after perfusion, hematologic markers (i.e., blood cell count, hemoglobin, hematocrit, and plasmatic markers) indicating the activation of leukocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), platelets (&#946;-thromboglobulin [&#946;-TG]), the coagulation system (thombin-antithrombin III [TAT]), and the complement cascade (SC5b-9) are analyzed. In conclusion, we present an essential and reliable model for extensive hemocompatibility testing of stents and other blood-contacting devices prior to clinical application.

This protocol describes a comprehensive hemocompatibility evaluation of blood-contacting devices using laser-cut neurovascular implants. A flow loop model with fresh, heparinized human blood is applied to mimic blood flow. After perfusion, various hematologic markers are analyzed and compared to the values gained directly after blood collection for hemocompatibility evaluation of the tested devices.

اختبار توافق الدم من زرع الدم الاتصال في نموذج حلقة تدفق محاكاة تدفق الدم البشري

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

لوحة LC-MS/MS المعتمدة لقياس 11 دواءً مقاومًا للأدوية في عينات الشعر الصغيرة

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...